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    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬在冷暴露誘發(fā)小鼠腎臟損傷中的作用

    2023-01-31 07:39:40楊煥民李士澤逯靜靜
    關(guān)鍵詞:腎臟機(jī)體小鼠

    韓 琦,楊煥民,李士澤,張 旭,逯靜靜,徐 彬

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

    越來越多的研究證據(jù)表明,環(huán)境的異常變化對(duì)機(jī)體有著較大的影響,會(huì)影響代謝、呼吸、血液循環(huán),還會(huì)增加死亡率。寒冷作為北方常見的應(yīng)激原,是制約畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素。長(zhǎng)期暴露在冷環(huán)境中,會(huì)引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)。冷應(yīng)激會(huì)降低動(dòng)物機(jī)體的抵抗力,增加患病的風(fēng)險(xiǎn)。因此探明冷應(yīng)激對(duì)機(jī)體功能的影響,對(duì)闡明冷應(yīng)激的機(jī)理以及防止寒冷傷害具有重要意義。

    腎臟作為人體泌尿系統(tǒng)中最重要的器官,在血液循環(huán)中,承擔(dān)著濾過代謝廢物并排出體外及重吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要使命。有研究表明低溫會(huì)損傷腎小管上皮細(xì)胞[1],導(dǎo)致腎功能下降,進(jìn)而造成腎臟的損傷。有文獻(xiàn)指出,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)會(huì)參與腎臟損傷的過程[2]。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種多用途的細(xì)胞器,存在于大多數(shù)細(xì)胞中,其主要功能之一是對(duì)新生成蛋白的翻譯后折疊和對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白的再加工[3]。ER功能易受外界環(huán)境變化影響,如氧氣供應(yīng)不足等會(huì)破壞ER腔內(nèi)穩(wěn)態(tài),引起ER功能損傷,導(dǎo)致未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白的堆積,誘發(fā)ERS[4-7]。細(xì)胞為了降解ER中堆積的未折疊蛋白會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unsaturated polyester resins,UPR)。研究發(fā)現(xiàn),真核細(xì)胞通過3種不同的機(jī)制處理UPR,第1種是增強(qiáng)對(duì)未折疊蛋白的折疊;第2種是降低對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯;第3種是通過ER的降解作用降解未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白[8]。UPR具有雙重性,短暫的ERS作用下UPR能夠幫助細(xì)胞回歸穩(wěn)定狀態(tài),但在嚴(yán)重和持久的ERS條件下,因UPR的適應(yīng)性不能消除堆積的未折疊蛋白,ER功能恢復(fù)正常狀態(tài)而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生的其他機(jī)制[9]。綜上,本試驗(yàn)旨在探究冷暴露對(duì)腎臟造成損傷的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠(體質(zhì)量為22~24 g),購于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。在人工智能氣候室中:(24±2)℃,40%相對(duì)濕度下,明/暗:12 h/12 h,小鼠自由飲水進(jìn)食。

    1.2 試驗(yàn)方法將5周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為室溫對(duì)照組和冷暴露組。室溫對(duì)照小鼠于(24±2)℃環(huán)境中飼養(yǎng)。冷暴露組小鼠在早上8點(diǎn)到晚上8點(diǎn)之間隨機(jī)在4℃環(huán)境中刺激3 h,共刺激3周。

    1.3 主要儀器人工智能氣候室(濟(jì)南旭邦電子科技有限公司)、酶標(biāo)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)、電泳儀、電泳槽(BIO-RAD,美國(guó))、化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像系統(tǒng)(BIO-RAD,美國(guó))、球磨儀(弗爾德儀器設(shè)備有限公司)。

    1.4 主要試劑BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)有限公司;HRP-山羊抗小鼠二抗、HRP-山羊抗兔二抗;P-eiF2α、eiF2α、XBP1、GRP78、Chop、LC3、P62、Beclin1、ATG7一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

    1.5 q-PCR檢測(cè)腎臟組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)向腎臟組織中加入1 mL TRIzol 進(jìn)行RNA提取,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,最后進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如表1所示。

    表1 引物序列

    1.6 HE染色取小鼠腎臟組織,用4%的多聚甲醛固定,包埋,切片,二甲苯脫蠟,水化,蘇木精染色,分化,伊紅染色,脫水,封片,最后用顯微鏡觀察。

    1.7 對(duì)小鼠腎臟ERS和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)剪取腎臟組織樣本,提取總蛋白。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度,樣品按統(tǒng)一濃度用RIPA稀釋,加入Buffer混勻,煮沸7 min。蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,4℃孵育一抗,室溫孵育二抗。最后用Image Lab軟件對(duì)蛋白灰度進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果

    2.1 腎臟組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比,冷暴露組小鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)顯著升高(圖1)。

    ***. P<0.001; **.P<0.01。下同

    2.2 慢性冷暴露后小鼠腎臟的病理學(xué)變化HE染色結(jié)果可觀察到與對(duì)照組相比,冷暴露組小鼠腎臟組織中炎癥細(xì)胞增多,腎小管上皮細(xì)胞可見變性壞死(圖2)。

    A.對(duì)照組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu); B.冷暴露組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)

    2.3 慢性冷暴露對(duì)小鼠腎臟ERS的影響蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比慢性冷暴露組內(nèi)小鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(p-eiF2α、eiF2α、CHOP、XBP1、GRP78)蛋白的表達(dá)水平升高(圖3)。

    A.Western blot;B.p-eiF2α/eiF2α比值;C.XBP1相對(duì)表達(dá)水平;D.GRP78相對(duì)表達(dá)水平;E.CHOP相對(duì)表達(dá)水平

    2.4 慢性冷暴露對(duì)小鼠腎臟自噬的影響蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比慢性冷暴露組小鼠腎臟自噬相關(guān)蛋白(ATG7、Beclin1、LC3、P62)蛋白的表達(dá)水平升高(圖4)。

    A.Western blot;B.ATG7相對(duì)表達(dá)水平;C.Beclin1相對(duì)表達(dá)水平;D.LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值;E.P62相對(duì)表達(dá)水平

    3 討論

    在北方高寒地區(qū),低溫環(huán)境對(duì)畜禽養(yǎng)殖造成了很大的影響。徐晶等[10]研究發(fā)現(xiàn)急性冷暴露會(huì)影響仔豬腎臟的功能。本課題組前期試驗(yàn)猜測(cè)冷暴露對(duì)小鼠腎臟功能也會(huì)有影響。于是本試驗(yàn)對(duì)腎臟相關(guān)的血液生化指標(biāo)尿素、肌酐及尿酐比的水平進(jìn)行了檢測(cè)。肌酐水平可以反映出腎小球?yàn)V過功能受損的程度[11]。試驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,冷暴露組小鼠肌酐水平升高,這提示冷暴露可能影響腎臟的功能,與本研究猜想相符合。

    腎臟是機(jī)體一個(gè)重要的器官,其可以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物并重吸收有用的物質(zhì)。葉翠[12]研究發(fā)現(xiàn)腎小球?yàn)V過功能受損會(huì)導(dǎo)致腎病的發(fā)生。根據(jù)組織學(xué)和q-PCR結(jié)果顯示,冷暴露組小鼠腎臟組織中有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)顯著升高。這表明慢性冷暴露會(huì)促進(jìn)腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)。

    已有研究證實(shí)ERS的激活參與腎小囊上皮細(xì)胞損傷、腎小球系膜細(xì)胞損傷及腎小管上皮細(xì)胞損傷[13]。因此本試驗(yàn)檢測(cè)了ERS相關(guān)蛋白GRP78、XBP1的表達(dá)。GRP78主要參與UPR,當(dāng)未折疊蛋白在ER中累積時(shí),GRP78與跨膜蛋白分離,使跨膜信號(hào)蛋白聚集,感應(yīng)并傳遞UPR信號(hào)[14-15]。XBP1可作為ERS的傳感器,調(diào)控UPR。同時(shí)有報(bào)道稱ERS激活會(huì)引起凋亡基因CHOP表達(dá)升高,CHOP的過度表達(dá)觸發(fā)凋亡途徑,使細(xì)胞發(fā)生凋亡[16]。本試驗(yàn)中,CHOP、GRP78和XBP1在冷暴露組小鼠腎臟組織中表達(dá)較對(duì)照組升高。得出結(jié)論,當(dāng)機(jī)體受到冷刺激后,會(huì)促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生,誘發(fā)ERS。

    ERS與自噬的相互作用在很多生理與病理過程中都存在,ERS可通過多種分子機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬[17-18],減輕ER壓力并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[19]。然而,高強(qiáng)度或持久的應(yīng)激可啟動(dòng)細(xì)胞依賴自噬的死亡程序。Beclin-1是自噬關(guān)鍵調(diào)控蛋白之一[20],可形成 Beclin1-Vps34-Vps15 復(fù)合結(jié)構(gòu)而啟動(dòng)自噬、促進(jìn)吞噬泡成核并召募蛋白形成自噬前體[21]。eiF2α的激活是多種疾病中錯(cuò)誤折疊蛋白積累引起自噬激活所必需的,其激活可以促進(jìn)LC3的轉(zhuǎn)化。LC3是參與自噬的關(guān)鍵蛋白[22],其包括2種可以相互轉(zhuǎn)化的形式,分別是LC3Ⅰ和LC3Ⅱ[23]。LC3Ⅱ隨著自噬體膜的數(shù)量增多而增加。P62是自噬過程重要的受體,其與泛素化蛋白和LC3Ⅱ結(jié)合成復(fù)合體,啟動(dòng)自噬體形成[24]。在本研究中,對(duì)自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),慢性冷暴露會(huì)導(dǎo)致小鼠腎臟自噬激活。

    綜上所述慢性冷暴露會(huì)促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生,引發(fā)ERS,誘發(fā)細(xì)胞自噬。而關(guān)于慢性冷暴露引起腎臟損傷的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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