高尿酸血癥小鼠腸滲透性增加的差異表達(dá)基因分析

鄒通,孟瑾,宋淼,龔雪琳,邢士超,王笑峰

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,山東 青島 266071)

近年來(lái)，高尿酸血癥(HUA)的發(fā)病率逐漸上升，全球HUA的患病率為5%～25%[1]。除引起痛風(fēng)外，HUA并發(fā)的多種代謝性疾病嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，但引起HUA并發(fā)癥的機(jī)制目前尚不清楚。研究表明，腸黏膜屏障功能失調(diào)、腸通透性增加是引起各種代謝性疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。我們之前的研究表明，HUA小鼠腸滲透性顯著增加，腸滲透性增加可能是導(dǎo)致HUA并發(fā)多種代謝性疾病的因素[2]。但是，導(dǎo)致HUA小鼠腸滲透性增加的機(jī)制尚不清楚，而明確其機(jī)制對(duì)治療HUA并發(fā)代謝性疾病具有重要意義。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)和生物信息學(xué)分析探究引起HUA小鼠腸通透性增加的相關(guān)基因，從而為HUA導(dǎo)致腸通透性增加的機(jī)制研究提供新的思路。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

HY組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為由上海模型生物中心利用聚類規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR相關(guān)內(nèi)切酶Cas9(Cas9)基因編輯技術(shù)敲除尿酸氧化酶基因(Uox-/-)建立的小鼠HUA模型，以同籠繁殖的野生型小鼠作為對(duì)照(WT組)，每組5只。所有小鼠均飼養(yǎng)在12 h光照-12 h黑暗晝夜節(jié)律循環(huán)的環(huán)境中，可以自由飲食和飲水。15周后安樂(lè)死處死小鼠，收集血清及腸組織，保存于-80 ℃。所有小鼠實(shí)驗(yàn)均符合青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)的要求。

1.2 小鼠腸滲透性測(cè)定

應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的右旋糖酐(FD4，Sigma-Aldrich)測(cè)定小鼠的腸通透性。小鼠禁水4 h后，灌胃FD4，劑量為400 mg/kg。4 h后內(nèi)眥取血，離心取血清，利用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm處檢測(cè)FD4的熒光水平。

1.3 腸組織RNA的提取

加入Trizol，將空腸、回腸和結(jié)腸研磨成勻漿液，加入氯仿混勻，離心取上層液，加入異丙醇，離心，棄上清液，用體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇洗滌3次，沉淀即為總RNA。使用QuickDrop超微量紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)RNA濃度及純度。

1.4 RNA-seq

使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent RNA 6000 Nano Kit)檢測(cè)組織總RNA的濃度。使用BGISEQ-500平臺(tái)檢測(cè)樣品，數(shù)據(jù)分析之前去除低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過(guò)高的reads，得到clean reads，使用 HISAT將clean reads比對(duì)到參考基因組序列。使用 Bowtie2 將clean reads比對(duì)到參考序列以統(tǒng)計(jì)基因比對(duì)率，使用RSEM計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。采用R軟件中g(shù)gplot2包進(jìn)行圖形的繪制。使用DEGseq和PossionDis進(jìn)行差異表達(dá)分析。RNA測(cè)序原始數(shù)據(jù)均已上傳到NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，ID為GSE143342。

1.5 GO富集和KEGG通路富集

根據(jù)GO注釋結(jié)果以及官方分類，將差異表達(dá)基因(DEG)進(jìn)行功能分類，同時(shí)使用R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析。根據(jù)KEGG注釋結(jié)果以及官方分類，將DEG進(jìn)行生物通路分類，同時(shí)使用R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)驗(yàn)證

反轉(zhuǎn)錄體系：All-In-One 5×RT MasterMix 4 μL，總RNA 5 μL，無(wú)核酶水11 μL。以上反應(yīng)體系混合均勻，于37 ℃ 15 min、60 ℃ 10 min、95 ℃ 3 min條件下反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即為cDNA。RT-qPCR反應(yīng)體系：BlasTaq 2×qPCR MM 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2.0 μL，無(wú)核酶水7.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR所用引物序列(5′→3′)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠血尿酸水平和腸滲透性比較

HY組小鼠血尿酸水平顯著高于WT組(t=7.376，P<0.01)；與WT組相比，HY組小鼠腸滲透性顯著增加(t=7.326，P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 兩組小鼠血清尿酸水平和腸滲透性比較

2.2 小鼠腸組織RNA測(cè)序

與WT組小鼠相比，HY組小鼠結(jié)腸的DEG共有1 006個(gè)，其中554個(gè)表達(dá)上調(diào)，452個(gè)表達(dá)下調(diào)(圖1A)；回腸的DEG共有347個(gè)，其中221個(gè)表達(dá)上調(diào)，126個(gè)表達(dá)下調(diào)(圖1B)；空腸的DEG共有398個(gè)，其中169個(gè)DEG表達(dá)上調(diào)，229個(gè)DEG表達(dá)下調(diào)(圖1C)。

A：結(jié)腸DEG火山圖；B：回腸DEG火山圖；C：空腸DEG火山圖。橫軸數(shù)值為log2轉(zhuǎn)換后的差異倍數(shù)值，縱軸數(shù)值為-log10轉(zhuǎn)換后的顯著性值。紅色代表上調(diào)的DEG，藍(lán)色代表下調(diào)的DEG，灰色代表非DEG。圖1 HUA小鼠腸組織DEG火山圖

2.3 DEG功能分析

GO富集分析顯示，結(jié)腸中的DEG主要富集于細(xì)胞內(nèi)區(qū)域、細(xì)胞脂質(zhì)代謝過(guò)程、胰島素激活受體活性和花生四烯酸代謝過(guò)程等，回腸中的DEG主要富集于脂代謝正向調(diào)控、蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)及糖異生的負(fù)調(diào)控過(guò)程，空腸中的DEG主要富集于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、脂質(zhì)代謝過(guò)程和輔因子結(jié)合等過(guò)程。KEGG通路富集分析顯示，結(jié)腸、回腸、空腸的DEG主要富集于花生四烯酸代謝、丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)、細(xì)胞色素P450(CYP450)對(duì)異源性物質(zhì)的代謝、CYP450對(duì)藥物的代謝、化學(xué)致癌作用等通路，其中花生四烯酸代謝信號(hào)通路在結(jié)腸、回腸和空腸中同時(shí)被富集。見(jiàn)圖2、3。

A：結(jié)腸DEG的GO分類及富集；B：回腸DEG的GO分類及富集；C：空腸DEG的GO分類及富集。橫軸代表DEG數(shù)目，縱軸代表GO功能分類。圖2 HUA小鼠腸組織DEG的GO富集分析

A：結(jié)腸DEG的KEGG通路分類及富集；B：回腸DEG的KEGG通路分類及富集；C：空腸DEG的KEGG通路分類及富集。橫軸代表基因所占的比例，縱軸代表KEGG功能分類。圖3 HUA小鼠腸組織DEG的KEGG通路富集分析

2.4 與花生四烯酸代謝通路相關(guān)的DEG表達(dá)分析

進(jìn)一步將與花生四烯酸代謝通路相關(guān)的基因繪制成熱圖，結(jié)果顯示，兩組小鼠相比， CYP450系列的幾個(gè)關(guān)鍵基因如CYP2C55、CYP2E1、CYP2C66、CYP2C29在空腸和結(jié)腸中的表達(dá)差異有顯著性，而CYP450系列DEG在回腸中表達(dá)比較少。見(jiàn)圖4。

A：空腸中與花生四烯酸代謝通路相關(guān)的DEG熱譜圖；B：回腸中與花生四烯酸代謝通路相關(guān)的DEG熱譜圖；C：結(jié)腸中與花生四烯酸代謝通路相關(guān)的DEG熱譜圖。每組3～4只小鼠，橫軸代表聚類分析的樣品，縱軸代表DEG。紅色代表上調(diào)的DEG，藍(lán)色代表下調(diào)的DEG，顏色越深表示表達(dá)量越高，顏色越淺表示表達(dá)量越低。圖4 小鼠腸組織中與花生四烯酸代謝通路相關(guān)的DEG熱圖

2.5 腸組織中CYP450相關(guān)基因表達(dá)的驗(yàn)證

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與WT組小鼠相比，HY組小鼠空腸和結(jié)腸中的CYP2E1基因的表達(dá)顯著升高(t=4.717、9.986，P<0.05)，CYP2C55基因表達(dá)顯著降低(t=3.682、4.047，P<0.05)；空腸中CYP2C29、CYP2C66基因的表達(dá)水平顯著降低(t=5.099、4.572，P<0.01)，CYP2C23、CYP4a10基因的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在結(jié)腸中CYP2C23、CYP2J11、CYP2J5、CYP2C66、CYP2C67、CYP2C68、CYP2C69、Ephx2基因的表達(dá)差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表3、4。

表3 兩組小鼠空腸中CYP450相關(guān)基因表達(dá)的比較

表4 兩組小鼠結(jié)腸中CYP450相關(guān)基因表達(dá)的比較

3 討 論

本研究通過(guò)對(duì)HUA小鼠腸組織進(jìn)行RNA測(cè)序以及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸代謝信號(hào)通路相關(guān)基因，特別是CYP450系列相關(guān)基因參與HUA腸滲透性的調(diào)節(jié)。兩組小鼠相比，CYP2C29、CYP2C66、CYP2E1和CYP2C55基因在空腸中的表達(dá)差異具有顯著性，CYP2C55和CYP2E1基因在結(jié)腸中的表達(dá)差異具有顯著性，其中CYP2E1和CYP2C55基因在空腸和結(jié)腸中均差異表達(dá)，提示HUA的腸滲透性增加可能與這些基因有關(guān)。

腸屏障對(duì)防止腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)進(jìn)入體循環(huán)有重要的作用[3-4]。腸屏障被破壞、腸滲透性增加，將會(huì)導(dǎo)致脂多糖(LPS)、細(xì)菌及相關(guān)代謝產(chǎn)物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，激起一系列的炎癥反應(yīng)，以上變化不僅涉及包括腸易激綜合征等在內(nèi)的腸道疾病[5-7]，還涉及糖尿病、代謝性疾病、非乙醇性脂肪肝病等各種系統(tǒng)性疾病[8-9]，因此腸道通透性增加是引發(fā)各種代謝病的關(guān)鍵因素。我們之前的研究表明，HUA小鼠腸滲透性增加可能與CYP450有關(guān)[2]。CYP450是存在于不同組織中的重要代謝酶。這些酶主要存在于腸道和肝臟組織中，在細(xì)胞代謝中起著核心作用，其主要功能是異源物質(zhì)代謝和生物活性分子合成[10]。研究表明，CYP酶除了與癌癥的發(fā)展相關(guān)外，也與炎癥的發(fā)生有關(guān)，尤其是來(lái)自CYP1、CYP2、CYP3和CYP4家族的相關(guān)酶[11]。影響腸通透性的因素有很多，其中腸道微生物及病原體相關(guān)分子均可以通過(guò)腸黏膜免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體(TLRs)引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生炎癥因子和干擾素，誘導(dǎo)腸炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致腸滲透性增加[12-13]。大量的研究均表明，炎癥是導(dǎo)致腸滲透性增加的一個(gè)重要因素。本文研究結(jié)果顯示，在HUA小鼠的空腸和回腸中有多個(gè)CYP2家族的基因發(fā)生顯著變化，特別是CYP2E1在空腸和結(jié)腸中的表達(dá)顯著升高，CYP2C55的表達(dá)顯著降低。CYP2E1是CYP450的乙醇誘導(dǎo)形式，參與乙醇代謝，在非乙醇脫氫酶氧化途徑中起重要作用，參與了乙醇性肝病的發(fā)生過(guò)程[14]。有研究表明，CYP2E1可以通過(guò)模式識(shí)別受體激活先天性免疫系統(tǒng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，增加氧化應(yīng)激反應(yīng)[15-16]。另有研究表明，在乙醇喂養(yǎng)小鼠中CYP2E1表達(dá)增加，引起了體內(nèi)氧化應(yīng)激，上調(diào)了腸道內(nèi)的CLOCK以及PER2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了腸道通透性的增加，而CYP2E1基因敲降小鼠與接受CYP2E1抑制劑治療小鼠的腸滲透性增加則有所緩解[17-18]。CHO等[19]研究表明，CYP2E1的增高會(huì)引起腸滲透性的變化，表明CYP2E1參與了腸滲透性的調(diào)控。在本研究中，HUA小鼠空腸和結(jié)腸中的CYP2E1表達(dá)顯著增高，表明CYP2E1也參與了HUA腸滲透性的調(diào)控。我們推測(cè)，HUA小鼠中異常的菌群及代謝產(chǎn)物導(dǎo)致腸道內(nèi)CYP2E1水平上調(diào)，進(jìn)而通過(guò)引起腸道的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，損傷腸上皮細(xì)胞，影響腸滲透性。我們之前的研究也表明，在HUA小鼠的空腸和結(jié)腸中，模式識(shí)別受體TLRs以及炎癥因子如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β等水平增高，先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)被激活[2]。CYP2C55是一種可以催化花生四烯酸代謝產(chǎn)物合成的酶，而這些代謝產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)腎血管張力和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等重要的生理功能。既往有文獻(xiàn)報(bào)道，LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)使CYP2C55mRNA水平降低，表明CYP2C55也在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，CYP2C55的下調(diào)會(huì)激活腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[20]。因此我們推測(cè)，HUA通過(guò)上調(diào)CYP2E1和下調(diào)CYP2C55引起氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，損傷腸黏膜屏障，進(jìn)而導(dǎo)致腸滲透性增加。CYP2E1和CYP2C55在HUA腸滲透性增加的分子機(jī)制中起著重要的作用。

綜上，在HUA小鼠中，CYP450相關(guān)基因的改變影響了腸滲透性，特別是CYP2E1和CYP2C55在其中起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果為HUA并發(fā)癥的治療提供了一個(gè)新的方向，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。