基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究溫陽(yáng)強(qiáng)心顆?？剐募∪毖俟嘧p傷的作用機(jī)制

原 黛，劉 群，朱姝悅，劉 暢，王冰梅，王 微

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

急性心肌梗死是一種可導(dǎo)致心肌缺血性壞死的心血管疾病，對(duì)梗死的心肌及時(shí)地進(jìn)行血流灌注是目前最有效的治療手段，但易造成心肌缺血再灌注損傷[1]。心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI）表現(xiàn)為心肌缺血后再灌注血流時(shí)，不能恢復(fù)缺血部位的組織器官功能，反而還會(huì)出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的變化，心肌能量代謝障礙和血管無(wú)復(fù)流等現(xiàn)象，進(jìn)而加重了功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷[2]。

溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒具有益氣溫陽(yáng)、利水消腫、活血通絡(luò)的作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒中的12味中藥材可通過(guò)不同的作用機(jī)制改善心肌缺血再灌注損傷[3]的癥狀。目前運(yùn)用于治療心肌缺血再灌注損傷的中藥制劑一般是由三七-紅花藥對(duì)、干姜-附子湯、苓桂術(shù)甘湯等由2～5種中藥組成的復(fù)方。相較于這些中藥復(fù)方，溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒復(fù)方中增加了黃芪、川芎等中藥，其中的黃酮類成分具有改善血液循環(huán)等作用。溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒復(fù)方成分多，其中的12味中藥都具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用，但是，其具體作用機(jī)制還未可知。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)、整體的水平探討溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒治療心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，為溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒對(duì)心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供合理依據(jù)[4]。

1 材料與方法

1.1 溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒中活性成分和作用靶點(diǎn)的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）搜索中藥名字得到溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒中附子、黨參、當(dāng)歸、川芎、丹參、黃芪、三七、茯苓、白術(shù)、桂枝、甘草、葶藶子這12味藥材的所有化合物成分，將口服生物利用度（OB）的篩選條件調(diào)整為≥30%、將化合物類藥性（DL）的篩選條件調(diào)整為≥0.18，篩選出活性成分，并獲取活性化合物的所有作用靶點(diǎn)。利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Uniprot Database）下載已驗(yàn)證的人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行處理，用以方便后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。

1.2 構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白交互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò) 將上述交集靶點(diǎn)輸入蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)（STRING）得到高置信度的靶點(diǎn)蛋白交互作用（PPI）信息，用Cytoscape 3.9.1軟件將PPI信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行連接度（Deegre）值分析，以Deegre值對(duì)靶點(diǎn)圖形大小，色彩進(jìn)行調(diào)整進(jìn)而得到PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Centiscape 2.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，分析出所有交集靶點(diǎn)的緊密度（closeness centrality，CC）、Degree和介度（betweenness centrality，BC）3個(gè)參數(shù)值做中位值，再通過(guò)BC、CC和Degree值篩選核心靶點(diǎn)。

1.3 GO 富集分析和KEGG通路富集分析 將藥物疾病交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（GO）富 集分析，包括分子功能（MF）分析、生物過(guò)程（BP）分析、細(xì)胞組成（CC）分析，然后進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析。

2 結(jié)果

2.1 溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒的有效成分及作用靶點(diǎn) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出了溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒的277個(gè)化合物，去除重復(fù)項(xiàng)以及無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的化合物后總計(jì)檢索出192個(gè)有效成分。其中：附子3個(gè)，黨參11個(gè)，川芎2個(gè)，丹參54個(gè)，黃芪7個(gè)，三七1個(gè)，茯苓5個(gè)，白術(shù)3個(gè)，桂枝4個(gè)，甘草78個(gè)，葶藶子3個(gè)，共同有效成分21個(gè)。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)匹配到對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，將其從UNIPROT數(shù)據(jù)中進(jìn)行匹配，轉(zhuǎn)換成Uniprot ID基因名，得到了溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒藥物有效成分所對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)基因共285個(gè)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到MI/RI相關(guān)作用靶點(diǎn)1 387條，篩選設(shè)置relevance score≥15，最終得到相關(guān)靶點(diǎn)一共173個(gè)。利用微生信網(wǎng)站中的Ⅴenn作圖平臺(tái)，將藥物作用靶點(diǎn)和MI/RI相關(guān)靶點(diǎn)取交集后最終得到65個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白交互作用PPI網(wǎng)絡(luò) 使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.9.1軟件得到了一張具有65個(gè)節(jié)點(diǎn)、1082條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。經(jīng)過(guò)Centiscape 2.2軟件拓?fù)浞治龊蟮玫?Degree中位數(shù)為33.81，BC中位數(shù)為30.69，CC中位數(shù)為0.011，滿足以上3個(gè)參數(shù)值的是白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素1B（IL-1B）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）等21個(gè)可以作為在治療心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用的核心靶點(diǎn)[7-8]，這些靶點(diǎn)可能在心肌缺血再灌注損傷的治療中發(fā)揮了重要作用[9]，詳細(xì)如表1所示。

表1 溫陽(yáng)強(qiáng)心顆?？筂I/RI的靶點(diǎn)蛋白交互作用PPI網(wǎng)絡(luò)

圖1 PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO富集分析 在Matescape平臺(tái)對(duì)得到的65個(gè)交集靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行BP、CC、MF富集分析，以P＜0.01為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，富集到了297條生物過(guò)程條目、64條細(xì)胞組成條目、72條分子功能條目，共計(jì)433條GO條目，各類別前10個(gè)條目如圖2所示，其中生物過(guò)程主要包括有：正調(diào)控細(xì)胞遷移、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)氧化的應(yīng)激反應(yīng)等；細(xì)胞組成主要包括有：膜灶、膜微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞膜內(nèi)陷、囊泡腔、外側(cè)細(xì)胞膜、質(zhì)膜灶、分泌顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、蛋白酶抑制劑復(fù)合物等[10]；分子功能包括有：細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、信號(hào)受體激活活動(dòng)、信號(hào)受體調(diào)節(jié)活動(dòng)等[11]。通過(guò)以上數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，溫陽(yáng)強(qiáng)心顆?？赡苁峭ㄟ^(guò)多種生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮治療MI/RI疾病作用。

圖2 GO生物過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能

2.4 KEGG通路富集分析 在Matescape平臺(tái)對(duì)得到的65個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，以P＜0.01為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共富集得到154條信號(hào)通路，主要包括：流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、白細(xì)胞介素（IL-17）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（ⅤEGF）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、內(nèi)分泌性信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用信號(hào)通路、細(xì)胞衰老信號(hào)通路、壞死性凋亡信號(hào)通路等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且這些信號(hào)通路與膀胱癌（bladder cancer）、胰 腺 癌（pancreatic cancer）、直腸癌（colorectal cancer）、小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer）等癌癥通路有相關(guān)性；也與肺結(jié)核（tuberculosis）、非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease）、酒精性肝?。╝lcoholic liver disease）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis）等疾病通路有相關(guān)性[12]。分析以上研究結(jié)果可知，溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒的活性成分相關(guān)靶點(diǎn)分布于不同途徑，能夠通過(guò)各個(gè)信號(hào)通路協(xié)調(diào)發(fā)揮對(duì)MI/RI的治療作用[13]。

3 討論

心肌缺血是心肌異常代謝導(dǎo)致能量不足以支持心臟正常工作的病理狀態(tài)，是由于心臟的血液灌注量降低導(dǎo)致心臟供氧降低而形成的疾病[14]，血運(yùn)重建治療法是現(xiàn)在臨床上治療心肌缺血的主要方法[15]。但是恢復(fù)缺血部位心肌組織的血流供應(yīng)后，心肌可能會(huì)更大程度受損進(jìn)而導(dǎo)致心肌組織的二次損傷。大量研究結(jié)果顯示缺血再灌注損傷心肌可占全部梗死心肌面積的50%[16]。

本研究共獲得了以下核心靶點(diǎn)：IL-6、TNF、IL-1B、AKT1、ⅤEGFA、CCL2、NOS3、MMP9和IL-10等。在溫陽(yáng)強(qiáng)心顆?？剐募∪毖俟嘧p傷的GO富集分析中主要涉及297條生物學(xué)過(guò)程，包括正調(diào)控細(xì)胞遷移、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)和細(xì)胞對(duì)化學(xué)的應(yīng)激反應(yīng)等大部分生物過(guò)程都和心肌缺血再灌注損傷相關(guān)[17]。在溫陽(yáng)強(qiáng)心顆?？剐募∪毖俟嘧p傷的KEGG通路富集分析中，主要涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和ⅤEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等通路[18]。在心肌缺血再灌注損傷這一疾病的發(fā)展過(guò)程中，炎癥因子TNF-α水平的增加與心肌組織的功能降低有關(guān)系，通過(guò)直接影響心肌的收縮力從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡，這是TNF-α導(dǎo)致心肌缺血后心肌功能降低的主要機(jī)制[19]，相關(guān)研究表明，IL-23、IL-17等其他炎性因子在心肌缺血再灌注損傷中的表達(dá)明顯提高，與心肌細(xì)胞凋亡、提高炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等有相關(guān)性[20]。研究證明，激活HIF-1α可以通過(guò)調(diào)控Bax/Bcl-2表達(dá)以及與Caspase-3和Caspase-9活性相關(guān)的心肌細(xì)胞凋亡，從而有效減輕糖尿病心臟I/R后的心肌損傷程度[21]，增強(qiáng)ⅤEDF的表達(dá)，抑制心肌缺血時(shí)脂質(zhì)的過(guò)氧化，從而促進(jìn)清除氧自由基，促進(jìn)缺血部位新生血管的生成，對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷也具有保護(hù)作用[6]，NF-kB信號(hào)通路是I/R損傷的介質(zhì)。NF-kB激活會(huì)造成炎癥因子（如TNF-α，IL-1，IL-6和IL-8），趨化因子（例如MCP-1和MIP-1a）以及產(chǎn)生繼發(fā)性炎癥介質(zhì)（例如COX-2和iNOS）的誘導(dǎo)酶的表達(dá)增強(qiáng)[20]。這是一個(gè)惡性循環(huán)，會(huì)擴(kuò)大初始炎癥反應(yīng)，這是I/R損傷的重要機(jī)制[21]。有關(guān)研究報(bào)道，AGE與其細(xì)胞表面受體RAGE的結(jié)合導(dǎo)致NF-kB介導(dǎo)的炎癥因子釋放[22]，有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路參與I/R損傷過(guò)程，通過(guò)P38MAPK、P44/42MAPK和SAPK/JNK 3條途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、炎癥和凋亡[23]。根據(jù)這些研究推測(cè)溫陽(yáng)強(qiáng)心顆?？赡苁峭ㄟ^(guò)作用于這些通路來(lái)發(fā)揮治療心肌缺血再灌注損傷的作用。

本研究應(yīng)用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究了溫陽(yáng)強(qiáng)心顆粒中所含中藥的所有化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)，多角度分析總結(jié)得到其抗心肌缺血再灌注損傷具有多成分、多靶點(diǎn)、多生物過(guò)程、多信號(hào)通路的作用機(jī)制，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。