高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定乳粉中壬基酚殘留

白艷梅，張立佳，汪 洋，劉麗君，謝瑞龍，段建華，李翠枝

（內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

隨著工業(yè)化的發(fā)展，越來越多的化學合成物產生，這些化學物質給人類帶來方便的同時也會造成不可忽視的傷害。最近幾年備受關注的環(huán)境污染物壬基酚是洗滌劑、紡織產品、皮革涂飾和包裝材料中常見的化工原料。研究發(fā)現(xiàn)，壬基酚也是一種具有擬雌激素作用的環(huán)境污染物，不易降解，長期暴露在自然環(huán)境中可通過食物鏈進入人體，擾亂機體激素分泌，可導致人類性早熟及免疫力下降等，尤其是對剛發(fā)育的嬰幼兒更加明顯[1-2]。而最新研究發(fā)現(xiàn)，大鼠暴露于壬基酚環(huán)境中可增強肝臟、腎臟和心臟功能的損傷[3-4]。乳粉是嬰幼兒的主要食物來源，乳粉安全對嬰幼兒健康至關重要。食品及食品包裝材料中禁止添加壬基酚，但乳粉的加工、運輸、包裝等各環(huán)節(jié)可能存在壬基酚污染的風險[5-8]。近幾年壬基酚被各國列為環(huán)境污染物，并出臺嚴格的管控標準，美國國家環(huán)保局推薦，淡水中壬基酚的含量不應高于6.6 μg/L，咸水中不應高于1.7 μg/L，目前我國食品中尚無限量標準。壬基酚作為環(huán)境污染物，容易引起食品安全風險，威脅著人民的身體健康，作為乳品企業(yè)，為保障人民的飲食健康，需制定嚴格的質量體系，監(jiān)控每個環(huán)節(jié)，降低食品安全風險。雖然針對壬基酚的生態(tài)環(huán)境風險相關研究較多，但國內沒有可依據(jù)的乳制品相關國家檢測標準。2014年食藥監(jiān)食監(jiān)三便函[2014]73號通知《國家食品安全監(jiān)督抽檢和風險監(jiān)測》針對嬰幼兒食品及食用植物油等食品指定了檢驗方法，該方法使用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法凈化處理，經研究發(fā)現(xiàn)，該方法對乳粉中包埋在內部的壬基酚提取效率較低。2019年國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布食品補充檢驗方法BJS 201913《食品中辛基酚等5 種酚類物質的測定》，該方法采用塑料材質的固相萃取柱，具有本底污染嚴重、穩(wěn)定性差等相關問題[9]。因此，亟需建立一種準確、穩(wěn)定的乳粉中壬基酚檢測方法。

壬基酚殘留的檢測方法主要為氣相色譜-質譜法[10-13]、液相色譜-質譜法[14-16]等，檢測對象主要為包裝材料[17-20]、食品和環(huán)境水[21-23]等，其中氣相色譜-質譜法對目標物進行衍生化處理，衍生化方法過程繁瑣，前處理時間長，限制了該方法的使用。液相色譜-質譜法在大氣壓條件下電離，對目標物進行準確分析，靈敏度高、檢測時間短，是目前檢測壬基酚的常用方法。調研發(fā)現(xiàn)，檢測乳粉中壬基酚的文獻較多，如直接提取上機檢測、有機試劑提取后凝膠色譜法除脂、冷凍除脂、塑料固相萃取柱除脂[24-28]等。直接提取法快速、簡單但本底值高，基質效應強，污染檢測儀器。凝膠色譜法除脂試劑消耗量大，檢測成本高。冷凍除脂法耗時且除脂效果不明顯。采用塑料固相萃取柱存在壬基酚溶出風險，導致本底值高，影響定量結果。本研究通過乳粉質控樣進行方法準確性評價，解決了現(xiàn)行方法乳粉基質中壬基酚提取效率差、前處理流程復雜、操作時間長、有機試劑消耗量大、凈化設備昂貴等不足。本研究建立一種使用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測乳粉中壬基酚的方法，對乳粉中的壬基酚殘留量進行檢測，為乳粉產品風險管控提供有力技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉為市場隨機抽取的6 種乳粉；質控樣為內蒙古伊利集團自主制備，壬基酚理論添加量33.36、300.00 μg/kg，每個添加量6 份。

二氯甲烷（色譜純）、甲醇（液相色譜-質譜級）、乙腈（液相色譜-質譜級） 上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉（分析純） 天津福晨化學試劑有限公司；4-壬基酚（純度100%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；3,6,3-壬基酚-13C6內標（純度100%） 默克化學試劑公司；水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水；ProElut PAEs Glass固相萃取柱（500 mg，6 mL） 迪馬科技有限公司。

1.2 儀器與設備

QTRAP 6500高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質譜儀（配備電噴霧電離源） 美國AB Sciex公司；AL204分析天平（感量0.01 mg/0.1 mg） 瑞士Mettler-Toledo公司；KQ-300DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；渦旋振蕩器 德國IKA公司；Thermo冷凍離心機美國賽默飛公司；Biotage氮吹儀 瑞典拜泰齊公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取1 g試樣（精確到0.1 mg），置于40 mL玻璃離心管中，加入3 mL 40～50 ℃溫水將其充分溶解，準確加入100 μL 1 μg/mL 3,6,3-壬基酚-13C6內標中間液混勻，靜置10 min，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，添加2 g氯化鈉，渦旋振蕩5 min使其充分混勻。超聲提取15 min后，0～4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上清液，待凈化。

1.3.2 固相萃取凈化

依次用6 mL二氯甲烷和6 mL乙腈活化固相萃取柱，取1.3.1節(jié)的上清液5 mL轉移至固相萃取柱，自然流干，再用4 mL乙腈淋洗固相萃取柱，抽干，收集全部流出液置于玻璃離心管中，在40 ℃水浴下氮氣吹干，1 mL甲醇復溶，0～4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上清液上機分析。

實驗中所用的器具均為玻璃材質，使用前用馬弗爐400 ℃烘烤4 h。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）或其他等效柱；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫40 ℃；流動相A：超純水，流動相B：甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.4 質譜分析條件

質譜條件：電噴霧離子源，負離子掃描模式；多反應監(jiān)測；離子化電壓-4 500 V；離子源溫度500 ℃；輔助加熱器壓力50 psi（345 kPa）；噴霧氣壓力50 psi（345 kPa）。離子采集參數(shù)見表2。

表2 質譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters

1.3.5 標準工作液配制

稱取壬基酚10 mg，甲醇定容并稀釋為100 μg/mL的標準溶液，-20 ℃保存。再將100 μg/mL的標準溶液用甲醇稀釋至1 μg/mL，得壬基酚外標中間工作液，0～8 ℃保存，有效期3 個月。

精密量取3,6,3-壬基酚-13C6儲備液1 mL，置于100 mL容量瓶，甲醇稀釋、定容，得1 μg/mL壬基酚內標中間工作液，0～8 ℃保存，有效期3 個月。

混合標準工作液：分別準確吸取壬基酚中間工作液（1 μg/mL）適量，加入同位素內標中間工作液（1 μg/mL），逐級稀釋得到系列標準工作液，質量濃度分別為2、5、10、20、40、80、100、200 ng/mL，質量濃度由低到高進行檢測，以外標定量離子峰面積/內標離子峰面積-質量濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。

1.3.6 結果計算

試樣中壬基酚的含量按下式計算。

式中：X為試樣中壬基酚殘留量/（μg/kg）；ρ為試樣上機溶液中壬基酚殘留量/（ng/mL）；ρ0為空白實驗中壬基酚殘留量/（ng/mL）；V為樣液最終定容體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為試樣質量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜儀Analyst工作站軟件對壬基酚進行定性及定量分析，Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 加水量的優(yōu)化

稱取1.0 g乳粉質控樣（壬基酚含量300 μg/kg）各4 份，分別加入0、2、3、4 mL水，均加入10 mL乙腈，比較提取率。由圖1可知，質控樣采用乙腈直接提取的提取率較低，為40%～60%，隨著水的加入，提取率呈上升趨勢，加水量3、4 mL時提取率均達到100%左右，最終選擇加水3 mL溶解。實驗證明，加水后乳粉中的壬基酚更容易被乙腈溶劑提取，主要原因為乳粉為干性樣品，加水后能使其充分溶解分散，加上乙腈的沉淀蛋白作用，使提取率明顯提升。為了提高結果準確度，選擇加水3 mL溶解后再進行提取。

圖1 加水量對提取率的影響（n=6）Fig.1 Effect of the amount of added water on the extraction efficiency of nonylphenol (n = 6)

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

加標回收率是實驗室在分析檢測過程中常用的一種質量控制方式，當加標回收率在一定范圍時，表明該分析方法適用[29]。取空白基質乳粉加入壬基酚標準工作液，壬基酚添加量為10 μg/kg，分別用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）和乙腈提取后比較加標回收率。由表3可知，基質加標后分別用乙酸乙酯-環(huán)己烷和乙腈進行提取，加標回收率沒有明顯差異，均符合國標規(guī)定。

表3 壬基酚加標回收率比較（n=6）Table 3 Effect of extraction solvents on the recovery of nonylphenol (n = 6)

另取已知添加量的低、高濃度壬基酚乳粉質控樣，分別選擇乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）和乙腈2 種溶劑提取，比較質控樣實際提取量。由表4可知，用乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液和乙腈提取質控樣，壬基酚測定結果差異較大，乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液提取目標物效果較差，而乙腈提取效果明顯改善。

表4 質控樣提取率比較Table 4 Comparison of extraction efficiencies of different solvents for nonylphenol from quality control sample

乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液提取率低的原因為主要檢測游離態(tài)壬基酚，對乳粉包埋壬基酚提取效果較差。而當乙腈作為提取溶劑時，在有效提取目標物的同時具有沉淀蛋白的作用，對游離態(tài)壬基酚與包埋壬基酚提取效果均較優(yōu)，綜合考慮選用乙腈作為提取溶劑。

2.3 氯化鈉添加量的選擇

采用PAEs固相萃取柱，由于填料含硅膠，水會影響固相萃取柱的柱效，凈化時需控制水量。利用氯化鈉在乙腈中的溶解能力弱及易溶于水的性能，可以使兩相分層，同時減少目標物在水中的溶解。稱取1 g質控樣（壬基酚含量300 μg/kg），加入3.0 mL水溶解，加入10 mL乙腈提取，加入不同質量的氯化鈉（0、2、3、4 g），其余操作不變，比較提取效果。由圖2可知，由于氯化鈉的加入使乙腈層與水層分離明顯，且壬基酚更完全地溶于乙腈層中，提高了提取效率。不加氯化鈉時，壬基酚測定值為250 μg/kg，氯化鈉添加量2、3 g時壬基酚提取效率明顯提升。綜合考慮，為了提高壬基酚測定結果準確度，選擇氯化鈉添加量2 g進行測定。

圖2 氯化鈉添加量對提取率的影響（n=6）Fig.2 Effect of the amount of added sodium chloride on the extraction efficiency of nonylphenol (n = 6)

2.4 凈化條件的優(yōu)化

通過陰性樣品加標和乳粉質控樣，考察PAEs玻璃固相萃取柱（PSA/硅膠串聯(lián)，500 mg，6 mL）、炭黑固相萃取柱（Carbon，500 mg，6 mL）、聚苯乙烯-二乙烯基苯固相萃取柱（HLB，500 mg，6 mL）3 種固相萃取柱對結果的影響。由表5可知：HLB和Carbon固相萃取柱本底含量超過定量限（5.0 μg/kg），影響結果的準確性，而PAEs柱低于檢出限（1 ng/mL）；PAEs固相萃取柱加標回收率和質控樣回收率均為100%。HLB和Carbon固相萃取柱回收率和質控樣回收率較低。為了提高方法的準確度，綜合考慮，選擇PAEs玻璃固相萃取柱進行前處理。

表5 3 種固相萃取柱的比較Table 5 Comparison of purification efficiencies of three kinds of solid phase extraction column

2.5 方法學評價

2.5.1 標準曲線、檢出限和定量限

由表6可知，本方法的壬基酚標準曲線相關系數(shù)大于0.99，乳粉中壬基酚的定量限為5.0 μg/kg，滿足信噪比（RS/N）≥10的要求。

表6 壬基酚標準曲線、檢出限和定量限Table 6 Standard curve, limit of detection and limit of quantification for nonylphenol

2.5.2 方法的加標回收率和精密度

選取不含壬基酚的基質樣品進行加標回收率實驗，分別添加5、40、300 μg/kg共3 個水平的壬基酚標準溶液，每個加標水平做6 次平行實驗。由表7可知，壬基酚的加標回收率為81.10%～107.39%，相對標準偏差為1.97%～9.73%，說明該方法測定乳粉中壬基酚殘留時具有較好的準確度和精密度。

表7 壬基酚的加標回收率與相對標準偏差（n =6）Table 7 Recoveries and RSDs of nonylphenol from spiked sample (n = 6)

2.6 實際樣品中壬基酚的測定

取市售的多品牌乳粉進行分析，樣本數(shù)量40 個，壬基酚含量均小于5 μg/kg，表明目前大部分乳粉企業(yè)對工藝、運輸及包裝材料的控制非常嚴格，消費者可放心食用。

3 結 論

采用質控樣進行檢測方法的準確度評價，優(yōu)化提取試劑和凈化條件，提升了準確度和檢測效率，采用同位素內標法建立高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定乳粉中壬基酚的定量檢測方法。結果表明，乳粉中壬基酚添加量5～300 μg/kg時，加標回收率為81.10%～107.39%，相對標準偏差為1.97%～9.73%，此方法具有較好的精密度和準確度。采用簡單的固相萃取柱替換傳統(tǒng)的凝膠色譜儀等昂貴的前處理設備，解決了乳粉基質中壬基酚提取率低的難題，前處理簡單、節(jié)約成本、靈敏度高，適用于乳粉基質中的檢測，為乳制品企業(yè)食品安全風險監(jiān)測提供了技術保障。