近紅外二區(qū)活體熒光成像在腫瘤診療中的應用

汪詩琪，羅博文，俞計成，2，3，4，顧 臻，2，3，4，5

（1.浙江大學藥學院,浙江省先進遞藥系統(tǒng)重點實驗室,杭州 310058；2.浙江大學醫(yī)學中心,浙江省系統(tǒng)與精準醫(yī)學實驗室,良渚實驗室,杭州 311121；3.浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院,杭州 310016；4.浙江大學金華研究院,金華 321299；5.浙江大學高分子科學與工程學系,高分子合成與功能構造教育部重點實驗室,杭州 310027）

腫瘤因其高病死率和復發(fā)率，已成為威脅人類健康的重大疾病之一.由于發(fā)現不及時，很多患者在接受治療時癌細胞已經轉移和擴散，錯過了最佳治療時機［1，2］.因此，腫瘤的早期診斷對于及早干預，進而提高患者的存活率和生活質量至關重要［3］.手術切除是目前大部分確診腫瘤患者的一線療法，其需要高分辨率的成像系統(tǒng)輔助，以準確完整地移除腫瘤病灶，提高痊愈率，降低復發(fā)風險［4］.目前，臨床上常用的活體成像技術有磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）、X射線計算機斷層掃描（Computed tomography，CT）、正電子發(fā)射斷層掃描（Positron emission computed tomography，PET）、單光子發(fā)射斷層掃描（Single photon emission computed tomography，SPECT）及超聲成像（Ultrasound，US）等.相比于體外和離體檢測方法，它們能夠非破壞性地獲得生物組織的微觀結構或功能圖像，在早期腫瘤診斷中發(fā)揮重要作用［5］.然而由于這些成像技術的掃描時間通常較長、靈敏度和時空分辨率較低［6，7］，并不能有效地檢測早期腫瘤，特別是微小的病變，也無法很好滿足手術導航的需求；另外，使用時的輻射也可能會對人體健康造成損害［3，8］.熒光成像作為一種快速發(fā)展的活體成像模式，不存在電離輻射過程，無放射毒性，安全性更高；且具有較好的成像特性（包括反饋快、靈敏度高、檢測限低和時空分辨率高［9～11］）.它能夠可視化活體組織和器官的解剖結構和功能，動態(tài)監(jiān)測腫瘤的病理生理微環(huán)境變化［12］，因此，有望在腫瘤的診斷和手術引導中發(fā)揮重要作用［13］.

傳統(tǒng)的可見光區(qū)（400～760 nm）熒光成像深度僅為1～2 mm，且信噪比低，難以得到深層組織的復雜生物信息［10，14］.近紅外一區(qū)窗口（Near-infrared-Ⅰ，NIR-Ⅰ，760～900 nm）的出現［15］降低了組織對光的吸收和散射以及組織的自身熒光，使成像深度大幅提高［14］，但仍難以滿足臨床應用的需求［8，14］.2009年，Welsher等［16］利用單壁碳納米管首次實現了大于1000 nm的近紅外活體熒光成像.此后，1000～1700 nm作為第2個近紅外成像窗口［近紅外二區(qū)，Near-infrared-Ⅱ（NIR-Ⅱ）］為人們所熟知［17］.相較于可見光區(qū)和NIR-Ⅰ，其波長進一步增加，顯著抑制了生物組織對于光子的散射效應，且生物組織的自身熒光幾乎可以忽略不計［18］.在此窗口進行熒光成像具有前所未有的組織穿透深度（3 cm）和時空分辨率［19］，在臨床應用上比NIR-Ⅰ更有優(yōu)勢［20，21］.綜合考慮水的吸收峰的影響，得到了兩個成像質量更優(yōu)的亞窗口NIR-Ⅱa（1300～1400 nm）和NIR～Ⅱb（1500～1700 nm）［22～26］.已有研究表明光吸收對成像分辨率具有一定的促進效應［27］，Feng等［28］基于此將NIR-Ⅱ窗口進一步擴展至900～1880 nm，并增加了NIR-Ⅱx（1400～1500 nm）和NIR-Ⅱc（1700～1880 nm）兩個亞窗口［圖1（A）］，它們的成像質量相比于NIR-Ⅱa和NIR-Ⅱb有了進一步的提升［圖1（B）］.

Fig.1 Illustration of extended NIR-Ⅱimaging window and four sub-windows[28]

近年來涌現了許多不同種類的NIR-Ⅱ熒光探針，研究者們致力于通過結構改造和表面修飾等方法進一步優(yōu)化其理化性能.本綜述首先剖析了熒光成像的原理，以及NIR-Ⅱ熒光成像相比于傳統(tǒng)成像技術和成像窗口所具有的獨特優(yōu)勢，然后根據化學結構將現有的主要熒光探針分為6類，分別闡述了它們的特性，并著重介紹了近年來NIR-Ⅱ熒光成像在性能優(yōu)化方面的研究進展，以及在腫瘤成像、手術導航以及光療中的應用，最后討論了現有NIR-Ⅱ熒光探針的局限及臨床轉化所面臨的挑戰(zhàn)，并提出了未來可能的發(fā)展方向.

1 NIR-Ⅱ窗口的熒光成像

1.1 熒光成像的過程

熒光成像的過程包括熒光團的激發(fā)、熒光發(fā)射和熒光信號的采集和處理.當熒光團受到外界光照射時，若光子的能量恰好為分子某兩個能級間的能量差，則熒光團的核外電子會吸收光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)單重態(tài)的各個不同振動-轉動能級.處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，會通過振動弛豫和內部能量轉換回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再躍遷到基態(tài)，輻射出特定波長的熒光.由于存在振動弛豫和內部能量轉換等非輻射形式，熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)光波長，這一現象稱為斯托克斯位移（Stokes shift）.熒光團發(fā)射的熒光經過生物組織的吸收和散射后，被光學探測器捕獲和放大，最后經過電腦采集處理后得到熒光圖像.

熒光團和NIR-Ⅱ成像系統(tǒng)是影響熒光成像的兩個重要因素.熒光量子產率是熒光團的重要發(fā)光參數，它是指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的光子數與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數之比.通過提高π電子共軛的程度以及分子的剛性，能夠提高量子產率，同時使熒光發(fā)射波長紅移.成像系統(tǒng)的性能對于熒光圖像的效果也很重要.靈敏度高的成像系統(tǒng)能夠有效收集熒光團的發(fā)射信號，提供更準確的解剖結構、功能和分子圖像［25］.傳統(tǒng)的光學探測器為硅電荷耦合裝置相機，檢測波段局限于400～900 nm，對大于1000 nm的光檢測靈敏度很低.近年出現的半導體合金InGaAs和HgCdTe檢測器克服了這一局限，能夠實現高靈敏度和高分辨率的NIR-Ⅱ熒光成像［17］，而更先進的超導納米線單光子探測器實現了NIR-Ⅱc范圍內的細胞分辨水平的共聚焦熒光成像［29］.近年來，相繼報道了通過整合多功能的模塊，研制出時域多路復用的成像系統(tǒng)［30］和寬譜（400～1700 nm）多路復用的成像系統(tǒng)［31］用于小動物成像的研究.波長誘導頻率濾波的引入使納米傳感器在近紅外光譜中的信噪比提高了52倍，能夠檢測豬腦顱骨下約2.4 cm處替莫唑胺的化療活性，突破了現有納米感應器體內植入深度的極限［32］.Hu等［20］則用可見光/NIR-Ⅰ/Ⅱ的多光譜成像儀器引導人體的肝腫瘤切除手術，邁出了NIR-Ⅱ成像臨床應用的一大步.

1.2 NIR-Ⅱ熒光成像的特點

大多數臨床上的醫(yī)學成像模式需要通過從物體外部檢測到的數據重建物體橫截面的信息，依賴于穿透深度大的輻射以探測成像對象的結構和功能信息［9］.CT用X射線對人體組織進行掃描，而PET和SPECT使用放射性核素進行成像，它們都可產生電離輻射，可危害患者和手術醫(yī)生的健康.另外，CT和MRI經常需要高劑量的造影劑，具有一定的毒性［33，34］.PET成像只顯示放射性核素的位置和濃度，不能對組織結構進行成像，空間分辨率有限.傳統(tǒng)的成像技術掃描時間都較長，導致時間分辨率低，獲得的信息準確度有限［6，35］，且用于分子或功能成像的探針少.對比之下，體內熒光成像不存在數據的轉換和重建，能夠實時獲取圖像，且熒光探針產生的光輻射無害，在活體器官中具有高的空間分辨率.此外，熒光探針的種類相對較多，既有展現結構的造影劑，也有提供功能信息的報告基團［9］.目前臨床上的成像系統(tǒng)只能定位腫瘤，無法可視化特定分子的表達和活動.而熒光成像的出現使實時觀察細胞內信號通路中分子的相互作用、區(qū)分腫瘤細胞和正常細胞成為可能［36］.

相比于可見光和NIR-Ⅰ區(qū)，在NIR-Ⅱ窗口光子與組織相互作用減小，因此NIR-Ⅱ熒光成像具有深度更大、分辨率更高的優(yōu)勢.光與組織具有界面反射、散射、吸收和自身熒光4種相互作用［圖2（A）］［9］.吸收和散射主要決定光對組織的穿透深度，而自身熒光主要影響成像的信噪比和分辨率.NIR-Ⅱ成像的獨特優(yōu)勢主要有3點：

（1）散射作用小.散射會使光子偏移原來的路徑，降低穿透深度，生成的雜散光還會增大背景噪音.隨著波長的增加，不同生物組織的散射系數呈指數性降低［圖2（B）］［37］.可見光區(qū)散射作用很大，NIR-Ⅰ區(qū)散射作用有所下降，而在NIR-Ⅱ區(qū)，除腦組織外，其它組織的散射幾乎可以忽略不計，故具有大的成像深度和信噪比.

（2）組織吸收小.生物組織內許多內源分子（如血紅蛋白、黑色素、細胞色素［9］）具有生色團，會吸收可見光，以熱的形式耗散，造成熒光信號衰減.血紅蛋白在可見光區(qū)有吸收峰，而在波長大于700 nm區(qū)域對光的吸收幾乎為零［圖2（C）］.水在1450 nm處的吸收峰能夠減少散射光，對背景噪音的減少具有一定的積極作用；其它NIR-Ⅱ成像區(qū)域水的吸收都較?。蹐D2（D）］，信號衰減小.

（3）自身熒光低.生物體器官中富含的大多數熒光分子（如還原型輔酶Ⅰ、黃素、卟啉類化合物［9，10］）在可見光或NIR-Ⅰ區(qū)具有非特異性的熒光發(fā)射，干擾成像結果；隨著波長增至NIR-Ⅱ區(qū)域，各個器官的自身熒光都大幅下降，在超過1500 nm后幾乎消失［圖2（E）］，故具有較高的信噪比.

Fig.2 Interactions between light and biological tissues in visible,NIR-Ⅰand NIR-Ⅱimaging windows[9]

2 NIR-Ⅱ熒光探針及其在腫瘤診療中的應用

熒光團是熒光成像的核心與基礎，通過設計和優(yōu)化在NIR-Ⅱ窗口成像的熒光團，可以實現它們在腫瘤診療中的多功能用途.目前，具有代表性的NIR-Ⅱ熒光團可根據化學結構分為無機［單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）、量子點（Quantum dots，QDs）和稀土金屬納米顆粒（Rare-earth doped nanoparticles，RENPs）］和有機［小分子熒光探針（Small molecular dyes，SMDs）、聚集誘導發(fā)光材料（Aggregation-induced emission fluorogens，AIEgens）以及共軛聚合物（Conjugated polymers，CPs）］兩大類.

2.1 無機熒光探針

不同特性的無機材料制成的熒光團具有不同的光發(fā)射原理，它們一般都具有較大的體表面積和優(yōu)越的光特性，發(fā)射波長靈活可調，但也存在生物相容性低及毒性較大等缺點.

2.1.1 單壁碳納米管 SWCNTs是單層石墨卷曲形成的半導體納米管，相鄰的碳之間通過sp2雜化，形成蜂窩狀結構［25］.2009年，Welsher等［16］首次成功將SWCNTs用于體內血管成像.SWCNTs帶隙窄［38］，斯托克斯位移大，具有寬的NIR-Ⅱ發(fā)射譜.但是其量子產率較低（小于0.4%），生物相容性不佳，因此，對其進行適宜的功能化以提高熒光量子產率，降低生物毒性十分關鍵［39，40］.

通過優(yōu)化SWCNTs合成的催化劑或在合成后進行分離純化，可以縮窄其直徑分布，提高手性純度，進而提高其量子產率［41～43］.另外，保護SWCNTs免受環(huán)境中猝滅劑（酸、堿、氧）的影響也是提高其量子產率的重要手段［42，44］.表面修飾是提高SWCNTs的生物相容性的常用方法，由于共價修飾會導致量子產率下降，所以一般將兩親性分子非共價結合在其疏水表面以提高其水溶性.Takeuchi等［45］用磷脂-聚乙二醇（PEG）包裹在摻雜氧的SWCNTs表面，得到的o-SWCNTs-PEG在體內具有合適的循環(huán)和清除時間，因而毒性低.Welsher等［16］先后進行超聲和表面交換，將二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000（DSPE-mPEG5000）結合在SWCNTs表面，增加其水溶性的同時提高了量子產率.此外，Xhyliu等［46］用DNA序列修飾純手性的SWCNTs［圖3（A）］，一方面DNA的π堆積作用賦予其在水溶液中的高穩(wěn)定性，另一方面手性純度的提高使熒光強度增加［圖3（B）］.

Fig.3 Surface modification of SWCNTs for assessing efficacy of chemotherapeutics

在腫瘤成像方面，2015年，Diao等［47］用激光汽化富集得到具有高熒光亮度的半導體SWCNTs，能在NIR-Ⅱb區(qū)域對4T1乳腺腫瘤及其周圍血管清晰成像.近期有研究報道了通過在SWCNTs中摻雜氧，使其發(fā)射波長從980 nm紅移到1280 nm，對子宮內膜癌的成像對比度提高了19.6倍［48］.除了探測腫瘤，SWCNTs還能用于評估藥物的治療效果.Bhattacharya等［49］發(fā)展了一種具有高特異性和敏感性的單鏈DNA-SWCNTs復合物，其熒光強度隨過氧化氫濃度的升高而降低［圖3（C）］，能夠監(jiān)控吉西他濱誘導產生的具有細胞毒性的H2O2的動態(tài)變化，進而反映腫瘤細胞活性的變化［圖3（D）］，從而監(jiān)測胰腺導管腺癌的化療效果.

2.1.2 量子點 量子點（QDs）是三維（3D）的半導體納米晶體.基于價帶理論，價帶的電子吸收一個能量大于帶隙的光子后，被激發(fā)到導帶，接著電子通過弛豫返回價帶，以輻射方式發(fā)出熒光［50］.量子點尺寸較小，具有突出的光學特性，包括激發(fā)譜寬、發(fā)射譜窄且對稱、量子產率高和光穩(wěn)定性強［3，51］.NIR-ⅡQDs結合了QDs本身的光學優(yōu)勢和NIR-Ⅱ窗口的優(yōu)勢，能夠在深層組織獲得極高的時空分辨率，是理想的成像對比劑.按照組成的化學元素，QDs可分為Ⅳ-Ⅵ（如PbS），Ⅰ-Ⅵ（如Ag2S），Ⅲ-Ⅴ（如InAs）和Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ（如CuInS2），其中Ag2S QDs由于不含重金屬元素，具有更好的生物相容性［38，52］.

Fig.4 Water-soluble and enzyme-responsive QDs achieved by surface modification

傳統(tǒng)的QDs（如Ag2S QDs）通常具有疏水性表面，提升其水溶性將有助于其臨床應用.可通過配體交換或表面修飾提高其在水溶液中的分散性和溶解性［51］，使之更好地用于腫瘤成像.Lu等［52］用正十二硫醇作為配體，引入適當比例的油胺和油酸，提高了Ag2S QDs納米晶體簇的分散性，PEG化后可用于小鼠的乳腺癌成像.Awasthi等［53］用聚乙二醇化的聚硫脲樹枝狀聚合物（PEG-PATU）裹Ag2S QDs［圖4（A）］，能夠高效追蹤體內A549腫瘤細胞的遷移［圖4（B）］.

除了提高水溶性，表面修飾策略還可以賦予熒光探針靶向性，提高其在腫瘤部位的富集.Zhang等［54］將聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）與Ag2Te QDs組裝形成PQDs核心，接著在外表面包裹腫瘤細胞膜，提高其在腫瘤部位的富集.用化學修飾的方法能夠賦予NIR-ⅡQDs響應性特征，使之與腫瘤部位的特定分子結合后從關閉狀態(tài)轉換成開啟狀態(tài)，產生熒光.與傳統(tǒng)的熒光探針相比，它提高了腫瘤與正常組織的信號比.Jeong等［55］報道了具有基質金屬蛋白酶2（MMP-2）響應性的NIR-Ⅱ熒光探針，他們將具有核殼結構的QDs與猝滅劑亞甲藍通過可剪切多肽連接起來，由于存在分子內能量轉移，導致熒光猝滅［圖4（C）］，當結腸癌微環(huán)境的MMP-2切除兩者之間的連接后，熒光強度提高到原來的3倍［圖4（D）］.此外，Deng等［56］設計了響應H2S的Ag2S QDs，并用于結腸癌的準確定位.腫瘤診斷的方法除了可視化病灶外，還可以對循環(huán)腫瘤細胞進行定量檢測.Lian等［57］制備了三元量子點CuInSe2@ZnS QDs，不僅能夠靶向小鼠腫瘤獲得實時成像，還能定量探測全血中循環(huán)的MCF-7乳腺癌細胞.2022年，Wang等［29］構建了核殼結構的PbS/CdS QDs，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為1650和1880 nm，是迄今小鼠體內成像中最長的單光子激發(fā)和發(fā)射波長.此探針在小鼠腦部的成像深度可達1100μm，且能夠對小鼠腹股溝淋巴結中的免疫細胞進行活體分子成像.

2.1.3 稀土金屬納米顆粒 稀土金屬（Rare earth，RE）是元素周期表ⅢB族中鈧、釔和鑭系元素的總稱.+3價的鑭系離子能夠發(fā)生4f層間的f-f遷移和4f與5d層間的f-d遷移，產生從紫外到NIR范圍的熒光.稀土金屬制成的納米顆粒（RENPs）通常分為上轉換納米顆粒（Upconverting nanoparticles，UCNPs）和下轉換納米顆粒（Downconverting nanoparticles，DCNPs）兩類.上轉換得到的發(fā)射光波長小于激發(fā)光，通常在可見光范圍內［58］；而下轉換則得到更大的發(fā)射波長，所以大多數NIR-Ⅱ發(fā)射都是通過DCNPs實現的［59］.DCNPs的結構包含稀土金屬離子和無機主晶格，前者包括Nd3+，Tm3+，Pr3+，Ho3+，Er3+5種鑭系元素，作用是發(fā)射下轉換熒光［60］.而主晶格則為能量從敏化劑轉移到摻雜的稀土金屬提供晶體環(huán)境［61，62］，其中，NaYF4和NaGdF4使用最廣泛.在現有NIR材料中，RENPs具有發(fā)射譜窄，發(fā)射效率高，光穩(wěn)定性強和光毒性低等優(yōu)點［38］，且其發(fā)射波長可調，在生物成像和成像引導的手術中發(fā)揮重要作用［62］.

通過調節(jié)摻雜稀土金屬的種類和比例能夠增大RENPs的發(fā)射波長，提高熒光強度［61］.以Nd3+作為摻雜劑，成功獲得了能夠檢測5 mm左右小腫瘤的NIR-Ⅱ發(fā)射的熒光探針［63］.Xue等［64］將Er3+摻雜在以NaYF4為核心的納米棒（NR）中，并利用親水的聚丙烯酸（PAA）進行修飾，得到的PAA-NRs具有NIR-Ⅱb窄帶發(fā)射，且具有良好的生物相容性，能夠探測直徑約為4 mm的宮頸內小腫瘤.在此基礎上，Li等［65］進一步摻入Ce3+，抑制了上轉換通路，使下轉換的NIR-Ⅱb發(fā)射增強［圖5（A）］，不僅能夠靈敏地探測原位和轉移的小腫瘤［圖5（B）］，還能獲得肺癌血管的高分辨率圖像（41μm）［圖5（C）］.另外，核殼結構也能增強熒光發(fā)射強度，同時增大發(fā)射波長［66］.將摻雜稀土金屬和制備核殼結構兩種策略結合能使熒光信號提高近9倍［67］.

Fig.5 RENPs applied in tumor imaging after lanthanide doping and surface modification

用生物分子修飾RENPs的表面可進一步提高熒光探針的靶向性.Wang等［68］利用DNA和卵泡刺激素的多肽鏈修飾NIR-Ⅱ發(fā)射的UCNP，能夠提高熒光探針在腫瘤內的富集，且在NIR-Ⅱ成像引導下可以完全切除直徑約1 mm的腫瘤轉移灶，同時提高肝腎清除率以降低體內毒性.Zhang等［59］將腫瘤細胞膜包裹在RENPs上，以獲得腫瘤靶向和免疫逃逸功能.Zhao等［69］通過操控不同的激發(fā)光，控制偶氮基修飾的UCNP和β-環(huán)糊精修飾的DCNP的組裝和去組裝［圖5（D）］，實現納米探針在腫瘤部位的富集，降低背景噪音和長期毒性［圖5（E）］，為成像引導的精準腫瘤手術提供支持.除了賦予熒光探針靶向性以更好地定位腫瘤，引導手術切除，Li等［70］提供了腫瘤治療另一種思路：將脂質體包裹RENPs形成的RENPs@Lip注入荷瘤小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)，能夠可視化腫瘤新生血管，在NIR-Ⅱ成像引導下進行血管栓塞手術以治療股骨骨肉瘤，RENPs@Lip還可應用于荷瘤小鼠的前哨淋巴結成像和連續(xù)組織活檢.

除了無機稀土金屬納米顆粒，有機配體與稀土金屬離子絡合形成的配合物在NIR-Ⅱ熒光成像中也具有重要應用，其具有發(fā)射光譜窄、斯托克斯位移大及光穩(wěn)定性高等優(yōu)點［71］.Wang等［72］利用鑭系金屬Er3+與菌綠素形成配合物，當配體菌綠素被光激發(fā)后，能夠快速地將能量轉移到Er3+，降低了泛頻振動導致的熒光猝滅，在溶液中產生了1530 nm的熒光信號，這一配合物是多路復用活體成像的有力工具，能夠同時觀察小鼠腦部兩種熒光標記的腫瘤細胞和血管.Ning等［73］以Yb3+為中心，卟啉酸鹽作為配合物，構建了一種pH敏感的NIR-Ⅱ熒光探針并用于熒光壽命成像.這一探針的熒光強度和熒光壽命隨pH的上升而增加，可以用于人宮頸癌細胞中的溶酶體成像以及pH值波動的監(jiān)測.此鑭系金屬配合物還可應用于NIR-II成像引導的小鼠淋巴結定位和活檢［74］，在NIR-II生物成像和外科手術中具有應用前景.

2.1.4 其它無機熒光探針 金納米簇（Gold nanoclusters，AuNCs）的分子量小、排泄迅速和生物相容性好［75］.具有25個金原子和18個多肽配體的納米簇具有強的NIR-Ⅱ發(fā)射［76］.Li等［77］將AuNCs改造成棒狀的二十面體，提高了其量子產率.Song等［78］將AuNCs與環(huán)糊精（CD）連接，形成的CD-Au NCs能夠包合抗體，獲得高靈敏度的腫瘤靶向成像.氧化石墨烯（Graphene oxides，GO）具有良好的生物相容性和獨特的表面化學特性，用其包封摻雜鑭系金屬的納米晶體（Ln3+-NCs），形成的NCs@GO具有很好的分散性，能夠同時實現腫瘤的NIR-Ⅱ成像和腫瘤細胞追蹤［79］.近期研發(fā)的黑鱗量子點是一種新型的NIR-Ⅱ熒光探針，具有較好的生物降解性以及清除活性氧簇的能力［80］.

2.2 有機熒光探針

無機熒光探針具有未知的長期毒性、潛在的金屬離子泄露和有限的體內清除率，常常會引發(fā)安全性問題，且它們大多數熒光亮度不夠，難以實現臨床轉化［81］.有機熒光團具有完整的分子結構和靈活的衍生性能，化學和物理特性可調節(jié)，且生物毒性小，體內生物相容性好［82］.

2.2.1 小分子熒光探針 小分子熒光探針（SMDs）能夠被快速代謝排出體內因而毒性低，擁有良好的生物相容性.此外，其結構明確，光譜特性可調節(jié)，與其它材料相比，其在NIR-Ⅱ成像中具有更顯著的優(yōu)勢［38，83］.NIR-Ⅰ小分子熒光探針吲哚菁綠（Indocyanine green，ICG）和亞甲藍（Methylene blue，MB）已經被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于臨床上眼底血管和淋巴管造影［25］，在乳腺癌的診斷［84］、腫瘤切除手術的引導［85］以及泌尿系統(tǒng)的成像［86］中發(fā)揮重要作用.近期發(fā)現ICG在大于1300 nm的NIR-Ⅱ區(qū)域也有較強的拖尾熒光發(fā)射，意味著它也能應用于NIR-Ⅱ成像，實現手術引導功能［20，87，88］.商用染料IRDye 800CW和IR-12N3與ICG具有相似的特征，它們的最大發(fā)射峰在NIR-Ⅰ區(qū)域，同時具有非常強的NIR-Ⅱ拖尾熒光信號，因而也能用于NIR-Ⅱ成像.通過將IRDye 800CW與曲妥珠單抗或PEG連接，能夠對BT474乳腺導管癌細胞及其周圍血管成像［87］.Zhu等［89］將具有高量子產率的IR-12N3與抗體連接，能夠靶向鱗狀上皮細胞癌，提高腫瘤與正常組織的信號比，實現了腫瘤精準定位和手術導航功能.

以ICG結構為基礎，開發(fā)了一系列發(fā)射峰在NIR-Ⅱ的小分子熒光探針.如Ding等［90］將ICG聚甲炔骨架結構中的氮雜環(huán)變成氧雜環(huán)，繼而使用硫原子取代氧原子，發(fā)射波長和激發(fā)波長相繼增加，形成的5H5小分子熒光探針［結構見圖6（A）］展現出更高的量子產率和更強的光穩(wěn)定性，相比于傳統(tǒng)的808 nm激發(fā)波長，1064 nm激發(fā)波長下在NIR-Ⅱa區(qū)域的腫瘤血管成像的分辨率和信噪比極大提高［圖6（B）］.通過在甲炔鏈引入環(huán)己烯基團并在雜環(huán)引入取代基，得到NIR-Ⅱ小分子熒光探針I(yè)R-26［91］，IR-1061［92］，FD-1080［93］和Flav7［94］，它們比ICG的光學穩(wěn)定性和成像分辨率均更好.Bandi等［95］延長聚甲炔骨架，并在其上稠合芳環(huán)，得到吸收峰為1072 nm的過磺化吲哚菁染料FNIR-1072.將FNIR-1072偶聯單克隆抗體和右旋糖酐，使之具有腫瘤靶向性和高的生物相容性，能夠與ICG共同對腫瘤周圍淋巴管和血管進行多色活體成像，展現出很好的腫瘤識別能力.

氟硼二吡咯（BODIPY）是近年來出現的一類具有高光熱穩(wěn)定性的可見光熒光染料.在BODIPY核心的3位引入吸電子取代基，能夠使其發(fā)射波長紅移至NIR-Ⅱ，和酶的底物偶聯后，能夠獲得一系列酶響應性的可激活熒光探針［96，97］.Tang等［98］進一步研發(fā)了雙響應性的NIR-Ⅱ熒光納米探針（HISSNPs），以IR1061作為熒光基團，透明質酸和二硫鍵作為雙重響應結構，保持熒光猝滅狀態(tài)；只有與腫瘤中過表達的透明質酸酶和硫醇反應后，才能觸發(fā)熒光發(fā)射.此探針可以減少非特異性激活，具有較高的腫瘤與正常組織信號比，因而能夠實現乳腺癌的高特異性成像.

除了以具有聚甲炔結構的ICG為模型研發(fā)NIR-Ⅱ小分子熒光探針，引入電子供體-受體-供體結構也能減小最高占據分子軌道（Highest occupied molecular orbital，HOMO）和最低未占分子軌道（Lowest unoccupied molecular orbital，LUMO）之間的能量間隙，使發(fā)射波長紅移至NIR-Ⅱ區(qū)域［38］.大多數具有供體-受體-供體結構的小分子熒光探針以具有強吸電子能力的苯并雙噻二唑（BBTD）為核心，兩邊是強的供電子基團，通過芳香性π橋連接［99，100］.其中，CH1055是典型代表［結構見圖6（C）］，其PEG化后形成的CH1055-PEG是第1個水溶性的小分子熒光探針，它的腎排泄率大于90%，具有非常好的信噪比，在小動物熒光成像中具有很好的應用［101］.為了使CH1055主動靶向腫瘤，Zhou等［102］將與骨鈣蛋白具有相似特性的寡肽PT-7或親合體化學連接到CH1055上，PEG化后得到NIR-Ⅱ小分子熒光探針CH1055-PEG-PT和CH1055-PEG-Affibody，前者能夠對早期體內143B腫瘤進行NIR-Ⅱ區(qū)域高質量成像和引導腫瘤的準確切除；而后者能夠高分辨率地可視化骨肉瘤造成的肺轉移［圖6（D）］.改變連接的多肽分子，能夠靶向不同的腫瘤：CH1055連接葉酸時，能夠主動靶向4T1腫瘤，實現乳腺癌NIR-Ⅱ成像引導下的手術切除［103］；微小染色體維持蛋白2（MCM2）連接的CH1055能夠靶向肝癌組織，在異體移植的HepG2小鼠模型上獲得高對比度和高特異性的腫瘤成像［104］.

Fig.6 Two typical SMDs with polymethine backbone and donor-acceptor-donor structure

雖然供體-受體-供體結構能夠增大發(fā)射波長，但長的共軛骨架往往具有較強的分子間相互作用，激發(fā)態(tài)的熒光團容易受到周圍環(huán)境中水等物質的影響，造成熒光猝滅［81，105］.為了解決這一問題，在供體-受體-供體末端引入屏蔽基團（如二烴化合物鏈），增大位阻，降低分子間相互作用，防止染料聚集造成熒光猝滅［83，88］，接著在噻吩基團上引入取代基，增大供體與受體基團之間的二面角以增強剛性，進一步提高量子產率［88］.IR-FGP是以CH1055為基礎，通過以上兩個策略改造得到的，其噻吩基團上引入了2-［2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基］乙醇，并用芴作為屏蔽基團，同時實現了長波發(fā)射和高量子產率［83］.將小分子有機染料與血漿蛋白絡合，也能提高熒光強度.Antaris等［106］用磺酸基團代替CH1055的羧酸基團，能夠得到具有較好水溶性的NIR-Ⅱ染料CH-4T，它能與血漿蛋白結合，形成超分子聚集體，熒光強度比原來大兩個數量級.

2.2.2 聚集誘導發(fā)光材料 傳統(tǒng)的有機熒光團經常在高濃度或者聚集狀態(tài)下發(fā)生熒光猝滅，影響成像的結果.而聚集誘導發(fā)光材料（AIEgens）能有效解決這一問題.其在離散狀態(tài)下分子內運動活躍，導致熒光猝滅；而聚集狀態(tài)下，由于分子內運動被限制，熒光強度大幅增加［圖7（A）］［26］.AIEgens能夠在相對高的濃度下使用，光穩(wěn)定性強，信噪比高，且生物安全性好，能夠實現長期的靶向和追蹤［107，108］.

目前，大多數AIEgens的發(fā)射波長小于800 nm［109］，將發(fā)射波長紅移至NIR-Ⅱ，可以整合AIE特征和NIR-Ⅱ的優(yōu)勢，提高成像質量［110］.一般策略是將AIEgens設計成共軛的供體-受體結構［111］，并增強供體的給電子能力或受體的吸電子能力.Wu等［112］用硒原子取代硫原子，提高了受體的吸電子能力，得到4，8-雙（4-（2，2-雙（4-（辛氧基）苯基）-1-苯基乙烯基）苯基）［1，2，5］硒二唑-［3，4-f］苯并［c］［1，2，5］噻二唑（BPST）［圖7（B）］，發(fā)射波長增加到1200 nm，其形成的納米顆粒用于腫瘤成像和引導手術切除.Li等［113］在間隔基團噻吩的鄰位引入十二烷基鏈，合成了HQL2［結構見圖7（C）］，其骨架的扭曲程度變大，能夠減少分子內電荷轉移導致的熒光猝滅，同時增強三苯胺的聚集誘導發(fā)光效應.在HQL2表面包裹兩親性分子后形成的納米顆粒具有高生物相容性，能夠在NIR-Ⅱa和NIR-Ⅱb區(qū)域對小鼠腦膠質瘤血管進行高亮度和高清晰度成像［圖7（C）］.同樣是利用高強度的NIR-Ⅱ拖尾發(fā)射，TQ-BPN AIEgens與普朗尼克F-127形成NIR-AIE-dots［圖7（D）］，可以清晰地可視化腫瘤部位的高滲透長滯留效應（EPR），有利于鑒別不同生長時期的腫瘤［圖7（E）］［114］.

Fig.7 Mechanism,strategies of fluorescent properties optimization and tumor imaging of AIEgens

雖然引入供體-受體結構能使發(fā)射波長紅移，但是會導致扭曲的分子內電荷轉移，極大降低了量子產率［115，116］.為了在熒光團吸收波長紅移的同時保留AIE特性，可以通過抑制扭曲的分子內電荷轉移或抑制分子間相互作用，保持高的量子產率［110］.Qu等［117］將烷基基團連接到Q8P上得到Q8PNap，使N，N-雙烷基氨基轉變成季銨鹽，分子平面化，從而有效地抑制了Q8PNap的扭曲的分子內電荷轉移，使熒光效率提高近10倍，能夠區(qū)分原位和轉移小腫瘤以及引導手術切除.Liu等［118］在間隔基團噻吩的鄰位上引入長的烷基鏈，形成2TT-oC6B，與其異構體2TT-mC6B相比具有更大的扭曲構象，能夠阻止近距離的分子間堆積，減少分子間相互作用，因此，具有更好的AIE屬性和更高的熒光量子效率.還可以通過在供體-受體-供體骨架兩端引入四苯基乙烯和三苯胺［26］等能夠旋轉振動的分子馬達，進一步抑制分子間的相互作用，使量子產率增加.

2.2.3 共軛聚合物 共軛聚合物（CPs）具有易加工、光穩(wěn)定性強及光物理特性可調［119］的優(yōu)點，其主鏈為重復的供體-受體單元，提高了分子內電荷轉移，降低了聚合物的帶隙，使發(fā)射波長紅移［120］.然而，低帶隙使基態(tài)和激發(fā)態(tài)電子的振動存在重疊，產生非輻射躍遷，導致其量子產率很低［121］.另外，許多共軛聚合物的水溶性較差，通常需要在其表面包裹兩親性的聚合物形成納米顆粒，以應用于生物體內的水性環(huán)境.聚合物納米顆粒也稱為半導體聚合物點（Pdots），其含有體積或質量分數大于50%的π共軛聚合物，直徑小于100 nm［122，123］.與傳統(tǒng)的熒光探針相比，Pdots具有吸收橫截面大、發(fā)射速度快、熒光量子產率高和光穩(wěn)定性強的優(yōu)點［122］，近年來在NIR-Ⅱ熒光成像和光熱治療中發(fā)揮越來越重要的作用.

通過調節(jié)分子內電荷轉移，可以使共軛聚合物同時具有低帶隙和高熒光強度.Chen等［124］將不同摩爾比的兩種電子受體TTQ和DPP共聚，得到3種共軛聚合物P1～P3，由于P1的強吸電子基團TTQ的摩爾比最小，分子內電荷轉移效應最小，因而具有最大的熒光強度.表面包裹mPEG-DSPE形成P1納米顆粒后，用于4T1荷瘤小鼠的NIR-Ⅱ熒光成像和腫瘤的光熱治療.Zhang等［120］在電子受體噻吩并噻吩（TT）上連接不同長度的噻吩重復單元，得到TT-T，TT-2T和TT-3T 3個醌式聚合物［圖8（A）］.隨著噻吩重復鏈的延長，吸電子的側鏈基團被稀釋，分子內電荷轉移降低，熒光強度變大.PEG化后形成的TT-3T納米顆粒熒光信號最強，在追蹤小鼠體內4T1乳腺癌細胞時展現較好的長期穩(wěn)定性［圖8（B）］［120］.

Fig.8 Fluorescence intensity enhancement of Pdots by structural modification of polymers

通過對聚合物單體結構進行改造，可調節(jié)帶隙和量子產率等光學特征［123］.Liu等［125］通過在聚合物的受體上引入氟取代基，增大了有機溶劑中聚合物的發(fā)射波長；表面連接了兩親性的聚苯乙烯-聚乙二醇-羧基（PS-PEG-COOH）聚合物形成Pdots后，在水性溶液中不僅發(fā)射波長紅移，熒光強度也顯著增加.這是由于碳氟單鍵的引入使Pdots能夠維持疏水內部和減少鏈間相互作用，同時增加共軛骨架的平面性［圖8（C）］，應用此熒光探針能夠辨別野生型和荷瘤小鼠的腦部血管長度、分支和對稱性等血管形態(tài)的不同，進而診斷惡性腦癌［圖8（D）］.而Liu等［126］以喹喔啉（TQ）為電子受體，在其上不同位置引入烷氧取代基，合成了聚合物P1～P3，在苯環(huán)3位進行烷氧基取代的P1具有最大位阻，因而具有最大的紅移波長和最高的熒光亮度.將聚合物P1和PS-PEG-COOH組裝，形成的P1-Pdots具有高量子產率（約1%），可用于荷瘤裸鼠的乳腺癌成像和腫瘤血管的監(jiān)測.

Fig.9 Fluorescence probes integrating NIR-Ⅱimaging with phototherapy

2.3 熒光探針在腫瘤診療中的應用

迄今，NIR-Ⅱ熒光探針在腫瘤成像和手術導航方面的應用已經較為成熟.在腫瘤成像方面，除了通過優(yōu)化熒光探針等方法提高單模態(tài)NIR-Ⅱ成像的質量，許多研究致力于將NIR-Ⅱ熒光成像與其它成像模式相結合，實現整合多種優(yōu)勢的多模態(tài)成像.雙模態(tài)NIR-Ⅱ/光聲成像具有強組織穿透能力、高時空分辨率和高信噪比，是腦血管結構成像和腦部微小腫瘤診斷的有力工具.Guo等［127］報道了一種具有高生物相容性和高光穩(wěn)定性的共軛聚合物納米顆粒，能夠在NIR-Ⅱ窗口對小鼠腦部同時進行熒光和光聲成像，成功定位了高密度頭骨下2.4 mm處的微小腦瘤.NIR-Ⅱ/PET雙模態(tài)成像結合了NIR-Ⅱ熒光成像高時空分辨率的優(yōu)點與PET高組織穿透深度的優(yōu)勢，極大提高了腫瘤成像的效果.Zhang等［128］將NIR-Ⅱ染料CH-4T和放射性核素64Cu裝載入脂質體和介孔硅納米顆粒的混雜體，形成的NIR-Ⅱ/PET雙模態(tài)探針具有高熒光強度，能夠獲得清晰的腫瘤圖像，具有靈敏的術前腫瘤檢測和準確的術中腫瘤切除引導能力.在手術導航方面，近期有臨床研究利用ICG在NIR-Ⅱ窗口的拖尾熒光發(fā)射，首次對23例肝癌患者進行多光譜成像系統(tǒng)引導的腫瘤手術切除，證實了其在臨床手術導航的巨大潛力［20］.隨著對熒光團性質理解的進一步加深，已有一些研究嘗試將NIR-Ⅱ熒光探針應用于腫瘤光療.光療法主要包括光熱治療（Photothermal therapy，PTT）和光動力治療（Photodynamic therapy，PDT）.與傳統(tǒng)的放療和化療相比，光療具有非侵入性、低毒性和低耐藥性的優(yōu)點，被認為是傳統(tǒng)癌癥治療的重要替代方法［129］.某些熒光探針由于具有光熱轉換特性或產生活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的能力，能夠用于NIR-Ⅱ成像引導的PTT或PDT，將診療一體化，極大地提高了腫瘤治療的精準性和有效性［81，130］.

PTT通過光熱劑將輻照光的能量轉換成熱能，利用局部熱量消融腫瘤，具有很好的腫瘤抑制作用［131，132］.成像引導的PTT能夠實時監(jiān)控光熱劑在腫瘤的累積，確定最佳的光熱治療時間.Li等［133］將有機小分子熒光探針Flav7與兩親性的多肽結合，形成NIR-Ⅱ大分子熒光探針.其血循環(huán)時間長，在腫瘤部位的富集增大；且光熱轉換效率（42.3%）高，具有很好的腫瘤光熱切除效應.Zhang等［134］合成了一種新穎的多功能小分子熒光探針SY1080［圖9（A）］，在808 nm激光照射下產生光熱效應，不僅能夠消融腫瘤細胞，還能產生聲波，實現NIR-Ⅱ/光聲雙模態(tài)成像［圖9（B）］.Meng等［135］同樣利用小分子熒光探針I(yè)R1048-MZ實現了NIR-Ⅱ/光聲成像和PTT的聯合.除了小分子熒光探針，共軛聚合物納米顆粒［136］、AIEgens［137］、小分子熒光探針之間有序地錯位平行排列形成的J-聚集體［138］也可用于NIR-Ⅱ成像引導的PTT.Yang等［139］用人血清白蛋白納米籠限制Ag2S QDs的生長以控制其尺寸，得到的Ag2S納米顆粒具有較長的血液循環(huán)時間和較高的腫瘤部位富集能力，且具有較高的光熱轉化效率（33.7%～35%），能夠同時實現高靈敏度的NIR-Ⅱ/光聲雙模態(tài)成像和對乳腺腫瘤的光熱消融.

PDT是利用光敏劑激活后產生的具有細胞殺傷毒性的ROS，促使腫瘤細胞凋亡和壞死［140～142］.ROS有兩種產生途徑：（1）三重激發(fā)態(tài)的光敏劑直接將電子或光子轉移到周圍的生物分子中，產生自由基；（2）光敏劑將能量轉移給三重基態(tài)分子氧（3O2），產生單線態(tài)氧（1O2）［143］.大多數有機光敏劑的吸收峰限制在600～800 nm之間，超過800 nm的光子吸收無法提供足夠的能量使氧激發(fā)到單線態(tài)，從而無法產生足夠的ROS［144］，所以目前臨床上的PDT受限于淺表腫瘤［145］.提高PDT治療深部腫瘤能力的策略之一是利用UCNP將NIR轉換為可見光發(fā)射，而后激活有機光敏劑，產生ROS.Wang等［146］將表面修飾后的UCNP附著在裝載了ICG的紅細胞上.通過靜脈注射后，紅細胞能夠有效靶向和滯留腫瘤，在不同的光激發(fā)波長下分別實現成像和PDT的功能.在808 nm激發(fā)光下釋放ICG和氧氣，發(fā)射的NIR-Ⅱ熒光用于成像引導的精確腫瘤切除；在980 nm激發(fā)光下，UCNP通過上轉換產生550 nm可見光，激活光敏劑，將氧氣轉換成1O2，殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤轉移［圖9（C）］.然而上轉換所需的激光強度高，往往超過皮膚的耐受閾值，故開發(fā)能夠直接吸收NIR的分子材料或許是一種更好的策略.Zhang等［147］設計了尺寸極小的Cu2-xSe納米顆粒，在NIR-Ⅱ激發(fā)光下通過電子和能量轉移，能夠有效降解腫瘤內的H2O2和氧氣，生成大量的氧自由基，顯著抑制腦部惡性膠質母細胞瘤的生長.Vijayaraghavan等［148］設計的金納米棘球能夠在NIR窗口促進1O2的形成，在體內同時發(fā)揮PDT和PTT治療效應，破壞實體腫瘤.而Gao等［149］在小分子熒光探針的供體-受體-供體結構中引入大位阻基團，獲得了NIR-Ⅱ發(fā)射的光敏劑2，2′-（（（（（（苯并［c］［1，2，5］噻二唑-4，7-二基）雙（2，3-二氫噻吩并［3，4-b］［1，4］二惡英-7，5-二基））雙（4，1-亞苯基））雙（苯氮雜二基））雙（4，1-亞苯基））雙（甲基亞甲基））二丙二腈（BNET）.由于扭曲的分子內電荷轉移效應，其發(fā)射峰強度極大提高，克服了長波發(fā)射導致1O2產量不足的障礙，其結合白蛋白形成的納米顆粒能夠對原位結腸癌或胰腺癌的小鼠進行有效的成像引導的PDT.

此外，研究人員還利用藥物遞送系統(tǒng)實現抗腫瘤藥物與熒光探針的共遞送，將NIR-Ⅱ成像引導的光熱治療與藥物治療進一步結合，獲得更佳的腫瘤治療效果.Li等［150］設計了一個核心為ICG-RENPs的水凝膠，在光熱介導下的高溫環(huán)境與富含谷胱甘肽的腫瘤微環(huán)境刺激下逐步降解，釋放裝載在其中的抗腫瘤藥物阿霉素.這一系統(tǒng)將成像技術、光熱治療和化療結合在一起，能夠很好地對腫瘤進行診斷和治療，并抑制其轉移.Li等［151］將化療藥物培美曲塞、Nd3+和熒光探針I(yè)R825組裝成表面類似病毒的納米藥物，在其表面包裹對酸敏感的PEG殼，形成納米球.在循環(huán)血液中，PEG殼能夠有效減少免疫系統(tǒng)的清除，提高系統(tǒng)循環(huán)時間.當移動到腫瘤部位時，酸性微環(huán)境刺激PEG殼脫落，露出類似病毒的表面，增大細胞對其的內吞作用，同時提高在NIR-Ⅱ區(qū)域的光熱轉換效率.進入細胞后聚集體解體，釋放藥物和熒光探針.在準確的熒光成像引導下，這一系統(tǒng)能夠特異性提高腫瘤的光熱治療及化療效果，完整消除腫瘤，且在單個治療周期內無復發(fā).

除了與傳統(tǒng)的腫瘤治療手段化療結合外，NIR-Ⅱ成像還可與分子層面的腫瘤治療手段（如免疫治療、基因治療和氣體治療［152］）相結合.Liu等［153］將光敏性探針BDP-I-N與兩親性的接枝聚合物自組裝形成納米顆粒，隨后將程序性死亡配體-1（PD-L1）抗體連接在納米顆粒表面.一方面光敏劑在808 nm激發(fā)光下具有高的1O2產率，用于光動力療法消除原位腫瘤.另一方面，PD-L1抗體能夠靶向腫瘤，提高納米顆粒在MC38腫瘤中的富集，進而提高NIR-Ⅱ成像的熒光強度和腫瘤與正常組織的信號比；其免疫抑制作用能夠增強T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用.這一納米顆粒將實時成像、光動力療法和免疫治療三者結合，使腫瘤在30 d內消除且40 d內無復發(fā)，達到很好的治療效果.CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是腫瘤基因治療的重要工具.Li等［154］設計了半導體聚合物簇，不僅能夠遞送CRISPR/Cas9，還能通過NIR-Ⅱ激光下的光熱轉換控制CRISPR/Cas9質粒DNA的溶酶體逃逸，使之對特定部位的基因進行編輯，實現腫瘤的精準治療.氣體治療通過CO，NO［155］和H2S［156］等氣態(tài)分子在線粒體中產生ROS誘導腫瘤細胞死亡，其副作用極小.Sun等［157］將具有高光熱轉換效率的共軛聚合物與熱響應性的CO供體自組裝形成納米顆粒，在1064 nm激光下，不僅能夠對MCF-7荷瘤小鼠的腦血管進行高特異性成像，還實現了光熱療法和氣體治療腫瘤的協同作用.

3 總結與展望

相比傳統(tǒng)的臨床診療影像學技術，NIR-Ⅱ熒光成像作為一種低散射、深層組織與器官穿透、高成像分辨率以及無電離輻射危險的活體成像技術，在腫瘤診療領域受到了廣泛關注.本文綜合評述了不同結構類型熒光探針的特征，并歸納總結了優(yōu)化其理化性能的若干策略.其主要優(yōu)化方向為了提升其光學性能（包括發(fā)射波長和熒光量子產率）.無機熒光團光學性能的提高通常需要根據不同的發(fā)光機制制定策略；而有機熒光團多為共軛結構，通過延長共軛鏈、提高電子供體與受體之間的電子推拉作用可增大其發(fā)射波長，增加量子產率則是通過提高分子的剛性和空間位阻來實現.此外，為了增強其水溶性及生物相容性，可以使用表面修飾、與蛋白質絡合以及在分子中引入極性基團等方式.同時，許多研究者也設計了具有主動靶向性和生物響應性的熒光探針來提高其成像精準性.

目前，NIR-Ⅱ熒光探針在腫瘤動物模型上的應用已得到了初步驗證，對腦瘤等深層腫瘤的檢測能力強且靈敏度高，有利于腫瘤的早期診斷；并且其對腫瘤的實時成像效果好，能夠動態(tài)觀察腫瘤血管的血流狀況，有利于腫瘤的病理研究.此外，NIR-Ⅱ熒光探針具有術中導航的能力，能夠準確辨別腫瘤與正常組織的邊界，可顯著提高腫瘤切除的準確性和有效性.

然而，現有NIR-Ⅱ熒光探針的種類仍較少，其成像性能有待進一步提升，且缺乏高靈敏度的NIR-Ⅱ波段熒光檢測器.臨床上使用的熒光劑大多是具有NIR-Ⅱ拖尾發(fā)射的NIR-Ⅰ熒光探針（如ICG，OTL38，IRDye 800CW等）.由于1450 nm處存在能有效抑制背景信號的水的強吸收，NIR-Ⅱx波段具備最佳成像潛力.將臨床現有的NIR-Ⅰ熒光術中導航技術拓展至1300 nm以上的NIR-Ⅱ波段是實現精準醫(yī)療關鍵的一步，然而目前臨床上尚缺少在1300 nm以上有足夠發(fā)射強度的可用染料，設計與合成在1300 nm以上具有高效發(fā)射能力，尤其是在1450 nm附近具有高發(fā)射強度的小分子染料仍是一大挑戰(zhàn).

其次，NIR-Ⅱ光學探針的生物安全性也是其臨床轉化面臨的一大障礙.對于無機熒光探針（如量子點）而言，構建核/殼和核/殼/殼量子點，以避免重金屬離子泄漏或合成不含有毒重金屬離子的新型量子點有利于提升量子點的體內穩(wěn)定性、生物相容性，以降低生物毒性.對于有機熒光探針而言，全面評估外源性熒光探針的體內吸收、代謝行為及潛在的長期生物毒性對推動其臨床應用至關重要.

此外，進一步加強基于NIR-Ⅱ熒光成像的抗腫瘤療法也是未來的重要研究方向.目前，NIR-Ⅱ成像輔助腫瘤外科手術所用的均為非特異性探針，可進一步探究不同探針的靈敏度與特異性，尋找臨床應用中針對不同腫瘤的最佳探針.利用多模態(tài)成像手段（如將NIR-Ⅱ熒光寬場顯微成像與光聲成像結合）可以彌補各自局限性，破譯更多的生物信息，實現更精準和深入的腫瘤成像.同時，利用腫瘤微環(huán)境存在的特異性生理信號，可以實現時間和空間響應性腫瘤成像及靶向精準遞藥［158］.NIR-Ⅱ成像也可對體中的免疫細胞進行非侵入性成像和跟蹤，可以監(jiān)測抗腫瘤免疫反應，有助于優(yōu)化治療劑量和治療時間窗，為癌癥免疫治療提供新的思路.