氣相色譜法測(cè)定乳粉中1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞油酸甘油三酯含量的不確定度評(píng)定

劉春霞，段國(guó)霞，劉麗君，李翠枝，呂志勇，陳 靜，宮慧麗，武倫瑋

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

人乳脂的組成和結(jié)構(gòu)比較特殊，從人乳脂脂肪酸組成來看，主要包括油酸、棕櫚酸和亞油酸，分別占人乳脂的5%～35%、20%～30%、10%～20%。因此，由這3 種脂肪酸通過一定方式生成的1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞油酸甘油三酯（1-oleic-2-palmitic-3-linoleic acid triglyceride，OPL）為U-S-U結(jié)構(gòu)[1-4]，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可促進(jìn)嬰兒對(duì)脂肪和鈣的吸收，并對(duì)脂代謝有顯著影響[5-8]。為使嬰幼兒獲得與母乳相似的營(yíng)養(yǎng)，需要對(duì)牛乳脂肪進(jìn)行結(jié)構(gòu)化改造，或采用結(jié)構(gòu)油脂，使其甘油三酯的脂肪酸組成更接近母乳[9-12]。因此監(jiān)測(cè)添加OPL的乳粉具有重要意義，在監(jiān)測(cè)的同時(shí)，必須重視分析測(cè)試中的不確定度。2019年，中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)發(fā)布了新的測(cè)量不確定度要求，即開展檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)評(píng)定測(cè)量不確定度。不確定度的應(yīng)用在我國(guó)各行各業(yè)分析測(cè)試中越來越受到重視[12-16]。不確定度是指由于測(cè)量誤差的存在，對(duì)被測(cè)量值不能肯定的程度，不確定度越低，表明結(jié)果的可信程度越高，反之亦然，是一個(gè)衡量測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)。本研究對(duì)氣相色譜法測(cè)定乳粉中OPL含量的不確定度進(jìn)行探討，該評(píng)定結(jié)果可直接應(yīng)用于日常的實(shí)際檢測(cè)工作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉：市場(chǎng)隨機(jī)抽取共6 種樣品。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：OPL標(biāo)準(zhǔn)品（C55H100O6，純度≥99%）北京曼哈格生物科技有限公司；石油醚、乙醚、無水乙醇（均為分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氨水（優(yōu)級(jí)純）、氫氧化鉀（分析純） 天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；正庚烷（色譜純） 天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜儀（配備氫火焰離子化檢測(cè)器）美國(guó)安捷倫公司；AL204分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；SuperVario-N多功能離心機(jī) 德國(guó)Funke Gerber公司；Pro UV超純水機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾公司；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京興偉儀器有限公司；MS 3 basic渦旋振蕩器、RVID旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

1.3.1.1 樣品水解

取乳粉試樣約1.0 g至毛氏抽脂瓶中，加入10 mL（65±5） ℃的水溶解試樣，振搖，使樣品完全溶解，加入2 mL體積分?jǐn)?shù)25%的氨水，置于60～70 ℃水浴中15～20 min，3～5 min振蕩1 次，取出，冷卻至室溫，靜置30 s。

1.3.1.2 脂肪提取

向冷卻后的毛氏瓶中加入10 mL乙醇，加入2 滴1 g/100 mL剛果紅，混勻。加入25 mL乙醚，塞上塞子，100 次/min振搖1 min。再加入25 mL石油醚，塞上塞子，100 次/min振搖30 s。500～600 r/min離心5 min，使醚層、水層分開。傾出上清液于250 mL圓底燒瓶中，為第1次提取。第2次提取加入的試劑為5 mL乙醇、15 mL乙醚、15 mL石油醚，操作同前，離心分層后傾出上清液與第1次上清液合并。第3次提取不加入乙醇，加入15 mL乙醚、15 mL石油醚，操作同前，離心分層后傾出上清液與前2 次上清液合并。

1.3.1.3 樣液濃縮

把盛有脂肪上清液提取物的圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，（60±2） ℃通入氮?dú)庑D(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至近干，用正己烷（或正庚烷）溶解殘留物并定容至10 mL，用渦旋振蕩器混勻，0.45 μm有機(jī)針式濾器過濾即為待測(cè)液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

OPL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10 mg OPL標(biāo)準(zhǔn)品（精確到0.1 mg），用正己烷（或正庚烷）溶解并定容至10 mL容量瓶中，制得OPL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL），冷凍保存，有效期3 個(gè)月。

OPL標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取一定量OPL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷（或正庚烷）定容，配制適宜質(zhì)量濃度（500 μg/mL）的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 OPL含量計(jì)算

利用標(biāo)樣的質(zhì)量濃度與峰面積，計(jì)算乳粉中OPL含量（X），按式（1）計(jì)算。計(jì)算結(jié)果保留3 位有效數(shù)字。

式中：A樣為樣品中OPL的峰面積；A標(biāo)為OPL標(biāo)樣峰面積；ρ標(biāo)為OPL標(biāo)樣質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為定容體積/mL；m為待測(cè)樣品質(zhì)量/g；1 000、100為單位換算系數(shù)。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型和不確定度評(píng)定

組合類似影響因素，將輸入量ρ、V和m重復(fù)性因素組合在一起，歸為輸出量X的重復(fù)性因素，因此不需分別評(píng)定輸入量ρ、V和m重復(fù)性引入的不確定度分量，而是直接評(píng)定測(cè)量結(jié)果（X）的重復(fù)性引入的不確定度分量。為此將式（1）改寫為式（2）。

式中：ρ為根據(jù)標(biāo)樣求出的OPL溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；f為測(cè)量重復(fù)性影響因素的修正因子，其數(shù)值為1；ρ、V、m和f四者互不相關(guān)，采用方和根方法合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。而且OPL含量的計(jì)算式只有輸入量ρ、V、m的積和商，因而用以下簡(jiǎn)化的方式計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度[17-20]，如式（3）所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量不確定度的來源分析

通過實(shí)驗(yàn)過程的標(biāo)樣、樣品、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)逐一分析，可知標(biāo)樣是通過稱量和配制過程，樣品是通過稱量、定容、轉(zhuǎn)移過程，重復(fù)性是通過稱量重復(fù)性、定容重復(fù)性、提取重復(fù)性和上機(jī)重復(fù)性分別影響不確定度[21-23]。

2.2 輸入量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

2.2.1urel（ρ）

urel（ρ）包括2 個(gè)來源：一是標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1rel（ρ）；二是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（VR1）。

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1rel（ρ）評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)品稱量主要使用電子天平，因此，標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由電子天平檢定后示值誤差和偏載誤差的最大允許誤差決定。電子天平經(jīng)檢定合格，其示值誤差最大允許誤差為±0.05 mg，包含因子由此引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1s（m）

電子天平經(jīng)檢定合格，其偏載誤差最大允許誤差為±0.15 mg，包含因子為。由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

故電子天平校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（m）按式（4）計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量m=0.011 30 g實(shí)際上是采用減量方法通過2 次測(cè)量相減給出的，所以u(píng)1rel（ρ）按式（5）計(jì)算。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel（VR1）評(píng)定

配制儲(chǔ)備液、樣品定容時(shí)容量瓶校準(zhǔn)引入的試樣體積V的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下[24-27]：本研究使用的10 mL A級(jí)容量瓶的允許誤差為0.02 mL，取三角分布，包含因子為，則容量瓶體積帶來的不確定度u1（V）按式（6）計(jì)算。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（VR1）按式（7）計(jì)算。

綜上，urel（ρ）按式（8）計(jì)算。

2.2.2urel（V）

urel（V）包括2 個(gè)來源：校準(zhǔn)和重復(fù)性影響，重復(fù)性歸入到OPL含量的重復(fù)性f中，只評(píng)定校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

樣品定容、稀釋時(shí)容量瓶校準(zhǔn)引入的試樣體積V的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：本研究使用的10 mL A級(jí)容量瓶的允許誤差為0.02 mL，取三角分布，包含因子為，則容量瓶體積帶來的不確定度u1（V）按式（6）計(jì)算，為0.008 167 mL。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（VR1）按式（7）計(jì)算，為0.000 816 7 mL。

本次測(cè)量過程中，樣品使用10 mL容量瓶6 次，因此urel（V）按式（9）計(jì)算。

2.2.3urel（m）

質(zhì)量m不是直接測(cè)量給出，實(shí)際上是采用減量法通過2 次稱量給出的，即由1 次回零（空瓶）稱量所得。每次測(cè)量不確定度都包括2 個(gè)來源：校準(zhǔn)和重復(fù)性，重復(fù)性歸入到OPL含量的重復(fù)性f中，只評(píng)定電子天平校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1（m）。

2.2.3.1u1（m）評(píng)定

電子天平校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由電子天平檢定后示值誤差和偏載誤差的最大允許誤差決定。電子天平經(jīng)檢定合格，其示值誤差最大允許誤差為±0.5 mg，包含因子由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（10）計(jì)算。

電子天平經(jīng)檢定合格，其偏載誤差最大允許誤差為±1 mg，包含因子由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（11）計(jì)算。

故電子天平校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1（m）按式（12）計(jì)算。

2.2.3.2urel（m）的計(jì)算

urel（m）按式（13）計(jì)算。

2.2.4urel（f）

峰面積A測(cè)定引入的X的不確定度合并到urel（f）考慮，稱取相同樣品6 份，同時(shí)進(jìn)行處理后在相同氣相色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，6 份樣品的測(cè)量結(jié)果平均值（X0）為1.172 g/100 g（表1），應(yīng)用貝塞爾公式計(jì)算單次測(cè)量的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差，按式（14）～（15）計(jì)算。

表1 6 份試樣含量獨(dú)立重復(fù)測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of repeated determination of six samples

urel（f）按式（16）計(jì)算。

2.3 合成不確定度及擴(kuò)展不確定度評(píng)定

2.3.1 輸出量相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

將式（8）、（9）、（13）、（16）代入式（3），計(jì)算urel（X）[28-30]。

2.3.2 乳粉中OPL含量測(cè)定結(jié)果的擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

取包含因子k=2，包含概率p≈95%，則含量測(cè)量結(jié)果的相對(duì)擴(kuò)展不確定度urel為urel（X）×k=0.011 8×2=0.023 6。

2.3.3 OPL含量測(cè)量結(jié)果及不確定度報(bào)告

6 份試樣OPL含量測(cè)量結(jié)果的平均值為1.172 g/100 g，OPL含量測(cè)量結(jié)果的相對(duì)擴(kuò)展不確定度urel=0.023 6，提供約95%的包含概率。

3 結(jié) 論

OPL含量測(cè)量結(jié)果不確定度來源主要包含4 個(gè)方面，分別為：試樣溶解并定容后的溶液質(zhì)量濃度ρ引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（ρ）；試樣體積V定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）；試樣稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）；OPL含量測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（f）。由以上評(píng)定過程可以看出，urel（ρ）是主要不確定度來源，由式（4）可以看出，標(biāo)準(zhǔn)溶液稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量是urel（ρ）的主要來源，由于本研究標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量很小，計(jì)算結(jié)果也是通過在同一數(shù)量級(jí)的標(biāo)樣單點(diǎn)計(jì)算，所以嚴(yán)格控制稱量環(huán)節(jié)，按照稱量的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范進(jìn)行操作，天平定期校準(zhǔn)是控制本研究不確定度的有效手段。