豬丹毒絲菌C43-5 株菌種毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)再評(píng)價(jià)

李旭妮，李 建，王秀麗，劉元杰，張一幟，徐 磊，馮 妍，張 媛

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

豬丹毒絲菌（E.rhusiopathiae）屬于丹毒絲菌屬，是一種兩端鈍圓，直或稍彎曲的細(xì)絲狀菌，大小為（0.2～0.4）μm×（0.8～2.5）μm，呈革蘭氏陽性，有莢膜，無鞭毛，易形成長絲狀。該菌能引起豬和多種動(dòng)物的急性、熱性感染，臨床上急性型呈敗血癥癥狀，亞急性型皮膚上出現(xiàn)紫色疹塊，慢性型表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎。豬丹毒絲菌的血清型 有1a、1b、2、4、5、6、8、11、12、15、16、17、19、21 和N 等，不同血清型致病力不同，其中1a、1b 的致病力最強(qiáng)，目前我國主要流行1a 和2 型[1-2]。

豬丹毒絲菌主要感染架子豬，也可經(jīng)損傷的皮膚感染人。豬丹毒病20 世紀(jì)80 年代以前在我國多發(fā)，隨著養(yǎng)殖條件的改善和疫病防控水平的提高，20 世紀(jì)90 年代后期至21 世紀(jì)初期，關(guān)于豬丹毒絲菌感染的報(bào)道較為少見[3]。然而，2010 年開始，我國部分省份零星報(bào)道發(fā)現(xiàn)豬丹毒病例，至2012年，豬丹毒病例顯著增多，廣西、廣東、四川、福建、江西、湖南、安徽、上海、吉林、黑龍江等地均報(bào)道發(fā)生該病[3-7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017—2019 年，我國豬丹毒病的平均檢出率為4.2%，是豬瘟的3 倍、藍(lán)耳病的48 倍[8]，豬丹毒絲菌感染率呈明顯上升趨勢(shì)，亟需加強(qiáng)防控。

免疫接種是預(yù)防和控制豬丹毒病發(fā)生和流行的重要手段?！吨腥A人民共和國獸藥典》[9]（2020年版，以下簡稱《獸藥典》）收錄相關(guān)疫苗有豬丹毒活疫苗G4T10 株、GC42 株，豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗，豬丹毒滅活疫苗，豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗等5 個(gè)產(chǎn)品，上述疫苗產(chǎn)品生產(chǎn)用菌種均為豬丹毒絲菌C43-5 株。該菌種由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所負(fù)責(zé)檢定、保管和供應(yīng)?，F(xiàn)行檢定依據(jù)為《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》（2000 年版，以下簡稱《規(guī)程》）。由于《規(guī)程》中未明確標(biāo)明該菌的攻毒劑量上限，所以試驗(yàn)過程中可以無限加大攻毒劑量，故檢定結(jié)果中無法描述菌株毒力，不能有效控制疫苗質(zhì)量。因此，本研究開展了豬丹毒滅活疫苗生產(chǎn)用菌種C43-5 株對(duì)豬的最小致死量研究，并對(duì)1986、1996、2006、2015 年4 個(gè)凍干代次的菌種進(jìn)行了毒力和免疫原性測(cè)定，以期為進(jìn)一步修訂完善毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)，延長菌種保存期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 生產(chǎn)用豬丹毒絲菌CVCC43005株（2型），檢驗(yàn)用豬丹毒絲菌CVCC43008 株（1 型）、CVCC43006 株（2 型），均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2 主要試劑 TSA 培養(yǎng)基，購自BD 公司；馬丁湯，購自北京中海動(dòng)物保健科技公司；馬血清，購自Gibco 公司；肉肝胃消化湯、綿羊裂解血細(xì)胞全血、豬丹毒活疫苗活菌計(jì)數(shù)用參考品（8.5×108～12.5×108CFU/頭份）、豬丹毒抗體競爭ELISA 檢測(cè)試劑盒，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR 小鼠（SPF 級(jí)、16～18 g、雌性），購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；豬（普通級(jí)、56～63 日齡、雌雄各半），購自隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 TSA 培養(yǎng)基配制及質(zhì)量控制 稱取40 g TSA 溶于940 mL 注射用水，121 ℃滅菌15 min 備用。取豬丹毒活疫苗活菌計(jì)數(shù)用參考品3 瓶，按照《獸藥典》進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。培養(yǎng)平板為含10%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血的TSA 平板，培養(yǎng)條件為33 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為42 h。

1.2.2 CVCC43005 株培養(yǎng)及制備工藝確定 將CVCC43005 株凍干菌種用1.0 mL 肉肝胃消化湯復(fù)溶后，取0.5 mL 接種于含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL 肉肝胃消化湯中，33 ℃靜置培養(yǎng)20 h；取新鮮菌液劃線接種于含10%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血的TSA 平板，33 ℃培養(yǎng)42 h，作為一級(jí)種子；從一級(jí)種子上選取3 個(gè)典型菌落接種于含5%馬血清、0.2% 綿羊裂解血細(xì)胞全血、0.4% 葡萄糖的10.0 mL 肉肝胃消化湯（置于100 mL 鹽水瓶）中，33 ℃ 120 r/min 培養(yǎng)12 h，作為二級(jí)種子；取2.0 mL 二級(jí)種子接種于含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血、0.4%葡萄糖的100.0 mL 肉肝胃消化湯（置于250 mL 三角瓶）中，33 ℃120 r/min 培養(yǎng)，從培養(yǎng)1 h 開始，每間隔1 h 取1次樣，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，直至培養(yǎng)24 h 后結(jié)束。

1.2.3 健康易感豬篩選 挑選無豬丹毒病流行史，未免疫過豬丹毒相關(guān)疫苗，基礎(chǔ)體溫不高于40 ℃，精神、采食、被毛、行動(dòng)均正常的56～63 日齡豬30 頭，采集全血，分離血清，采用競爭ELISA 方法和《豬丹毒診斷技術(shù)》（NY/T 566—2019）[10]中試管凝集方法同時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。

1.2.4 CVCC43005 株對(duì)豬最小致死劑量測(cè)定 將CVCC43005 株菌種用肉肝胃消化湯按照確定的培養(yǎng)條件制備成菌液；根據(jù)菌液預(yù)數(shù)結(jié)果，將菌液濃度通過稀釋或濃縮的方式調(diào)整為3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010CFU/mL 后，靜脈注射56～63 日齡健康易感豬；每個(gè)劑量組注射2 頭豬，每頭豬注射5 mL；觀察4 d，記錄豬死亡情況，判定菌種毒力。

1.2.5 不同凍干代次CVCC43005 株菌種毒力檢定 將1986、1996、2006、2015 年4 個(gè)凍干代次的CVCC43005 株菌種用肉肝胃消化湯按照確定的培養(yǎng)條件制備成菌液后，每個(gè)代次菌種靜脈注射56～63 日齡健康易感豬2 頭，每頭豬注射最小致死劑量，觀察4 d，記錄豬死亡情況。同時(shí)，每個(gè)代次菌種皮下注射18～22 g 小鼠5 只，每只小鼠注射10 CFU 活菌，觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。同時(shí)對(duì)菌液進(jìn)行復(fù)數(shù)，根據(jù)復(fù)數(shù)結(jié)果計(jì)算豬和小鼠實(shí)際注射的活菌數(shù)。

1.2.6 不同凍干代次CVCC43005 株菌種免疫原性檢定 用小鼠進(jìn)行免疫原性檢定。參照《規(guī)程》將1986、1996、2006、2015 年4 個(gè)凍干代次的CVCC43005 株菌種分別制備成滅活抗原。取100只16～18 g 小白鼠分為12 組。第1～4 組，每組10只，分別皮下注射4 個(gè)凍干代次菌種制備的滅活抗原0.1 mL；第5～8 組，每組10 只，分別皮下注射4 個(gè)凍干代次菌種制備的滅活抗原40%氫氧化鋁膠生理鹽水4 倍稀釋液0.2 mL；第9～12 組，每組5 只，不注射疫苗，作為對(duì)照組。免疫21 d 后，每個(gè)免疫組各取5 只小鼠，連同對(duì)照組5 只小鼠各注射1 000 MLD（Minimum Lethal Dose，最小致死量）CVCC43008 強(qiáng)毒菌液，另取5 只對(duì)照組小鼠注射1 MLD CVCC43008 強(qiáng)毒菌液；每個(gè)免疫組剩余5只小鼠，連同對(duì)照組小鼠5 只各注射1 000 MLD CVCC43006 強(qiáng)毒菌液，另取5 只對(duì)照組小鼠注射1 MLD CVCC43006 強(qiáng)毒菌液。攻毒后觀察10 d，統(tǒng)計(jì)保護(hù)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSA 培養(yǎng)基質(zhì)量評(píng)價(jià)

3 瓶豬丹毒活疫苗活菌計(jì)數(shù)用參考品活菌計(jì)數(shù)結(jié)果分別為10.0×108、12.4×108、11.0×108CFU/頭份，均處于8.5×108～12.5×108CFU/頭份范圍內(nèi)，證明該批次TSA 培養(yǎng)基適宜豬丹毒絲菌的生長。

2.2 CVCC43005 株培養(yǎng)及制備工藝確定

豬丹毒絲菌CVCC43005 株用肉肝胃消化湯培養(yǎng)24 h 內(nèi)的活菌數(shù)結(jié)果見表1。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，得出豬丹毒絲菌CVCC43005 株用肉肝胃消化湯培養(yǎng)的生長曲線。結(jié)果（圖1）顯示，CVCC43005 株在肉肝胃消化湯中培養(yǎng)16 h 時(shí)活菌數(shù)最高，而后進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)19 h 后活菌數(shù)迅速下降，菌體大量死亡。

圖1 豬丹毒絲菌CVCC43005 株生長曲線

表1 CVCC43005 株活菌數(shù)結(jié)果

故確定豬丹毒絲菌CVCC43005 株菌液制備工藝：將CVCC43005 株凍干菌種用1.0 mL 肉肝胃消化湯復(fù)溶后，取0.5 mL 接種于含5%馬血清、0.2% 綿羊裂解血細(xì)胞全血、0.4% 葡萄糖的10.0 mL 肉肝胃消化湯中，33 ℃靜置培養(yǎng)20 h；取新鮮菌液劃線接種于含10%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血的TSA 平板，33 ℃培養(yǎng)42 h，作為一級(jí)種子；從一級(jí)種子上選取3 個(gè)典型菌落接種于含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL 肉肝胃消化湯（置于100 mL 鹽水瓶）中，33 ℃ 120 r/min 培養(yǎng)12 h，作為二級(jí)種子；取2.0 mL 二級(jí)種子接種含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血、0.4% 葡萄糖的100.0 mL 肉肝胃消化湯（置于250 mL 三角瓶）中，33 ℃120 r/min 培養(yǎng)16 h 收獲。

2.3 健康易感豬篩選

用競爭ELISA 方法和試管凝集方法同時(shí)檢測(cè)30 份豬血清中的豬丹毒抗體，將血清抗體PI 值≤10.0%的豬判定為抗體陰性豬。結(jié)果（表2）顯示，28 頭豬PI 值均≤10.0%且試管凝集試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，另外2 頭豬PI 值分別為12.4 和11.0，且試管凝集試驗(yàn)結(jié)果均為可疑。

表2 豬血清抗體檢測(cè)結(jié)果

2.4 CVCC43005 株對(duì)豬最小致死劑量測(cè)定

結(jié)果（表3）顯示，以3.5×1010CFU 活菌靜脈注射56～63 日齡健康易感豬，2 只試驗(yàn)豬在4 d內(nèi)全部死亡，病死豬表現(xiàn)為精神沉郁、喜臥、不愿走動(dòng)、厭食、頸部出現(xiàn)暗紅色丘疹（圖2）。說明CVCC43005株對(duì)豬最小致死劑量為3.5×1010CFU/頭。

表3 CVCC43005 株對(duì)豬最小致死劑量測(cè)定

圖2 發(fā)病豬頸部出現(xiàn)暗紅色丘疹

2.5 不同凍干代次CVCC43005 株菌種毒力檢定

1986、1996、2006、2015 年4 個(gè)凍干代次的CVCC43005 株菌種按照最小致死劑量攻擊豬，均可使豬全部死亡，毒力檢定結(jié)果（表4）均符合要求。根據(jù)不同凍干代次CVCC43005 株菌種毒力檢定結(jié)果，CVCC43005 株菌種毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)為取56～63日齡健康易感豬2 頭，經(jīng)靜脈注射菌液5.0 mL/頭（活菌濃度不高于7.0×109CFU/mL），觀察4 d，應(yīng)全部死亡；取18～22 g 小白鼠5 只，經(jīng)皮下注射菌液0.2 mL/只（活菌濃度不高于50 CFU/mL），觀察7 d，應(yīng)全部死亡。

表4 不同凍干代次CVCC43005 株菌種毒力檢定結(jié)果

2.6 不同凍干代次CVCC43005 株菌種免疫原性檢定

4 個(gè)凍干代次的菌株制備成滅活抗原后，分別按滅活抗原0.1 mL 及滅活抗原40%氫氧化鋁膠生理鹽水4 倍稀釋液0.2 mL 免疫小鼠。結(jié)果（表5）顯示，攻擊1 000 MLD 強(qiáng)毒菌液免疫組小鼠全部健活，對(duì)照組小鼠全部死亡，攻擊1 MLD CVCC43006 強(qiáng)毒菌液對(duì)照組小鼠全部死亡，攻擊1 MLD CVCC43008 強(qiáng)毒菌液對(duì)照組小鼠死亡4 只。說明符合毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)的菌種，其免疫原性檢定亦符合要求。

表5 不同凍干代次菌株對(duì)小鼠的免疫原性 單位：只

3 討論

《規(guī)程》對(duì)豬丹毒絲菌C43-5 的毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)為“以肉肝胃消化湯培養(yǎng)24 h 的菌液1～5 mL（每1 mL 不少于活菌30 億），靜脈注射斷奶后1～3 個(gè)月體質(zhì)量20 kg 以上的健康易感豬2 頭，應(yīng)于4 d內(nèi)死亡；5～10 個(gè)活菌注射18～22 g 小白鼠5 只，均應(yīng)于7 d內(nèi)死亡”[11]?，F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中主要存在兩個(gè)問題：一是原標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)豬的毒力標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了攻毒菌數(shù)的下限“每1 mL 不少于活菌30 億”，沒有規(guī)定上限，檢定過程中可以不斷增加攻毒菌數(shù)，直至豬死亡，相當(dāng)于菌株沒有毒力標(biāo)準(zhǔn)；二是原標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物日齡過于寬泛，跨度3 個(gè)月，豬的體質(zhì)量有較大差別，對(duì)菌株的抵抗力也大不相同[12]。為解決上述問題，本研究對(duì)豬丹毒絲菌C43-5 株在肉肝胃消化湯中的生長規(guī)律進(jìn)行了分析，縮小了檢驗(yàn)動(dòng)物日齡范圍，測(cè)定了菌株對(duì)規(guī)定日齡范圍豬的最小致死劑量，并對(duì)1986、1996、2006、2015 年4 個(gè)凍干代次的菌種進(jìn)行了毒力和免疫原性測(cè)定。

通過分析豬丹毒絲菌C43-5 株在肉肝胃消化湯中的生長曲線，選用培養(yǎng)16 h 的菌液，初步探索出了更為合理的菌種毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)：選擇56～63日齡健康易感豬2 頭，經(jīng)靜脈注射菌液5.0 mL/頭（活菌數(shù)不高于7.0×109CFU/mL），觀察4 d，應(yīng)全部死亡；取18～22 g 小白鼠5 只，經(jīng)皮下注射菌液0.2 mL/只（活菌數(shù)不高于50 CFU/mL），觀察7 d，應(yīng)全部死亡。同時(shí)，本研究對(duì)4 個(gè)凍干代次菌種進(jìn)行了毒力和免疫原性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)代次的菌種毒力和免疫原性均符合規(guī)定。目前，豬丹毒菌種每隔10年需要進(jìn)行1次制備和檢定，包括復(fù)壯、凍干、真空度測(cè)定、純粹檢驗(yàn)、剩余水分測(cè)定、培養(yǎng)特性、生化特性、毒力、免疫原性等步驟，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而本研究結(jié)果顯示，保存36、26、16 年菌種的毒力、免疫原性均可達(dá)到菌種的檢定標(biāo)準(zhǔn)，這為進(jìn)一步延長菌種的保存時(shí)間提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。