雙峰駝β-NGF基因的克隆及在生殖軸系的表達

王 杰，王 琪，張 勇，南京宏，成力童，趙興緒*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省動物生殖生理及繁殖調(diào)控重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

雙峰駝(camelus bactrianus)是我國重要的優(yōu)勢畜種資源，具有十分重要的經(jīng)濟和科研價值。由于其具有獨特的生殖生理特性，它們對極其嚴(yán)酷的荒漠環(huán)境具有很強的適應(yīng)能力。近40年來，雙峰駝的存欄數(shù)量急劇下降，究其原因，除養(yǎng)駝業(yè)經(jīng)濟效益低和草場退化外，其最主要的原因是雙峰駝繁殖性能低，生長速度緩慢，而且是嚴(yán)格的季節(jié)性發(fā)情和誘導(dǎo)排卵型動物。

研究發(fā)現(xiàn)，公駝的精清中存在 “誘導(dǎo)排卵因子”(ovulation inducing factor,OIF)[1]。據(jù)報道，推測OIF是通過子宮內(nèi)膜吸收，通過血液循環(huán)刺激下丘腦和垂體分泌LH，進而促使卵泡破裂而排卵[2]。同時，研究還發(fā)現(xiàn)OIF是一種神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)，對哺乳動物卵泡發(fā)育、誘導(dǎo)排卵等方面有重要作用[3]。其中NGF包含了α、β和 γ 3個亞單位，活性區(qū)是β亞單位，由2個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結(jié)合而成的二聚體。有人通過X衍射技術(shù)，檢測到這種OIF是一種β型神經(jīng)生長因子(β-NGF)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，β-NGF大量存在于在小鼠肉瘤[5]、蛇毒[6]和小鼠唾液腺中[7]。β-NGF已被證明在多種非神經(jīng)元系統(tǒng)中發(fā)揮作用，如免疫[8]、炎癥[9]、生殖[10]和內(nèi)皮組織中[11]。NGF被認(rèn)為是生殖系統(tǒng)不同發(fā)育階段的局部中介[7]。NGF敲除的幼鼠，初級和次級卵泡數(shù)量均低于野生型小鼠[11]，說明NGF信號系統(tǒng)在胎兒卵巢發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。

本試驗以雙峰駝為研究對象，首先對β-NGF基因進行克隆和生物信息學(xué)分析，再通過免疫組織化學(xué)染色、qRT-PCR、免疫印跡技術(shù)檢測β-NGF在雙峰駝生殖軸系的表達，為深入研究雙峰駝的繁殖及生殖調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品選用張掖市雌性駱駝3峰(5～6歲)，屠宰后取下丘腦、垂體、卵巢、子宮角和輸卵管5種組織，部分投入液氮中保存，之后轉(zhuǎn)入-80℃長期保存待用，取另一部分組織于10% 甲醛溶液固定備用。

1.2 主要儀器與試劑PCR儀(Applied Biosystems Veriti96 well，美國)，離心機(Eppendorf Centrifuge 5424，德國)，移液器(Eppendorf，德國)，水浴鍋(Boekl HOTTUB，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(Pland CA91786，美國)，電子天平(FA2004C，中國)，垂直超凈工作臺(AV-100，西班牙)，分析天平(GB303，中國)，超純水儀(AFZ-0502-U，中國)。

TransZol UP RNA提取試劑盒(Code：ET111)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;TranStart Tip Green qPCR SuperMix(Code：AQ101-01)、焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate，DEPC)(Code：R00-22)、蛋白裂解液RIPA(Code：P0013)、PMSF購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS、PAGE、Blue PlusⅡ Protein Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光液購自蘇州新賽美生物科技有限公司；兔抗β-NGF(Code:BA10611)、羊抗兔IgG (Code:Bs-0295G-HRP)、DAB (3,3N-diaminobenzidine)顯色試劑盒和免疫組化試劑盒(Code:SP-0022)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中雙峰駝β-NGFCDS區(qū)，通過NCBI Primer-BLAST設(shè)計引物，引物由西安擎科生物公司進行合成。引物序列如下表1。

表1 目的基因及內(nèi)參基因引物序列

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成將雙峰駝心臟、下丘腦、垂體、卵巢、子宮角和輸卵管等組織置于預(yù)冷的研缽中，加入適量的液氮充分磨后，根據(jù)TransZol UP RNA試劑盒操作說明提取雙峰駝各組織總RNA。每個樣品取1 μL Total RNA，用超微量分光光度計(Pultton P200，美國)測定質(zhì)量濃度。根據(jù)測定結(jié)果，統(tǒng)一將其質(zhì)量濃度調(diào)至300～1 000 mg/L。按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit操作說明中的兩步法進行第1鏈cDNA合成，產(chǎn)物于-20℃短期保存，于-80℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雙峰駝β-NGF基因的測序與分子特征分析

1.5.1基因克隆 以雙峰駝心臟cDNA 為模板，用引物β-NGF-2進行PCR擴增，將獲得的產(chǎn)物按照Gel Extraction Kit試劑盒操作說明處理后，將回收后的產(chǎn)物送至西安擎科生物公司測序。

1.5.2分子特征分析 將擴增的PCR產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳及膠回收測序后，利用DNAMAN分析雙峰駝β-NGF基因同源性；利用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)進化樹；利用在線軟件ExPASy Protparam (https://web.expasy.org/protparam)分析理化性質(zhì)；利用PSIPRED在線軟件(http:bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預(yù)測β-NGF蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用軟件 SWISS-MODEL (https://swissmodel.ex-pasy.org)預(yù)測β-NGF蛋白三級結(jié)構(gòu)；利用在線軟件Prots Cale (https://web.expasy.org/protscale)分析蛋白親疏水性；利用在線軟件TMHMMServer V2.0 (http:www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測蛋白跨膜區(qū)域；利用在線軟件Netphos預(yù)測磷酸化位點(http:www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)。

1.6 β-NGF蛋白在雙峰駝精清和精漿的含量利用假陰道法，從成熟的雄性雙峰駝(5～7歲)采精2～3次，采集的精液以1 500×g離心30 min，分別得到精清(無精子)和精漿(大量精子)，將精清和精漿分別與上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min變性后，-20℃ 保存待用。分別取30～40 μg總蛋白，12% SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加兔抗一抗β-NGF(博士德，1∶1 000，中國)和兔抗GAPDH(武漢三鷹，1∶5 000，中國)，4℃孵育過夜，洗膜3次，每次5 min，加羊抗兔二抗(博奧森，1∶5 000，中國)，37℃孵育2 h，洗膜3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光法ECL顯影。

1.7 免疫組織化學(xué)染色10%甲醛溶液中固定的組織經(jīng)常規(guī)方法制作石蠟切片，37℃烤片2～4 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)；3%H2O2室溫孵育以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶；PBS沖洗后，封閉液室溫封閉30 min；去除封閉液，分別滴加兔源β-NGF一抗(博士德，1∶50，中國)， 4℃孵育過夜；滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加SABC，37℃孵育20 min；DAB顯色后終止；蘇木素復(fù)染后，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗30 min藍化，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察拍照，每個組織取3張切片，每張切片隨機選取5個視野。

1.8 qRT-PCR檢測雙峰駝β-NGFmRNA的表達以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，通過實時熒光定量PCR對β-NGF和GAPDH基因mRNA表達水平檢測。其反應(yīng)體系為20 μL：2×TranStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，F(xiàn)ree water 7 μL。擴增程序采用三步法：94℃ 30 s，94℃ 5 s，56℃ 15 s，72℃ 10 s；共42個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后觀察擴增曲線和溶解曲線，采集Ct值。采用2-△△Ct方法計算出β-NGF基因相對表達量，并用SPASS 26.0軟件分析表達差異性。

1.9 Western blot檢測β-NGF蛋白的表達將保存于-80℃冰箱的下丘腦、垂體、卵巢、子宮角和輸卵管等組織樣品經(jīng)液氮研磨成粉末，稱取0.1 g并加入裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF)，用勻漿器低速勻漿30 s，冰上裂解3 h，15 000 r/min離心5 min后吸取上清，蛋白于-80℃冰箱保存。使用Branford蛋白定量試劑盒測定其總質(zhì)量濃度。將待測蛋白與上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min 變性后，-20℃ 保存待用。每組取30～40 μg總蛋白，12% SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加兔抗β-NGF(博士德，1∶1 000，中國)和兔抗GAPDH(博士德，1∶5 000，中國)一抗，4℃孵育過夜，洗膜3次，每次5 min，加羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育2 h，洗膜3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光法ECL顯影。利用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描測定條帶的灰度值，并用SPASS 26.0軟件分析表達差異性。

2 結(jié)果

2.1 雙峰駝β-NGF基因的克隆用引物β-NGF-2進行CDS區(qū)的擴增，利用1%的凝膠電泳檢測其產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期的雙峰駝β-NGF基因的大小一致(783 bp)。

M．DL2000 DNA Marker；1.雙峰駝β-NGF基因擴增產(chǎn)物

2.2 基因的分子特征分析

2.2.1理化性質(zhì)分析 雙峰駝β-NGF蛋白的氨基酸殘基數(shù)為261個，其中脯氨酸(Pro)含量最高為12.3%，天冬酰胺(Asn)含量最低為0.4%。分子式為C1219H1914N402O365S11，原子總數(shù)為3 911，理論等電點(PI)為9.57，相對分子質(zhì)量為28.393 74 kDa。Protscale軟件預(yù)測顯示，該蛋白為水溶性蛋白，但其在第 28～33、70～79、94～103、109～119、120～126、158～166、182～189、203～212、213～219和220～226處有較高的峰(圖2A)，說明其具有一定的疏水性。TMHMM Server V 2.0預(yù)測顯示：該蛋白不存在跨膜區(qū)域(圖2B)，提示該蛋白在細胞內(nèi)發(fā)揮作用。PSORT2 prediction預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白主要分布于細胞核、線粒體和細胞質(zhì)，含量分別為73.9%，13.0%和13.0%(圖2C)。Net-Phos 3.1 Serve 預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白有22個絲氨酸(Ser)磷酸化位點，11個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點;2個酪氨酸(Thr)磷酸化位點(圖2D)。

A．β-NGF蛋白的疏水性預(yù)測；B．β-NGF蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測；C．β-NGF蛋白在細胞中的分布；D．β-NGF蛋白磷酸化位點預(yù)測

2.2.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 ExPASy-Protparam 軟件預(yù)測結(jié)果顯示，不同類型的氨基酸含量如圖3A所示，GOR Ⅳ軟件預(yù)測顯示，該蛋白由α-螺旋17個(6.51%)；延伸鏈43個(16.48%)；無規(guī)則卷曲201個(77.01%)構(gòu)成。Phyre2 軟件預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白具有三級結(jié)構(gòu)(圖3C)，且與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相符。

A．氨基酸數(shù)量；B．二級結(jié)構(gòu)；C．三級結(jié)構(gòu)(a.α-螺旋;b.延伸鏈;c.無規(guī)則卷曲)

2.3 同源性分析將雙峰駝β-NGF核苷酸序列與單峰駝(Camelusdromedarius)、羊駝(Vicugnapacos)、野豬(Susscrofa)、山羊(Caprahircus)、馬(Equuscaballus)、黃牛(Bostaurus)、人(Homosapiens)、犬(Canislupusfamiliaris)、家鼠(Musmusculus)及家兔(Oryctolaguscuniculus)的β-NGF核苷酸序列進行同源對比，同源性依次為99.6%，99.0%，92.8%，92.6%，91.7%，91.0%，89.5%，89.1%，84.4%和83.7%。利用MEGA7.0軟件制作系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示雙峰駝β-NGF與單峰駝的進化水平較近，與家兔的進化水平較遠(圖4)。

圖4 β-NGF 基因系統(tǒng)進化樹

2.4 β-NGF蛋白在雙峰駝精清和精漿中的表達利用Western blot檢測雙峰駝精清和精漿中β-NGF蛋白的含量，結(jié)果顯示：β-NGF蛋白在精清和精漿中均有表達(圖5B)，但精清中β-NGF的含量極顯著高于精漿，含量約為精漿的5.5倍(圖5A)。

A．Western blot檢測蛋白水平(1～2.精清；3～4.精漿)；B．積分光密度值分析

2.5 免疫組織化學(xué)檢測β-NGF蛋白在雙峰駝不同組織的分布免疫組化結(jié)果顯示：在雙峰駝下丘腦、垂體、卵巢、子宮角和輸卵管中均有β-NGF蛋白的陽性表達。下丘腦中主要表達于下丘腦細胞，垂體中主要表達于嗜色細胞和嫌色細胞，卵巢中主要表達于顆粒細胞、膜細胞和間質(zhì)細胞，子宮角中主要表達于子宮皺褶的肌細胞及子宮腺上皮細胞，在輸卵管中主要表達于黏膜上皮細胞。

2.6β-NGF基因在雙峰駝各組織中的表達分析通過qRT-PCR，以內(nèi)參基因GAPDH對雙峰駝不同組織β-NGF表達量進行校正，以下丘腦組織為對照組，以檢測雙峰駝下丘腦、垂體、卵巢、子宮角、輸卵管中β-NGF的mRNA表達量。結(jié)果顯示，β-NGF的mRNA在下丘腦、垂體、卵巢、子宮角和輸卵管中均有表達，β-NGF在子宮角中表達量最高，且極顯著高于其他組織(P<0.01)，表達水平由高到低依次是子宮角、卵巢、垂體、下丘腦和輸卵管(圖6,7)。

圖6 β-NGF蛋白在雙峰駝下丘腦-垂體-生殖軸系中的分布

圖7 qRT-PCR 檢測雙峰駝不同組織β-NGF mRNA 的相對表達

2.7 β-NGF蛋白在雙峰駝各組織中的表達分析以GAPDH為內(nèi)參,下丘腦組織為對照組，利用Western blot檢測雙峰駝下丘腦、垂體、卵巢、子宮角、輸卵管中β-NGF蛋白的表達水平，結(jié)果顯示：β-NGF 蛋白在被檢測的所有組織中均有表達，且表達量存在差異(圖8A)，利用Image Pro Plus 6.0和SPASS 26.0軟件對其結(jié)果進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，β-NGF蛋白在子宮角中表達量最高，且極顯著高于下丘腦和輸卵管(P<0.01)，顯著高于垂體(P<0.05)。表達順序依次是子宮角、卵巢、垂體、下丘腦和輸卵管(圖8B)。

A．Western blot檢測蛋白水平(1.下丘腦；2.垂體；3.卵巢；4.子宮角；5.輸卵管)；B．積分光密度值分析

3 討論

最初的研究結(jié)果表明，NGF僅在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮生物學(xué)功能，但越來越多的研究表明，其也能夠作用于其他系統(tǒng)的非神經(jīng)細胞[12]。如，NGF在卵泡發(fā)育、誘導(dǎo)排卵、卵巢激素合成、子宮的周期性發(fā)育和輸卵管運輸、受精、精子獲能、早期胚胎發(fā)育等方面均有重要調(diào)控作用[13-17]。早期研究表明：NGF生物活性部位為β亞基，是由2個各長118個氨基酸殘基組成的二聚體[18]。本試驗成功克隆了雙峰駝β-NGF基因完整的CDS序列，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)β-NGF編碼的為非跨膜可溶性蛋白，且主要表達于細胞核(73.9%)，提示其在細胞內(nèi)發(fā)揮作用這與其在細胞內(nèi)發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用的研究結(jié)果[19]相一致。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，雙峰駝β-NGF核苷酸序列與單峰駝和羊駝高度保守，與其他物種存在進化差異。研究表明，NGF與其受體酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TrkA)結(jié)合后，使TrkA磷酸化[20]，磷酸化的TrkA經(jīng)過一系列反應(yīng)，形成復(fù)雜的化合物，最終激活蘇氨酸-絲氨酸激酶(threonine serine kinase，Raf)將NGF的信號傳至細胞核，從而影響基因的表達。本試驗發(fā)現(xiàn),雙峰駝β-NGF蛋白有22個絲氨酸磷酸化位點，11個蘇氨酸磷酸化位點和2個酪氨酸磷酸化位點，推測雙峰駝β-NGF蛋白也能通過一系列反應(yīng)激活Raf，從而影響基因的表達。

為探究β-NGF在雙峰駝生殖軸系的表達規(guī)律，本試驗通過qRT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)染色的方法檢測β-NGF在下丘腦-垂體-卵巢生殖軸系的表達規(guī)律。結(jié)果表明，β-NGF在各組織中均有表達，且在子宮角中表達最高。免疫組化結(jié)果表明，在子宮皺褶的肌細胞及子宮腺上皮細胞有微弱的免疫陽性，在卵巢的顆粒細胞、膜細胞和間質(zhì)細胞以及輸卵管的黏膜上皮細胞有中等強度的免疫陽性，在下丘腦細胞和垂體的嗜色細胞、嫌色細胞有很強的免疫陽性。研究表明，NGF在胎兒卵巢原始卵泡形成前就有表達，但缺乏NGF或阻斷NGF生物活性可使原始卵泡的生成受阻，說明 NGF參與早期卵泡的發(fā)生[21]。DISSEN等[22]發(fā)現(xiàn)，NGF表達于牛卵巢的顆粒細胞和膜細胞。SHI等[23]研究表明，NGF在倉鼠的子宮內(nèi)膜上皮細胞、腺細胞及基質(zhì)細胞中均有表達。WENG等[24]研究發(fā)現(xiàn)，NGF在金倉鼠輸卵管的上皮細胞和平滑肌細胞中有表達。垂體是體內(nèi)復(fù)雜而重要的內(nèi)分泌腺，對下丘腦中樞受到的內(nèi)外刺激作出反應(yīng)[25-26]。研究表明，β-NGF在誘導(dǎo)排卵的生殖軸的調(diào)節(jié)和激活中起著關(guān)鍵作用，其可以穿過血腦屏障，最終可能到達下丘腦細胞[27]。據(jù)此推測，β-NGF可以影響雙峰駝下丘腦細胞的激活和調(diào)節(jié)，從而影響誘導(dǎo)排卵過程。卵巢不僅是卵泡發(fā)生和排卵的場所，更是雌性動物分泌雌激素和孕酮的器官[28]。輸卵管和子宮是受精卵形成和著床的場所[29]。馬永和[20]研究發(fā)現(xiàn)，在卵泡期，牛子宮中NGFmRNA表達量顯著高于卵巢中的表達量。本次試驗中，β-NGF主要分布在雌性雙峰駝的子宮角中，提示β-NGF可能通過子宮內(nèi)膜參與了雙峰駝的誘導(dǎo)排卵過程，但具體的調(diào)控機制，還需進一步研究。

綜上，β-NGF在雙峰駝下丘腦-垂體-生殖軸系上發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，β-NGF基因在子宮角中高表達，推測β-NGF可能通過子宮內(nèi)膜參與了雙峰駝的誘導(dǎo)排卵的某些生理學(xué)過程。