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    豬鏈球菌2型HNB-LAMP檢測方法的建立

    2023-01-30 11:47:16席小燕陳家享梁嘉雯伍嘉慧段昌平陳家苑
    韶關(guān)學(xué)院學(xué)報 2022年12期
    關(guān)鍵詞:凝膠電泳瓊脂糖豬鏈球菌

    席小燕,陳家享,梁嘉雯,林 蝶,伍嘉慧,段昌平,陳家苑, 彭 凌

    (1.韶關(guān)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,廣東 韶關(guān) 512026;2.韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 韶關(guān) 512005)

    豬鏈球菌(Streptococcus suis)是一種重要的人畜共患病病原體,可引起豬和人的腦膜炎、敗血癥、肺炎等嚴(yán)重的臨床疾?。?-2]. 豬鏈球菌病成了養(yǎng)豬業(yè)及豬肉行業(yè)中的一種職業(yè)病,在東南亞國家,普通人群面臨的風(fēng)險主要是由于與動物的密切接觸或食用生豬肉產(chǎn)品[3-5]. 到目前為止,已鑒定出33個豬鏈球菌血清型(1~31、1/2和33)[6-8],最常見的是從全世界豬和人的臨床病例中分離出來血清型2型[9-11].

    快速準(zhǔn)確檢測豬鏈球菌2型對于這種感染的早期診斷和治療非常重要,但常用的細(xì)菌培養(yǎng)方法分離和鑒定耗時;基于PCR的檢測方法表現(xiàn)出對豬鏈球菌的高度敏感和特異,但需要昂貴的儀器、復(fù)雜的技術(shù)和煩瑣的操作,不適合現(xiàn)場檢測和基層推廣[12-14]. 因此,迫切需要建立一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測豬鏈球菌2型的方法. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)法是Notomi等人開發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法[15],不需要進(jìn)行煩瑣的變性、延伸、退火等溫度變化的過程,只需恒溫操作,無需借助PCR儀,擴(kuò)增產(chǎn)物可以經(jīng)過直接觀察沉淀量或者加入染料觀察顏色改變等進(jìn)行檢測,很適合基層使用.

    筆者選擇2型豬鏈球菌cps2J基因序列設(shè)計篩選LAMP引物組,通過體系優(yōu)化建立檢測方法,同時考慮到LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法多樣且檢測的結(jié)果可能受到各種因素的影響[16],在豬鏈球菌2型LAMP方法建立中比較了肉眼觀察沉淀、瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ以及羥基萘酚藍(lán)(HNB)等檢測方法的敏感性,建立了豬鏈球菌2型“量身定制”的快速LAMP檢測方法.

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    實驗所用菌株均為實驗室保存. 12株經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)血清和血清型特異PCR鑒定的豬鏈球菌血清型1、2、7和9型(2型9株,其它血清型各1株). 另有5株陰性對照菌株:豬丹毒絲菌、副豬嗜血桿菌、豬鼻支原體、胸膜肺炎放線桿菌、肺炎鏈球菌. Taq PCR Master Mix、dNTPs、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒(B518225)、8 U Bst DNA聚合酶等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司.

    1.2 引物的設(shè)計和合成

    根據(jù)GenBank公布的豬鏈球菌2型的cps2J基因的保守序列,采用在線引物設(shè)計 軟 件(https://LAMP.neb.com)設(shè) 計LAMP引 物,另外,根據(jù)cps2J基因的保守序列設(shè)計特異的PCR檢測引物,序列見表1,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

    表1 引物序列設(shè)計

    1.3 DNA提取

    過夜培養(yǎng)的菌液取1 mL,離心收集菌體按照“1.1”試劑盒的說明書提取各樣品基因組DNA.

    1.4 LAMP 反應(yīng)體系條件的優(yōu)化

    25 μL初 始 反 應(yīng) 體 系:10×Thermo-Pol buffer 2.5 μL,100 mmol·L-1的MgSO41.5 μL,10 mmol·L-1dNTPs 3.5 μL,40 μmol·L-1內(nèi)引物(FIP/ BIP)各1 μL,5 μmol·L-1外引物(F3/B3)各1 μL(引物濃度比8∶1),20 μmol·L-1環(huán)引物(LF/LB)1 μL,8 U Bst DNA 聚合酶1 μL,3 mmol·L-1的HNB 1 μL,剩余用水補(bǔ)足,混勻. 65 ℃恒溫反應(yīng)1 h,80 ℃滅活10 min. 同時以無核酸水作為陰性對照. 在此反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件,使用從豬鏈球菌2型菌株提取的DNA作為模板,對孵育溫度(60~65 ℃)、反應(yīng)時間(20~80 min)、鎂離子濃度(2~10 mmol·L-1)、dNTPs 濃度(1~5 mmol·L-1)和引物濃度比(FIP/BIP∶F3/B3)等條件進(jìn)行優(yōu)化.

    1.5 LAMP產(chǎn)物分析

    (1)肉眼觀察沉淀. LAMP反應(yīng)結(jié)束后,5 000 r·min-1離心數(shù)秒后,若出現(xiàn)白色沉淀則被認(rèn)為是陽性.

    (2)瓊脂糖凝膠電泳. LAMP反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶,如果樣本顯示出典型的階梯狀帶型,則被認(rèn)為是陽性.

    (3)SYBR Green Ⅰ檢測. LAMP反應(yīng)后,加入1 μL SYBR Green Ⅰ,如果溶液變成綠色,則為陽性;如果溶液變成橙色,則為陰性[16].

    (4)HNB檢測. HNB被預(yù)先加入LAMP系統(tǒng)(終濃度120 μmol·L-1),觀測顏色,天藍(lán)色為陽性,紫色為陰性[16].

    1.6 LAMP敏感性

    豬鏈球菌2型菌株的培養(yǎng)菌液經(jīng)計數(shù)后進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-7(原始濃度為8×106CFU·μL-1),稀釋菌液煮沸10 min后各取1 μL上清作為模板按優(yōu)化體系和條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,分別采用肉眼觀察沉淀、瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ 和HNB等對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,比較它們的檢測敏感性,同時以無核酸水作為陰性對照. 為評估LAMP的敏感性,同時采用普通PCR檢測上述梯度的模板(即用普通PCR檢測法來進(jìn)行比較),PCR反應(yīng)體系25 μL:Taq PCR Master Mix 12.5 μL,10 μmol·L-1的引物各1 μL;擴(kuò)增程序:94 ℃,5 min;94 ℃,45 s;54 ℃,30 s;72 ℃,60 s,循環(huán)30次;最后72 ℃延伸10 min,產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測.

    1.7 LAMP特異性

    采用優(yōu)化好的LAMP體系,對12株豬鏈球菌和5株陰性對照菌株的基因組DNA,進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,驗證該方法鑒定出豬鏈球2型菌株的特異性.

    1.8 臨床樣本檢測

    采集豬的組織作為檢測樣品. 樣品預(yù)處理:剪成小塊后加入少量PBS緩沖液經(jīng)研缽研碎,加PBS稀釋,煮沸 10 min,靜置或離心后,上清液可以作為檢測模板.

    2 結(jié)果

    2.1 LAMP最優(yōu)反應(yīng)體系條件

    在不同 條件下 進(jìn)行了 實 驗,最 終確 定 最優(yōu) 反 應(yīng)體 系 條件為:100 mmol·L-1的MgSO42.5 μL, 10 mmol·L-1dNTPs 4.0 μL,10×Thermo-Pol buffer 2.5 μL,30 μmol·L-1內(nèi)引物(FIP/BIP)各1 μL, 5 μmol·L-1外引物(F3/B3)各1 μL(引物濃度比6∶1),20 μmol·L-1環(huán)引物(LF/LB)1 μL,8 U Bst DNA 聚合酶 1 μL,3 mmol·L-1的HNB 1 μL,剩余用水補(bǔ)足,混勻. 61 ℃恒溫反應(yīng)50 min,80 ℃滅活10 min.

    2.2 4種LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法的敏感性

    各稀釋度模板經(jīng)LAMP擴(kuò)增后,各管經(jīng)離心,在100~10-5稀釋度可見明顯沉淀,在10-6~10-7稀釋度未見肉眼可以沉淀. 各稀釋度LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在100~10-6稀釋度均可以看到典型的梯度條帶,在10-7稀釋度未見條帶. LAMP擴(kuò)增完成后加入SYBR Green Ⅰ顯色,在100~10-6稀釋度顯出綠色,在10-7稀釋度顯橙色. 在HNB檢測中,預(yù)先在各稀釋度檢測管加入3 mmol·L-1HNB 1 μL,反應(yīng)結(jié)束后在100~10-6稀釋度顯天藍(lán)色,在10-7稀釋度顯紫色(圖1 A~D). 由此可見采用瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ、HNB對產(chǎn)物進(jìn)行檢測的敏感性相當(dāng),均為8 copies/反應(yīng),而肉眼觀察沉淀的敏感性為80 copies/反應(yīng). 圖1 E為普通PCR檢測的敏感性,僅100~10-4稀釋度可見目的條帶,而10-5~10-7稀釋度未擴(kuò)增,可見其敏感性為800 copies/反應(yīng).

    圖1 LAMP不同檢測方法及普通PCR檢測的敏感性比較

    2.3 LAMP特異性

    為評估LAMP的特異性,用優(yōu)化的HNB-LAMP檢測系統(tǒng)來擴(kuò)增菌株提取的DNA. 所有9株豬鏈球菌2型菌株均呈天藍(lán)色,而其他豬鏈球菌血清型菌株和陰性對照菌均呈紫色,見圖2,表明實驗建立的cps2J-HNB-LAMP對豬鏈球菌2型具有高度特異性.

    圖2 LAMP特異性檢測

    2.4 臨床樣品檢測

    對10份臨床樣品進(jìn)行檢測, 結(jié)果表明其中5份樣品LAMP檢測為陽性,而普通PCR檢測全為陰性.

    3 討論

    近年來,基于PCR技術(shù)的分子檢測可用于檢測豬鏈球菌2型,但不適合基層推廣使用. 而LAMP檢測有優(yōu)勢,已被廣泛用于病原檢測,筆者建立了豬鏈球菌2型HNB-LAMP檢測方法,并比較了4種方法對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測敏感性.結(jié)果發(fā)現(xiàn),4種方法檢測敏感性均高于普通PCR檢測,其中肉眼觀察沉淀法敏感性最低,其它3種方法敏感性相當(dāng),但瓊脂糖凝膠電泳法需借助昂貴的電泳及成像系統(tǒng),不利于基層推廣,同時電泳檢測需開蓋進(jìn)行,產(chǎn)物會在空氣中產(chǎn)生氣溶膠,在之后的檢測中產(chǎn)生假陽性[16]. SYBR GreenⅠ法不需要任何設(shè)備,但同樣要開蓋進(jìn)行,容易導(dǎo)致檢測假陽性. HNB法反應(yīng)不需開蓋,不會有氣溶膠溢出,可以減少假陽性,且反應(yīng)顏色穩(wěn)定,所以最終選擇HNB法對產(chǎn)物進(jìn)行檢測. 采用HNBLAMP檢測敏感性可達(dá)8 copies/反應(yīng),與先前熒光定量PCR檢測豬鏈球菌2型方法相當(dāng)[14],比普通PCR檢測的敏感性高了100倍,表明該法特異性好.

    把建立的HNB-LAMP檢測方法應(yīng)用于臨床樣品檢測,結(jié)果表明10份臨床樣品,采用LAMP檢測出5份陽性,而采用普通PCR檢測全為陰性,說明LAMP比普通PCR檢測更適合于豬鏈球菌感染的檢測,究其原因是因為LAMP檢測敏感性遠(yuǎn)高于普通PCR檢測.同時考慮到臨床樣品檢測如需使用試劑盒提取DNA后進(jìn)行檢測將會提高費用,并延長檢測時間,實驗中樣品未經(jīng)試劑盒提取DNA來獲取較純DNA模板,而是僅經(jīng)過簡單預(yù)處理后煮沸10 min取上清液作為檢測模板,表明此方案可行. 該法50 min完成檢測,檢測結(jié)果可肉眼觀察,在檢測豬鏈球菌2型方面具有良好的臨床潛力,適合基層單位使用.

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