STAT3/iNOS通路在慢性阻塞性肺疾病伴氣道重塑中的作用▲

喬 迪 胡 赤 吳 玨 李秋艷 吳 濤 樊 君

(1 昆明同仁醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南省昆明市 650228； 2 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院心血管內(nèi)科，云南省昆明市 650024 )

隨著社會(huì)工業(yè)化和人口老齡化的加劇，慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的患病率顯著上升，其已成為全球最主要的死亡病因之一，也是我國(guó)第三大死亡病因[1]。由于氣道和肺部長(zhǎng)期受到有害顆?；驓怏w的刺激，肺部及支氣管中異常炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，這最終導(dǎo)致COPD的發(fā)生，嚴(yán)重者可危及生命[2]。其中，卷煙煙霧中的有害顆粒和氣體是引起COPD的主要危險(xiǎn)因素[3]。信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)信號(hào)通路可調(diào)控多種生物進(jìn)程[4]，其中iNOS作為STAT3的下游因子，可進(jìn)一步促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平升高，引起氣道壁增厚，進(jìn)而導(dǎo)致氣道重塑，引起COPD的發(fā)生[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)肺益腎方可能夠通過(guò)抑制STAT3的磷酸化，從而改善COPD[6]。而iNOS是治療嚴(yán)重肺氣腫和肺動(dòng)脈高壓的潛在新靶點(diǎn)之一[7]。但是，STAT3/iNOS通路在COPD氣道重塑中的作用機(jī)制如何，相關(guān)研究較少。本研究構(gòu)建COPD大鼠模型，并使用STAT3特異性抑制劑Stattic進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)使用含3.0%香煙煙霧提取物的細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞，構(gòu)建體外細(xì)胞模型，并沉默細(xì)胞STAT3的表達(dá)，檢測(cè)動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中相關(guān)炎性因子的表達(dá)水平，探討STAT3/iNOS通路在COPD伴氣道重塑中的作用，以期為COPD伴氣道重塑患者的臨床治療提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只無(wú)特定病原體級(jí)雄性Wistar大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK(川)2019-028]，體質(zhì)量200～210 g，6～7周齡，置于溫度為(20±2)℃、濕度為50%～60%、12 h光暗循環(huán)的環(huán)境中喂養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定，按照3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷照顧。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、主要試劑和儀器 大鼠支氣管上皮細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。STAT3特異性抑制劑Stattic(Medchem Express公司；規(guī)格：100 mg；批號(hào)：M00248)，醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33020822)，紅塔山牌香煙(焦油含量11 mg/支、一氧化碳含量11 mg/支、煙堿含量1.1 mg/支；紅塔集團(tuán)玉溪卷煙廠，批號(hào)：210104)，RNA小干擾陰性對(duì)照載體質(zhì)粒(si-NC)及RNA干擾STAT3載體質(zhì)粒(si-STAT3)由生工生物工程(上海)股份有限公司構(gòu)建，瑞氏-姬姆薩染色試劑盒(北京西華儀器科技有限公司，批號(hào)：M382537)，大鼠分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)、分泌成分(secretory component，SC)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)ELISA試劑盒(上海潤(rùn)裕生物科技有限公司，批號(hào)：ry010580、ry063287、ry064258、ry076305)；十二烷基硫酸鈉、脂多糖、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Sigma Aldrich Lab & Production Materials公司，批號(hào)：L3771、SMB00704、NPT01、11483188001、QR0100)，RNA提取試劑盒、蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司，批號(hào)：RCH003、ZLI-9018、36208ES60、K-PRTD2FS)，4%多聚甲醛(武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)：G1101)，胎牛血清、DMEM和HE染色試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號(hào)：E510002、E600008、E607318]，STAT3、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3，p-STAT3)、iNOS、GAPDH兔單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(Abcam公司，批號(hào)：ab32500、ab76315、ab178945、ab181602、ab133470)。尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡(上海普赫生物科技有限公司)，F(xiàn)LUOstar Omega型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(BMG LABTECH公司)，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP(山東三瑞科技有限公司)，石蠟切片機(jī)(湖北惠達(dá)儀器有限公司)，自制熏煙箱(規(guī)格：50 cm×50 cm×50 cm)，SNH-Ⅲ型真空抽氣泵(上海將來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 COPD大鼠模型的構(gòu)建與分組：將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、STAT3抑制劑組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠采用氣管滴注脂多糖加煙熏法[8]構(gòu)建COPD大鼠模型。在實(shí)驗(yàn)的第1天和第15天，向各組大鼠氣管內(nèi)注入濃度為1 g/mL的脂多糖溶液0.2 mL；在實(shí)驗(yàn)的第2～14天和第16～28天在煙熏箱中點(diǎn)燃12支香煙(燃燒30 min)，使煙熏箱內(nèi)的煙霧濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，然后將各組大鼠放入自制煙熏箱中，30 min/次，2次/d，兩次需間隔2 h。從實(shí)驗(yàn)的第29天開(kāi)始，給予STAT3抑制劑組大鼠尾靜脈注射500 μg/kg的STAT3特異性抑制劑Stattic[9]，每7 d注射1次；給予陽(yáng)性對(duì)照組大鼠按10 mL/kg灌胃醋酸地塞米松溶液(稱(chēng)取10.7 μg醋酸地塞米松片，使用10 mL生理鹽水溶解)[10]，1次/d；對(duì)照組和模型組按10 mL/kg灌胃生理鹽水，1次/d。4組連續(xù)干預(yù)28 d。

1.3.2 支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與分組：(1)參照陳翠芬等[11]的方法制備香煙煙霧提取物。使用真空抽氣泵將燃燒的20支香煙煙霧吸到含DMEM的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，劇烈晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使煙霧充分溶解，呈咖啡樣色；用氫氧化鈉將含有煙霧的溶液的pH值調(diào)整為7.4左右，再用0.45 μm過(guò)濾器(杭州凱英儀器經(jīng)營(yíng)部，型號(hào)：13 mm×0.45 μm)過(guò)濾煙霧溶液，所得溶液即為香煙煙霧提取物原液，使用DMEM將香煙煙霧提取物原液稀釋至所需濃度待用。(2)使用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)大鼠支氣管上皮細(xì)胞，并將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)75%時(shí)，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，接種至6孔板中，2 mL/孔，然后將細(xì)胞隨機(jī)為正常組、模型組、si-NC組、si-STAT3組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，使用Lipofectamine 2000試劑盒將載體質(zhì)粒si-NC轉(zhuǎn)染si-NC組細(xì)胞、載體質(zhì)粒si-STAT3轉(zhuǎn)染si-STAT3組，模型組和正常組細(xì)胞不給予干預(yù)。轉(zhuǎn)染24 h后，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[11]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用含3.0%香煙煙霧提取物的DMEM培養(yǎng)模型組、si-NC組和si-STAT3組的細(xì)胞，使用DMEM培養(yǎng)正常組細(xì)胞，各組均置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 計(jì)數(shù)大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量及其他分類(lèi)細(xì)胞比例：末次給藥結(jié)束后，即刻通過(guò)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉4組大鼠，開(kāi)胸分離大鼠氣管、支氣管、肺組織，結(jié)扎主支氣管，于4 ℃條件下，用連接注射器的灌洗器通過(guò)左、右側(cè)支氣管分別向左、右側(cè)肺葉中注入2 mL生理鹽水，緩慢抽吸3次，負(fù)壓吸出，收集各組大鼠肺泡灌洗液，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，收集沉淀，使用200 μL PBS溶液重懸，制成20 μL懸液。參照黃莉容等[12]的方法，首先在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后使用瑞氏-姬姆薩染色試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行染色，進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)200個(gè)細(xì)胞中其他分類(lèi)細(xì)胞所占比例，其他分類(lèi)細(xì)胞包括單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。其中，單核巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染成灰藍(lán)色，細(xì)胞核呈馬蹄形并染成紫藍(lán)色；淋巴細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核致密并染成深紫色；中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核呈分葉狀并染成紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)幾乎無(wú)色；嗜酸性粒細(xì)胞體積略大，細(xì)胞核呈紫色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

1.4.2 觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化：灌洗結(jié)束后，對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死，取出大鼠肺組織，將右肺迅速置于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將左肺迅速置于4%多聚甲醛中固定。取固定24 h后的左肺組織行石蠟包埋，使用切片機(jī)制成厚度為4 μm的切片，然后嚴(yán)格按照HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)，依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木素染色、分化液分化、伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固等操作，將封固后的切片在室溫下晾干，于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.4.3 測(cè)量大鼠支氣管管壁面積及支氣管平滑肌厚度：取1.4.2中各組大鼠肺組織切片，于400倍光學(xué)顯微鏡下，挑選出有完整橫斷面的中小支氣管，采用Image J軟件測(cè)定支氣管平滑肌面積、支氣管管腔內(nèi)周長(zhǎng)、支氣管壁面積，計(jì)算支氣管平滑肌厚度，支氣管平滑肌厚度=支氣管平滑肌面積/支氣管管腔內(nèi)周長(zhǎng)。

1.4.4 檢測(cè)大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量：取1.4.2中置于-80 ℃冰箱的大鼠部分肺組織，嚴(yán)格按照 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)肺組織中的SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量。

1.4.5 檢測(cè)大鼠肺組織中STAT3和iNOS蛋白表達(dá)水平：取1.4.2中置于-80 ℃冰箱的剩余肺組織，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，采用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，將蛋白煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE，再將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h，PBS洗膜4次，10 min/次，然后加入稀釋后的p-STAT3(稀釋比為1 ∶2 000)、STAT3(稀釋比為1 ∶2 000)、iNOS(稀釋比為1 ∶2 000)和GAPDH兔單克隆抗體(稀釋比為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜4次，10 min/次，使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋比為1 ∶5 000)室溫孵育PVDF膜2 h，PBS洗膜4次，10 min/次，用ECL顯色試劑盒顯色。以GAPDH為內(nèi)參，采用全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.6 檢測(cè)各組細(xì)胞的白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α、STAT3、iNOS mRNA表達(dá)水平：使用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，用無(wú)RNA酶的雙蒸水定量RNA后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA。以cDNA為模板，按照說(shuō)明書(shū)配置PCR的反應(yīng)體系，包括2×SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 10 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL，共20 μL。設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法，計(jì)算各組細(xì)胞白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、STAT3、iNOS mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。各引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey′s檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其他分類(lèi)細(xì)胞比例 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞比例均升高，而單核巨噬細(xì)胞比例降低(均P<0.05)；與模型組相比，STAT3抑制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞比例均降低，而單核巨噬細(xì)胞比例升高(均P<0.05)；STAT3抑制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其他分類(lèi)細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其他分類(lèi)細(xì)胞比例的比較(x±s)

2.2 4組大鼠肺組織的病理學(xué)變化 對(duì)照組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)正常，上皮結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠的肺組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞脫落，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)張；STAT3抑制劑組與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，上皮細(xì)胞脫落有所改善，肺泡腔較為規(guī)則，兩組肺組織病理學(xué)變化差異不明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠的肺組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

2.3 4組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度的比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度均增加(均P<0.05)；與模型組相比，STAT3抑制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度均減小(均P<0.05)；STAT3抑制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度的比較(x±s)

2.4 4組大鼠肺組織中的SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量的比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量均升高(均P<0.05)；與模型組相比，STAT3抑制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量均降低(均P<0.05)；STAT3抑制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量的比較(x±s)

2.5 4組大鼠肺組織中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表達(dá)水平的比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；與模型組相比，STAT3抑制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)；STAT3抑制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)圖2和表5。

表5 4組大鼠肺組織中的STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

圖2 4組大鼠肺組織中STAT3、p-STAT3、iNOS蛋白表達(dá)的Western blot圖

2.6 4組細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達(dá)水平的比較 與正常組比較，模型組和si-NC組大鼠支氣管上皮細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；與模型組和si-NC組比較，si-STAT3組大鼠支氣管上皮細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 4組細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

隨著霧霾等環(huán)境污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，COPD的患病率和病死率居高不下，對(duì)公眾健康造成嚴(yán)重威脅，全球每年約有300萬(wàn)人死于COPD，而在中國(guó)COPD的總病死率位居第三位[13]。因此，預(yù)防和治療COPD尤為重要。COPD是一種慢性炎癥性疾病，主要影響氣道及肺臟，可引發(fā)多種并發(fā)癥，包括心血管疾病、肺癌、骨質(zhì)疏松、焦慮癥等[14]。氣道重塑是COPD持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素，其病理基礎(chǔ)包括上皮細(xì)胞損傷、炎性因子浸潤(rùn)、支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度增加等。Vasilescu等[15]發(fā)現(xiàn)，COPD患者的支氣管壁面積和支氣管厚度顯著增加，發(fā)生氣道重塑，而長(zhǎng)期氣道重塑可進(jìn)一步導(dǎo)致支氣管哮喘等其他肺部并發(fā)癥的發(fā)生。本研究通過(guò)使用氣管滴注脂多糖加煙熏法構(gòu)建COPD大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮組織脫落，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)張，支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度均增加，這提示COPD大鼠模型構(gòu)建成功，且大鼠已發(fā)生氣道重塑。

COPD的炎癥反應(yīng)主要涉及中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞[16]，同時(shí)，氣道上皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞也參與這一過(guò)程，而炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是中性粒細(xì)胞的激活及聚集，且伴隨SIgA、SC、TGF-β1含量的升高[17]。其中，TGF-β1是氣道炎癥發(fā)展成氣道重塑的關(guān)鍵因子；SIgA可作為呼吸道疾病的評(píng)估指標(biāo)，當(dāng)病原體侵入和氣道炎癥發(fā)生時(shí)，其含量持續(xù)升高[18]；而SC與其配體IgA結(jié)合后形成SIgA；VEGF水平升高，可使氣道壁增厚，進(jìn)而引起COPD的發(fā)生[5]。此外，有研究表明，STAT3/iNOS信號(hào)通路參與細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[19]。本研究結(jié)果顯示，COPD伴氣道重塑大鼠肺泡灌洗液中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞比例增加，而單核巨噬細(xì)胞比例降低，且肺組織中的SIgA、SC、TGF-β1、VEGF含量，以及STAT3磷酸化水平、iNOS蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)。這提示COPD伴氣道重塑大鼠的肺組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)STAT3/iNOS信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能夠抑制煙霧誘發(fā)的氣道上皮細(xì)胞和支氣管周?chē)准?xì)胞數(shù)量增加及磷酸化STAT3表達(dá)上調(diào)[20]；甘草、苦參、椴素草本聯(lián)合治療能夠通過(guò)影響COPD小鼠模型中STAT3信號(hào)通路，抑制中性粒細(xì)胞引起的肺部炎癥，降低肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及iNOS表達(dá)水平，從而發(fā)揮治療氣管炎癥性疾病的作用[21-22]。以上研究表明，抑制STAT3或iNOS的表達(dá)，有助于控制呼吸系統(tǒng)炎癥，結(jié)合COPD伴氣道重塑時(shí)STAT3/iNOS信號(hào)通路處于激活狀態(tài)的這一結(jié)果，我們推測(cè)抑制STAT3/iNOS信號(hào)通路的表達(dá)或可緩解COPD伴氣道重塑的相關(guān)表現(xiàn)。本研究采用STAT3特異性抑制劑Stattic干預(yù)COPD伴氣道重塑大鼠，結(jié)果顯示Stattic干預(yù)可改善COPD伴氣道重塑大鼠的肺組織病理學(xué)變化，降低其肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞比例，并提高單核巨噬細(xì)胞比例，減小支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度，下調(diào)肺組織中SIgA、SC、TGF-β1、VEGF含量，STAT3磷酸化水平，以及iNOS蛋白表達(dá)水平，這提示抑制STAT3/iNOS信號(hào)通路的活性可降低COPD大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)，并改善其氣道重塑。

為進(jìn)一步觀察STAT3/iNOS信號(hào)通路在香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD伴氣道重塑中的作用，本研究采用干擾技術(shù)沉默大鼠支氣管上皮細(xì)胞STAT3的表達(dá)，結(jié)果顯示，經(jīng)3.0% 香煙煙霧提取物誘導(dǎo)后，大鼠支氣管上皮細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達(dá)水平均升高(均P<0.05)，這提示香煙煙霧可誘導(dǎo)大鼠支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，且STAT3/iNOS信號(hào)通路可能處于激活狀態(tài)；而沉默STAT3表達(dá)后，大鼠支氣管上皮細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們認(rèn)為STAT3/iNOS信號(hào)通路可能參與香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD伴氣道重塑及炎癥反應(yīng)，而抑制STAT3/iNOS信號(hào)通路的活性可以減輕COPD伴氣道重塑大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)，改善氣道重塑。

綜上所述，在香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD伴氣道重塑中STAT3/iNOS信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，而抑制該通路的激活可減輕肺組織和支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，改善氣道重塑，這或可為COPD伴氣道重塑的治療提供新的靶點(diǎn)。但是STAT3/iNOS信號(hào)通路在COPD伴氣道重塑中的作用機(jī)制較為復(fù)雜，尚需進(jìn)一步研究。