基于分子模擬優(yōu)化篩選甲磺隆特異性多肽

尚華，趙雷興，秦月，劉冰

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

甲磺隆是一種磺酰脲類(lèi)除草劑[1-2]，由于生物活性極高，甲磺隆在土壤中微量的殘留就會(huì)對(duì)后茬敏感作物造成嚴(yán)重影響[3-4]。因此深入研究其環(huán)境行為、毒性作用、污染機(jī)制及生態(tài)效應(yīng)，從而有效控制它對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的危害和損失，是十分緊迫的重要課題。甲磺隆殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[5]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[6]、酶聯(lián)免疫測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[7]等傳統(tǒng)方法。液相色譜等大型儀器方法需要專(zhuān)業(yè)的儀器和技術(shù)人員，免疫方法獲得抗體周期長(zhǎng)、不確定性高，考慮到甲磺隆的應(yīng)用場(chǎng)景，開(kāi)發(fā)能夠特異性識(shí)別甲磺隆的識(shí)別元件以及方便快捷靈敏的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法非常必要。

分子模擬技術(shù)現(xiàn)已成為各應(yīng)用領(lǐng)域科研拓展的熱點(diǎn)方向，希望能克服由實(shí)際試驗(yàn)中試驗(yàn)周期較長(zhǎng)、類(lèi)型眾多以及復(fù)雜性大等實(shí)際問(wèn)題所造成的局限性[8]。Ao等[9]應(yīng)用分子模擬開(kāi)發(fā)出一種使用分子印跡聚合物的高選擇性樣品凈化方法。通過(guò)分子對(duì)接[10-11]，可以找到受配體結(jié)合的最有利位置、方向和構(gòu)象，其對(duì)接算法和評(píng)分函數(shù)能夠生成受體-配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、評(píng)估結(jié)合能或親和性。Davella等[12]借助AUTODOCK對(duì)接程序分析胡椒中的某些植物化學(xué)物質(zhì)對(duì)COVID-19的主要蛋白酶的敏感度。目前，較為普遍使用的分子對(duì)接程序有 DOCK、LIBDOCK、AUTODOCK、CDOCKER等。分子對(duì)接通常包括3類(lèi)，剛性對(duì)接、半柔性對(duì)接、柔性對(duì)接。本文中應(yīng)用的CDOCKER程序[13]屬于半柔性對(duì)接工具，應(yīng)用CHARMm立場(chǎng)。

分子對(duì)接中的多肽片段對(duì)接也一直是對(duì)接領(lǐng)域的熱門(mén)話題[14]。多肽是指將3個(gè)或3個(gè)以上的氨基酸分子以肽鍵方式連結(jié)到一起的肽。Kumar等[15]通過(guò)篩選一個(gè)針對(duì)牛胰蛋白酶的500條多肽片段Maybridge庫(kù)，參與基于SAMPL3片段的虛擬篩選挑戰(zhàn)并評(píng)估虛擬片段篩選方法。由于多肽具有免疫原性低、生物降解性好、穿透性高、合成和修飾容易以及高親和力等優(yōu)點(diǎn)，可作為特異性識(shí)別元件建立快捷靈敏的快速檢測(cè)方法[16-18]。

基于此，本文創(chuàng)新性地應(yīng)用分子模擬技術(shù)設(shè)計(jì)篩選特異性識(shí)別甲磺隆目標(biāo)物的多肽，探索多肽作為識(shí)別元件在檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。應(yīng)用CDOCKER程序運(yùn)行受配體對(duì)接，依據(jù)對(duì)接后蛋白空腔結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵作用氨基酸位置進(jìn)行肽鏈的設(shè)計(jì)，并且應(yīng)用虛擬氨基酸突變對(duì)所設(shè)計(jì)的多肽進(jìn)行優(yōu)化，依據(jù)分子對(duì)接結(jié)果對(duì)多肽初步篩選。應(yīng)用量子點(diǎn)熒光淬滅免疫層析試紙條進(jìn)一步驗(yàn)證模擬結(jié)果并考察試驗(yàn)結(jié)果和模擬結(jié)果的一致性。分子模擬技術(shù)優(yōu)化篩選多肽具有省時(shí)、易制備儲(chǔ)存、成功率高等多種優(yōu)勢(shì)，為快速獲得特異性多肽作為識(shí)別元件建立快捷靈敏的快速檢測(cè)方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲磺隆的多肽序列P14：IAVGARFDDRVWGNISKWRQGMVTQWQS；P31：AILPVRDAYHNSDKFWFWLPKHEQGRGHWAEGYARASGKPGVV；P40：VTPMADAFADGIPMVVFTGQVPTSAIGTDAFQEADVVGISRSCTKWN（純度98%，pH7.4磷酸鹽緩沖液解）：蘇州金唯智生物科技有限公司合成；甲磺?。簢?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羧基水溶性量子點(diǎn)：武漢珈源量子點(diǎn)公司；N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）、鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide，EDC]：美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Precision T7810系列工作站：美國(guó)Dell公司；渦旋混合器（HQ-60）：北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；單道微量可調(diào)移液器、八道微量可調(diào)移液器、臺(tái)式冷凍離心機(jī)（5810R）：德國(guó) Eppendorf公司；加熱磁力攪拌器（RH-KT）：美國(guó) IKA 公司；分析天平（BL610）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；吸水墊、樣品墊、結(jié)合墊：上海金標(biāo)有限公司；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Integral）、酸纖維素膜：美國(guó)Millipore公司；紫外分析儀（ZF1-II）：上海嘉鵬科技有限公司；真空干燥箱（ZK-40RS）：天津三水科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基于分子對(duì)接設(shè)計(jì)多肽

通過(guò)查閱文獻(xiàn)得到甲磺隆作用于乙酰乳酸合成酶，因此在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）中搜索乙酰乳酸合成酶，得到帶有甲磺隆配體分子的乙酰乳酸合成酶的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1T9A、1T9D）。將得到的蛋白質(zhì)導(dǎo)入到DS程序，去除結(jié)構(gòu)中多余亞基、水分子和配體，加氫，大分子模塊下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行清理，之后設(shè)置參數(shù)準(zhǔn)備蛋白質(zhì)。在工具瀏覽器中選擇模擬，對(duì)蛋白質(zhì)施加CHARMm力場(chǎng)。之后選擇“受體-配體相互作用”，在系統(tǒng)視圖中選中整個(gè)蛋白質(zhì)分子，定義該蛋白質(zhì)為受體，并添加活性球。甲磺隆配體分子SDF文件（Conformer 3D_CID_52999）從網(wǎng)站（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載并導(dǎo)入DS程序，在小分子模塊下將該配體進(jìn)行準(zhǔn)備及能量最小化等操作，之后在模擬板塊下對(duì)該配體添加CHARMm力場(chǎng)。

在工具瀏覽器中的受體-配體相互作用一欄選擇CDOCKER對(duì)接，在受體一欄選擇已經(jīng)定義好的受體蛋白（蛋白ID prep：蛋白ID），在配體一欄選擇處理好的配體小分子，設(shè)置構(gòu)象集群半徑為0.5，其余參數(shù)默認(rèn)，點(diǎn)擊運(yùn)行進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接完成后對(duì)蛋白質(zhì)分子添加表面處理，觀察對(duì)甲磺隆有活性的空腔結(jié)構(gòu)，結(jié)合空腔的空間結(jié)構(gòu)和影響受配體相互作用的關(guān)鍵氨基酸設(shè)計(jì)新的多肽。設(shè)計(jì)原則：保留關(guān)鍵作用位點(diǎn)的氨基酸、盡可能保留活性空腔的空間結(jié)構(gòu)。將關(guān)鍵作位點(diǎn)截取后進(jìn)行排列組合，得到新設(shè)計(jì)的多肽。

1.3.2 虛擬氨基酸突變優(yōu)化多肽

為增強(qiáng)多肽的穩(wěn)定性和親和力，通過(guò)虛擬氨基酸突變來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化多肽，將設(shè)計(jì)得到的每一條多肽均進(jìn)行虛擬氨基酸突變。

將所選擇的蛋白-配體復(fù)合物導(dǎo)入DS窗口，在系統(tǒng)視圖中將配體重命名為L(zhǎng)igand。在工具瀏覽器中對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理并且添加CHARMm力場(chǎng)，并且以線性方式顯示每一個(gè)原子，選擇3?范圍內(nèi)的氨基酸進(jìn)行丙氨酸掃描，突變?yōu)楸彼岷笥H和力降低的氨基酸為關(guān)鍵氨基酸。將這些氨基酸繼續(xù)進(jìn)行飽和突變確定關(guān)鍵氨基酸最佳突變類(lèi)型。突變后結(jié)合能沒(méi)有明顯變化或者降低則保持原有結(jié)構(gòu)，突變后結(jié)合能明顯提高的結(jié)構(gòu)保留突變后的結(jié)構(gòu)。

1.3.3 量子點(diǎn)熒光猝滅免疫層析試紙條驗(yàn)證

1.3.3.1 半抗原和包被原的制備

半抗原是指與目標(biāo)分析物的結(jié)構(gòu)相似，并具有反應(yīng)活性基團(tuán)的低分子質(zhì)量的有機(jī)物[19]。在免疫試驗(yàn)中，半抗原的分子設(shè)計(jì)與合成是建立小分子免疫化學(xué)分析方法的關(guān)鍵步驟[20]。甲磺隆結(jié)構(gòu)是由苯磺酰胺和三嗪環(huán)兩部分組成，本文根據(jù)苯磺酰胺部分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行甲磺隆半抗原的設(shè)計(jì)與合成[21]。

稱(chēng)取5.25 mg甲磺隆半抗原、4.12 mg DCC和2.3 mg NHS置于小棕瓶中，加入200 μL N，N-二甲基甲酰胺將其攪拌溶解，磁力攪拌常溫（20℃～25℃）過(guò)夜（約12 h），即得A液；將20 mg KLH置于25 mL圓底燒瓶中，溶解于4 mL、0.13 mol/L NaHCO3緩沖溶液中，即得B液；將A液緩慢滴加到反應(yīng)液B中，邊滴加邊攪拌，室溫（20℃～25℃）下反應(yīng)3 h。反應(yīng)后將上清液置于透析袋中，在4℃下用磷酸鹽緩沖液透析3 d，每8 h換一次透析液。透析后，得到包被原[7]。

1.3.3.2 膠體金及金標(biāo)多肽探針的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[22]后，取膠體金溶液1mL置于1.5 mL進(jìn)口安道管中，加入20 μL K2CO3（0.2 mol/L）和10μL多肽（1 mg/mL），混合均勻后，避光靜置于4℃冰箱1 h；加入20%BSA溶液和10%PEG 20000溶液來(lái)封閉膠體金及穩(wěn)定金標(biāo)多肽，靜置30 min；之后在4℃、2 000 r/min條件下離心15 min，以除去未能與多肽連接的膠體金，取上清液，在4℃、8 000 r/min條件下離心30 min，得到沉淀（金標(biāo)多肽），pH7.4 PBS復(fù)溶后，4℃冰箱避光保存。

1.3.3.3 量子點(diǎn)-BSA的制備

采用活化酯法偶聯(lián)羧基化水溶性量子點(diǎn)與BSA[23]。取25 μL量子點(diǎn)溶液于1.5 mL的安道管中，加入硼酸鹽緩沖液（pH7.4）配制成的 2 mg/mL EDC 溶液 6 μL，攪拌均勻；加入 30 μL、10 mg/mLBSA 溶液，用硼酸鹽緩沖液（pH7.4）將混合溶液的總體積補(bǔ)至 200 μL，將安道管置于搖床上反應(yīng)3 h；應(yīng)用超濾離心管在4℃、8 000 r/min的條件下濃縮3次，每次離心15 min，得到的濃縮物用硼酸鹽緩沖液（pH7.4）復(fù)溶后置于4℃冰箱避光保存。

1.3.3.4 量子點(diǎn)熒光淬滅免疫層析試紙條組裝及檢測(cè)

量子點(diǎn)熒光淬滅免疫層析試紙條[24]組裝示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 量子點(diǎn)熒光淬滅免疫層析試紙條組裝示意圖Fig.1 The assembly diagram of QDs fluorescence quenching immunochromatographic strip

如圖1所示，硝酸纖維素膜、吸水墊、結(jié)合墊和樣品墊依次粘貼在PVC背板上。將量子點(diǎn)-BSA、量子點(diǎn)-BSA與包被原混合物分別在硝酸纖維素膜上劃線，作為試紙條的C線（質(zhì)控線）和T線（檢測(cè)線）。T線上包被原稀釋倍數(shù)為2倍；T線和C線上量子點(diǎn)-BSA為稀釋2倍。在對(duì)照組（不添加目標(biāo)物）和試驗(yàn)組（添加1 mg/L甲磺隆溶液100 μL）中，分別添加等量的金標(biāo)多肽探針，混合均勻后滴加到試紙條的樣品墊處，10 min后，在紫外燈下觀察C、T線的熒光強(qiáng)度（每組試驗(yàn)做3組平行，重復(fù)3次）。

C線作為質(zhì)控線來(lái)判斷試紙條的有效性而一直有熒光，而對(duì)照組中的T線由于未添加目標(biāo)物，其熒光強(qiáng)度應(yīng)明顯低于試驗(yàn)組。這是因?yàn)樵趯?duì)照組中，不添加目標(biāo)物，緩沖液與探針由毛細(xì)管作用力向上層析到達(dá)T線，從而使T線上的量子點(diǎn)與膠體金發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移[25]，熒光強(qiáng)度減弱或熒光淬滅；在試驗(yàn)組中加入目標(biāo)物，探針會(huì)先與目標(biāo)物作用，使層析到T線的探針減少，從而熒光強(qiáng)度相比于對(duì)照組要更強(qiáng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于分子模擬設(shè)計(jì)多肽

應(yīng)用分子模擬技術(shù)將下載的蛋白分別與甲磺隆小分子進(jìn)行對(duì)接，根據(jù)蛋白與配體對(duì)接的空腔結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵相互作用氨基酸進(jìn)行多肽的截取及結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)。圖2為蛋白1T9A和蛋白1T9D分別與甲磺隆的分子對(duì)接結(jié)果。

如圖2所示，在蛋白1T9A中，依據(jù)蛋白與配體對(duì)接結(jié)果設(shè)計(jì)P1～P4四條多肽；在蛋白1T9D中，依據(jù)蛋白與配體對(duì)接結(jié)果設(shè)計(jì)出P5～P30共26條多肽。肽鏈初篩序列及其分子對(duì)接能量打分值結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 蛋白1T9A和蛋白1T9D與甲磺隆對(duì)接的晶體結(jié)構(gòu)及其相互作用示意圖Fig.2 Crystal structure and interaction diagram of protein 1T9A and 1T9D docking with metsulfuron-methyl

表1 肽鏈初篩序列及其分子對(duì)接能量打分值結(jié)果Table 1 Preliminary screening sequence of peptide chain and results of molecular docking energy score

由表1可知，30條多肽與甲磺隆配體運(yùn)行CDOCKER，對(duì)接結(jié)果皆良好。

2.2 運(yùn)行虛擬氨基酸突變并構(gòu)建多肽庫(kù)

為獲得親和力和穩(wěn)定性更加優(yōu)異的多肽，運(yùn)行虛擬氨基酸突變對(duì)多肽進(jìn)一步優(yōu)化。在表1中選擇結(jié)合能較好的P1～P4以及P16、P17這6條多肽鏈進(jìn)行突變。其中P3、P4、P16三條鏈突變之后結(jié)合能不變，因此保留原有結(jié)構(gòu)。對(duì)P1進(jìn)行多點(diǎn)飽和突變，當(dāng)L3突變?yōu)?W3、N12 突變?yōu)?R12、Q16 突變?yōu)?W16、A26 突變?yōu)?W26，即 DMWGMHGCATARLAVWNADLIIAVGWPFDDR時(shí)，結(jié)合能為 -44.883 6 kCal/mol；對(duì) P2進(jìn)行多點(diǎn)飽和突變，當(dāng)I4突變?yōu)閅4、T16突變?yōu)閃16、E21突變?yōu)閃21、E22突變?yōu)?R22，即 ADLYIAVGARFDDRVWGNISWRQGMVTQWQS時(shí)，結(jié)合能為-54.568 2 kCal/mol；對(duì)P17進(jìn)行多點(diǎn)飽和突變，當(dāng)Y10突變?yōu)?R10、I13突變?yōu)?Y13、N20突變?yōu)?W20、V22突變?yōu)閃22、A30突變?yōu)镽30，即YPGGAILPVRDAYHNSDKFWFWLPKHEGRGHWAEGYARASGKPGVV時(shí)，結(jié)合能-53.457 6 kCal/mol。

比較突變前的6條多肽和突變后的3條多肽的結(jié)合能，P3＞P17＞P1＞突變后的 P1＞P4＞P2＞P16＞突變后的P17＞突變后的P2，根據(jù)能量越低，多肽越穩(wěn)定的原則，依次選出突變后的P2、突變后的P17和P16分別命名為S1、S2和S3，結(jié)果如表2所示，應(yīng)用量子點(diǎn)熒光淬滅免疫層析試紙條方法進(jìn)行實(shí)際驗(yàn)證。

表2 肽鏈初篩序列及其分子對(duì)接能量打分值結(jié)果Table 2 Preliminary screening sequence of peptide chain and results of molecular docking energy score

2.3 量子點(diǎn)熒光淬滅免疫層析試紙條驗(yàn)證模擬結(jié)果

基于膠體金對(duì)于量子點(diǎn)的熒光淬滅作用及目標(biāo)物和包被原之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，建立基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的量子點(diǎn)熒光淬滅免疫層析試紙條，利用紫外燈照射下的對(duì)照組和試驗(yàn)組之間的熒光強(qiáng)度差異來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證多肽在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。

在其他條件相同的情況下，將3條多肽與膠體金進(jìn)行偶聯(lián)，合成3種熒光探針。應(yīng)用同一批提前制備好的試紙條同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與分子模擬結(jié)果的一致性，結(jié)果如圖3所示。

圖3 量子點(diǎn)熒光淬滅免疫層析法驗(yàn)證多肽的有效性Fig.3 Verification of the effectiveness of polypeptides by QDs fluorescence quenching immunochromatography

如圖3所示，相對(duì)于原始組，3條多肽在T線上的熒光強(qiáng)度均有所下降；而相比較對(duì)照組，3條多肽在T線上的熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，此結(jié)果表明3條多肽均能成功識(shí)別目標(biāo)物，使能夠?qū)游龅絋線的探針減少，使與T線上包被原結(jié)合的探針減少，不能夠大量猝滅T線上的量子點(diǎn)，導(dǎo)致T線的熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組。多肽S1制備出的熒光探針T線的熒光強(qiáng)度更亮，說(shuō)明在其他條件相同的情況下，相比于其他兩條鏈，S1和目標(biāo)物的識(shí)別能力更加優(yōu)異，使得更多的探針與目標(biāo)物結(jié)合，更少的探針得以進(jìn)一步層析到T線淬滅量子點(diǎn)。在分子模擬的結(jié)果中，S1與目標(biāo)物的對(duì)接結(jié)果也更加優(yōu)異，結(jié)合能更低，肽鏈更加穩(wěn)定，這表明模擬結(jié)果與實(shí)際驗(yàn)證結(jié)果具有良好的一致性，可以得出分子模擬優(yōu)化篩選得到的多肽可以作為識(shí)別元件應(yīng)用到實(shí)際的檢測(cè)當(dāng)中。

3 結(jié)論

應(yīng)用分子模擬技術(shù)依據(jù)受配體相互作用的空腔結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵相互作用氨基酸，創(chuàng)新性的對(duì)多肽進(jìn)行設(shè)計(jì)，運(yùn)行虛擬氨基酸突變對(duì)設(shè)計(jì)得到的多肽進(jìn)行突變，得到對(duì)接結(jié)果更加優(yōu)異的30條多肽并且自建多肽庫(kù)（P1～P30）。依據(jù)最終的對(duì)接自由能從中初步篩選出S1、S2、S3三條結(jié)合能更小、肽鏈更穩(wěn)定的多肽，應(yīng)用量子點(diǎn)熒光淬滅免疫層析試紙條方法進(jìn)一步驗(yàn)證3條多肽作為識(shí)別元件的可應(yīng)用性以及實(shí)際驗(yàn)證結(jié)果與分子模擬結(jié)果的一致性。驗(yàn)證結(jié)果表明分子模擬技術(shù)設(shè)計(jì)出的多肽能夠成功識(shí)別目標(biāo)物，并且實(shí)際驗(yàn)證結(jié)果和模擬結(jié)果具有良好的一致性，均是S1的表現(xiàn)更加優(yōu)異。本試驗(yàn)方法成功優(yōu)化篩選出可識(shí)別甲磺隆目標(biāo)物的多肽，為今后其他目標(biāo)物的多肽篩選工作提供參考。