人參炮制品發(fā)酵前后功能性成分變化對比

李秋陽，唐金鑫，劉士偉，鄒佳琪，王麗娜，于雷，畢云楓*

（1.吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林 吉林 132013）

人參作為一種草本植物，具有非常高的藥用價值和經濟價值，在中國醫(yī)藥研究和工業(yè)應用領域一直占有極其重要的戰(zhàn)略地位，人參中的活性物質也受到了較高的關注[1]。在草藥市場，人參主要經過3種方式加工后被食用，即通過陽光脫水后可以從鮮人參中獲得白參[2]，鮮人參蒸制一次后曬干用于生產紅參[3-4]，以及近年來通過“九蒸九曬”制成的黑參也因其表現出比白參或紅參更強大的生物活性而引起研究者的關注[5]。紅參的抗氧化活性和免疫調節(jié)功能被證明優(yōu)于白參[6]。然而，研究表明，人參中的活性物質可在蒸煮過程中改變部分結構[7-8]。人參也可以利用微生物加工制成發(fā)酵人參，這種處理又進一步改變了人參提取物的組成，由于這些處理過程復雜多樣，因此識別其被加工后的活性成分變化及藥理功效是有重要意義的。

發(fā)酵食品備受關注是因為它們的菌株特異性能力可以發(fā)揮超出其營養(yǎng)價值的免疫調節(jié)作用[9]。多個研究表明，發(fā)酵后的人參及其加工品無論是從生物活性還是功效作用上都表現出比發(fā)酵前更優(yōu)的效果[10-11]。盡管已經開發(fā)了大量的分析方法來檢測人參中存在的人參皂苷，但對氨基酸的關注相對較少。本文通過發(fā)酵白參、紅參、黑參，探究發(fā)酵前后人參炮制品的功能性成分變化，為后續(xù)的功效分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌：吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院新資源加工與利用實驗室保存；腸膜明串珠菌腸膜亞種：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；白參、紅參、黑參：市售，經吉林農業(yè)大學中藥材學院何忠梅教授鑒定分別為五加科植物人參、紅參及黑參的干燥根；蜂蜜：市售；鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）、3-巰基丙酸、17種氨基酸混合標準品、天冬酰胺標準品、谷氨酰胺標準品、瓜氨酸標準品、正纈氨酸標準品、色氨酸標準品、21-羥脯氨酸標準品、肌氨酸標準品：Sigma-Alarich生物科技公司；101型大孔吸附樹脂：天津市海光化工有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所；3，5-二硝基水楊酸、異辛烷、醋酸銅、油酸、橄欖油、福林酚、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸、L-酪氨酸：天津市光復精細化工研究所；乙腈、甲醇（均為色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2600I/島津型可見分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；YT1101酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Agilent1100高效液相色譜儀：安捷倫（中國）科技有限公司；BXM-30R型滅菌鍋：上海東亞壓力容器制造有限公司；300A旋轉蒸發(fā)儀：中國力辰科技有限公司；DOU-2HP型粉碎機：日本佑琦有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人參發(fā)酵樣品的制備

原料經過粉碎后，過60目篩，準確稱取60.00 g，添加120.00 mL水，接種4%混合菌[植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌腸膜亞種=1∶1（體積比）]，菌液濃度為3.63×108CFU/mL，室溫（30℃～32℃）發(fā)酵23 d。

1.3.2 總酸含量的測定

參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中的指示劑滴定法檢測，結果以檸檬酸計。

1.3.3 總糖含量的測定

參照NY/T 2332—2013《紅參中總糖含量的測定分光光度法》中分光光度法測定總糖含量，結果以葡萄糖計?？偺呛康挠嬎愎饺缦隆?/p>

式中：W 為總糖含量，%；m1為葡萄糖含量，mg；V為試樣的定容體積，mL；V1為稀釋液的體積，mL；f為稀釋倍數；m為試樣的質量，g。

1.3.4 總酚含量的測定

總酚含量采用福林酚法測定，以沒食子酸為標準物質計。稱取0.5 g沒食子酸溶于10 mL無水乙醇中，再用蒸餾水定容至100 mL，得到5 mg/mL標準溶液。量取 1、3、5、7、9 mL 標準溶液于 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，配制沒食子酸系列標準溶液。分別取0.1 mL沒食子酸系列標準溶液于10 mL容量瓶中，添加0.5mL福林酚溶液，混勻，室溫（30℃～32℃）下反應5 min，加入2.0 mL 15%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至10 mL，置于室溫（30℃～32℃）下暗處反應2 h。在波長765 nm處測定吸光度，以標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y=0.001 5x+0.04（R2=0.999 5）。發(fā)酵樣品3 500 r/min離心10 min，取上清液0.1 mL于10 mL容量瓶中，添加0.5 mL福林酚溶液，之后的步驟同前述方法。

1.3.5 人參皂苷含量的測定

1.3.5.1 人參皂苷的提取方法

準確稱取適量發(fā)酵前后樣品于燒杯中，加入3倍體積的甲醇，超聲處理30 min，靜置12 h后以3 500 r/min離心10 min，倒出上清液，所剩樣品繼續(xù)加入相同量的甲醇超聲30 min，靜置12 h，以3 000 r/min離心10 min，合并2次上清液，80℃水浴蒸發(fā)至溶液的一半，隨后加入4倍體積的正丁醇溶液，搖勻，靜置12 h，將上清液旋轉蒸發(fā)至近干，加入5 mL甲醇溶解，溶液過0.22 μm濾膜，即得人參皂苷待測溶液。

1.3.5.2 色譜條件

色譜柱為C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸鹽水溶液（B）；梯度洗脫（0.1 min～5 min，18%A；5 min～20 min，21%A；20 min～22 min，21%～26%A；22 min～26 min，26%～32%A；26 min～46 min，32%～33.8%A；46 min～51 min，33.8%～38%A；51 min～57.7 min，38%～49%A；57.7 min～58 min，49%～49.1%A；58 min～62 min，49.1%A；62 min～63 min，49.1%～50.6%A；63 min～68 min，50.6%～59.6%A；68 min～69.8 min，59.6%～65%A；69.8 min～77 min，65%A；77 min～94 min，65%～85%A；94 min～120 min，18%A）。檢測波長：203 nm，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL，柱溫：35 ℃。

1.3.6 游離氨基酸含量的測定

1.3.6.1 樣品前處理

將樣品研碎，稱取1.5 g樣品置于10 mL離心管中，加0.01 mol/L鹽酸5 mL，混勻，沸水浴30 min后，10 000 r/min離心10 min，取上清液；沉淀中加入2 mL 0.01 mol/L鹽酸后懸浮超聲5 min，離心（3 500 r/min，10 min），合并上清液，蒸餾水定容至 10 mL，過 0.22 μm濾膜。

1.3.6.2 在線柱前衍生

采用安捷倫公司自動在線衍生化方法，一級氨基酸與鄰苯二甲醛（OPA）、二級氨基酸與芴甲氧羰酰氯（fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC）衍生后過柱檢測。柱前衍生進樣流程：先從樣品抽取1 μL樣品液（進樣針插入洗液瓶中1次，清洗進樣針外壁，以下每次進樣相同），隨后抽取2 μL硼酸緩沖液，在空氣中反復抽吸3次，混勻，再抽取1 μL OPA衍生試劑，在空氣中反復抽吸3次混勻，靜置反應0.5 min，同樣抽取1 μL FMOC衍生試劑，在空氣中反復抽吸3次混勻，靜置反應0.5 min，最后抽取13 μL超純水，在空氣中反復抽吸3次混勻，進樣。

1.3.6.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×75 mm，3.5 μm）；檢測信號為紫外波長 338（0～19 min）、266 nm（19.01 min～25 min）；流動相為（A）乙腈，（B）乙腈 ∶甲醇∶水=45∶45∶10（體積比）；梯度洗脫（0.1 min～1 min，100%A；1 min～7.5 min，100%～23%A；7.5 min～12 min，23%～40%A；12 min～23 min，40%～46%A；23 min～27 min，46%～0%A；27 min～40 min，0%～100%A）。流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL。

1.3.7 蛋白酶酶活力的測定

稱取發(fā)酵前后樣品10 g，4 000 r/min離心20 min，取上層清液1 mL于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容后取0.5 mL，滴加0.5 mol/L 0.2 mL氫氧化鈉溶液，加入80 mL緩沖液（pH7.5磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液），在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后轉入100 mL容量瓶中，用緩沖液定容，備用。蛋白酶酶活力的測定參照王學標等[12]的方法。

1.3.8 脂肪酶酶活力的測定

取發(fā)酵前后樣品10 g，4 500 r/min離心25 min，取上清液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，備用。脂肪酶酶活力的測定參照孫淑夷[13]的方法。

1.3.9 SOD酶活力的測定

取發(fā)酵前后樣品10 g，4 000 r/min離心15 min，取上清液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，取適量稀釋后的樣品液，按照SOD酶試劑盒方法進行SOD酶活力的測定。

1.3.10 數據處理與分析

數據表示為平均值±標準差，每組試驗重復3次，使用Microsoft Excel 2019和Origin pro 8.5作圖及SPSS 26進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵前后基本理化指標結果分析

總酸、總糖、總酚是發(fā)酵產品中理化檢測的指標，其中，總酸作為微生物代謝酒精發(fā)酵及蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中最終合成的代謝產物，常常被用于優(yōu)化發(fā)酵工藝，在發(fā)酵過程中微生物會不斷分解糖類用來滿足自身生長所需的碳源[14]；同時，微生物代謝產生的酚類物質具有很強的清除自由基的能力，還有抑制低密度脂蛋白氧化等功能[15]。利用指示劑滴定法測定總酸含量，分光光度計法測定總糖和總酚含量，表1為發(fā)酵前后總酸、總糖、總酚含量對比。

表1 發(fā)酵前后總酸、總糖、總酚含量對比Table 1 Comparison of total acid，total sugar and total phenol content before and after fermentation

由表1可知，在發(fā)酵后，人參炮制品的總酸含量增加，其中，紅參發(fā)酵前后總酸含量增幅最大，由3.840 mg/mL增至43.390 mg/mL；白參對總糖利用率最高，達到75.00%；發(fā)酵后的黑參總酚含量由0.680 mg/mL增至1.360 mg/mL，增加至2倍左右。從結果可以看出，隨著發(fā)酵的進行，微生物對底物的不斷利用使發(fā)酵液中總糖含量降低，作為發(fā)酵代謝產物的總酚及總酸含量增加，這些理化指標的變化表明，發(fā)酵過程符合微生物生長代謝基本生理變化，同時也不同程度地提升了發(fā)酵液的功能性。

2.2 發(fā)酵前后人參皂苷轉化結果分析

采用高效液相色譜法對人參皂苷進行了分析，發(fā)酵前后人參皂苷含量對比結果見表2。

表2 發(fā)酵前后人參皂苷含量對比Table 2 Comparison of ginsenoside content before and after fermentation

由表2可知，發(fā)酵前的白參中人參皂苷Rb1、Rc及Re的含量較高，由于高溫加工的進行，紅參和黑參中 Rb1、Rc、Rb2 及 Re含量減少，轉化成 Rg3、Rk1 和F2等白參中極少含有的稀有皂苷。白參生成的二醇型次級代謝產物主要為Rg3、F2和Rh2，含量分別為0.16、0.69 mg/g和0.21 mg/g；生成的三醇型次級代謝產物主要為Rg2和Rh4，含量分別為1.94 mg/g和0.49 mg/g。紅參中的二醇型人參皂苷主要轉化為稀有皂苷Ck、Rk1和F2，轉化率分別為200.00%、44.00%和216.67%；主要三醇型皂苷轉化為稀有皂苷Rk3、Rg2和Rh4，轉化率分別為21.05%、40.74%和69.23%；苷元PPD和PPT的轉化率為568.42%和282.35%。黑參中的主要二醇型皂苷主要轉化為稀有皂苷Ck、F2和Rh2，轉化率分別為366.67%、269.57%和100.00%；三醇型人參皂苷主要轉化為稀有皂苷Rh1、Rk3和Rh4，轉化率分別為300.00%、80.00%和361.22%；苷元PPD和PPT的轉化率為555.17%和207.69%。

2.3 發(fā)酵前后游離氨基酸含量結果分析

人參中富含多種氨基酸，其中包含8種人體必需氨基酸，其含量已成為衡量人參產品質量的指標之一。利用高效液相色譜法測定人參炮制品發(fā)酵前后游離氨基酸的含量，結果見表3。

表3 發(fā)酵前后游離氨基酸含量對比Table 3 Comparison of free amino acid content before and after fermentation

續(xù)表3 發(fā)酵前后游離氨基酸含量對比Continue table 3 Comparison of free amino acid content before and after fermentation

由表3可知，在發(fā)酵前，人身炮制品中游離氨基酸含量大小排序為白參＞紅參＞黑參，可能是由于在加熱過程中發(fā)生的美拉德反應使汽蒸過程中氨基酸含量有所下降。在發(fā)酵后，3種參總氨基酸含量大幅度降低。在發(fā)酵前，必需氨基酸含量排序為白參＞紅參＞黑參，發(fā)酵后，除白參中必需氨基酸含量增加外，紅參和黑參的必需氨基酸含量均明顯降低，但發(fā)酵后必需氨基酸的占比均有所提高。對于發(fā)酵后游離氨基酸含量的降低，一方面可能由于發(fā)酵時間長導致氨基酸在缺乏氮源時被微生物作為營養(yǎng)物質消耗，另一方面在發(fā)酵過程中游離氨基酸代謝生成了蛋白質及酶，但具體原因還需進一步研究。

2.4 發(fā)酵前后功效酶酶活力結果分析

蛋白酶、脂肪酶以及SOD被稱為人體主要的功效酶。其中，SOD為廣泛存在于生物機體內抗氧化酶的總稱，能夠清除動植物體內自由基和活性氧，在預防衰老和抗氧化等方面起到重要作用。蛋白酶是一組大分子復雜酶，可水解氨基酸和蛋白質之間的肽鍵。大量的蛋白酶主要來源于微生物發(fā)酵過程，因其對生物分子具有特異性、參與調節(jié)某些生理途徑，在生物科技及醫(yī)藥中備受關注。脂肪酶是酶類的一種，也可以進行水解反應以及酯化反應，而其本質是由氨基酸組成的蛋白質物質。蛋白酶及脂肪酶可以有效分解食物中蛋白質、油脂等高熱量物質，所以被廣泛應用于減肥產品、保健產品中。這3種功效酶酶活力常被作為微生物發(fā)酵類保健產品的檢測指標[16-17]。

圖1～圖3分別為3種參發(fā)酵前后SOD、蛋白酶、脂肪酶酶活力的對比圖。

圖1 發(fā)酵前后SOD酶活力的變化Fig.1 Changes of SOD enzyme activity before and after fermentation

圖2 發(fā)酵前后蛋白酶酶活力的變化Fig.2 Changes of protease enzyme activity before and after fermentation

如圖1所示，SOD酶活力在發(fā)酵前后，黑參都屬最高，發(fā)酵后的SOD酶活力是發(fā)酵前的2.13倍，達到88.59 U/mL。由圖2可以看出，在發(fā)酵前，黑參蛋白酶酶活力最高，為20.423 8 U/mL，隨著發(fā)酵的進行，3組人參炮制品的蛋白酶酶活力均增加，且發(fā)酵后黑參中的蛋白酶酶活力最高，為36.421 9 U/mL。由圖3可知，脂肪酶酶活力在發(fā)酵后也有所提升。隨著發(fā)酵的進行，黑參脂肪酶酶活力由6.48 U/mL提升至16.48 U/mL。以上結果表明，經發(fā)酵，3組人參炮制品中人體主要的功效酶酶活力均有不同程度的提升，這將有利于功效性產品的開發(fā)。

3 討論與結論

人參是一種著名的功能性保健食品，用于提神醒腦、消除慢性疲勞、改善健康。在部分亞洲國家，它已被用作膳食補充劑[18-19]。在加工和發(fā)酵的過程中，人參中的人參皂苷和氨基酸等主要生物活性成分會發(fā)生變化，并產生多種生物活性化合物，這些化合物可能會在體內誘導獨特的生理活性。對于人參皂苷含量的變化，在發(fā)酵前，白參中天然皂苷含量較高。與白參相比，紅參和黑參中 Rb1、Rc、Rb2、Re 含量逐漸減少，Rg3、Rk1和F2等稀有皂苷有少量生成。白參在發(fā)酵后，生成的次級代謝產物主要為F2、Rg2和Rh4，紅參在發(fā)酵后其主要轉化為稀有皂苷Ck、F2和Rh4，黑參其主要轉化為稀有皂苷Ck、F2、Rh1和Rh4，這與相關文章中分析的皂苷轉化路徑是相符合的。結果表明，人參皂苷通過高溫加工和微生物發(fā)酵轉化為更具功效的稀有皂苷。

人參中重要的化學成分除人參皂苷外還有人參氨基酸。氨基酸是含有羧基（-COOH）和氨基（-NH2）官能團的重要有機化合物，以往的研究表明，人參中氨基酸含量豐富，是人參產品質量控制的重要指標[20]。Liu等[21]指出，經過氨基酸處理的低極性人參皂苷的濃度顯著高于未經處理的人參，這對提高人參功效更有意義。因此，文中對人參中24種游離氨基酸的含量進行測定，結果表明，在發(fā)酵前，白參中24種游離氨基酸的總含量最高，而黑參中氨基酸總含量最低。在發(fā)酵后，3種參的游離氨基酸含量大幅度減少。此外，功效酶酶活力也用來分析人參炮制品發(fā)酵前后功能性成分的變化，結果表明，人參炮制品在發(fā)酵后，主要的功效酶酶活力均有不同程度的提升。本研究以期為人參的加工和利用提供參考。