單細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像分析

趙雪琪，趙 越，薛 靜，白 敏，陳 鋒，孫 穎，宋大千，趙永席

（1.吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院,吉林省光譜分析儀器工程技術(shù)研究中心,長春 130012；2.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,生命分析化學(xué)與儀器研究所,生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點實驗室,西安 710049）

細(xì)胞成像技術(shù)的革新不斷推動生命科學(xué)的發(fā)展，通過成像實時清晰地觀測細(xì)胞內(nèi)及胞外微環(huán)境的細(xì)微變化，對于細(xì)胞分析十分重要.單細(xì)胞成像分析可提供不同細(xì)胞個體中分子的含量與分布信息，不僅在分析胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)、分子間反應(yīng)、細(xì)胞間差異以及相互作用等方面應(yīng)用廣泛，還可以通過多組學(xué)聯(lián)合分析，解析不同類型腫瘤細(xì)胞的耐藥性差異，從而實現(xiàn)臨床個體化精準(zhǔn)治療［1］.在單細(xì)胞成像中，細(xì)胞中的物質(zhì)變化需要通過探針作為媒介來實現(xiàn)信號的輸出.其中，單細(xì)胞熒光成像由于具有熒光信號靈敏度高、特異性好及易于檢測等優(yōu)點，已經(jīng)成為生命分析領(lǐng)域的研究熱點［2］.

目前，單細(xì)胞熒光成像的目標(biāo)物已覆蓋核酸表觀修飾［3］、細(xì)胞酶活性［4］、蛋白質(zhì)間相互作用［5］及胞內(nèi)外小分子動態(tài)變化［6］等很多方面.其中，發(fā)展較為成熟的檢測方法有熒光重組蛋白［7］、有機(jī)小分子熒光探針［8，9］及熒光核酸探針［10］等.熒光重組蛋白是由熒光蛋白與目標(biāo)蛋白基因融合后再表達(dá)，具有很好的特異性，但蛋白體積較大且易發(fā)生熒光漂白.與之相比，有機(jī)小分子熒光探針的體積更小且熒光強(qiáng)度更高.然而，有機(jī)染料的膜通透性較差且容易發(fā)生非特異性吸附［11］.

核酸熒光探針［12］具有可程序化設(shè)計、易修飾活性功能基團(tuán)和可擴(kuò)增放大檢測信號等特點，在檢測痕量目標(biāo)物方面具有很大的應(yīng)用潛力.由于熒光分子波譜重疊，常見方法大多受到檢測通道種類的限制，檢出限和靈敏度很難達(dá)到理想狀態(tài)［13，14］.然而，細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物種類多、豐度低，同源組分結(jié)構(gòu)相似，分子鄰近距離短.因此，如何實現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)多組分標(biāo)志物的精準(zhǔn)識別與高靈敏定量分析，已經(jīng)成為生命分析領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)之一，核酸編碼技術(shù)由此進(jìn)入大眾視野.

核酸編碼技術(shù)最早于20世紀(jì)90年代被提出［15］，在后期的不斷完善和發(fā)展中，已被拓展應(yīng)用于文庫篩選［16，17］、測序［18］及成像［19，20］等方面.脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）條碼具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、數(shù)目多及易于制備等特點［21］，已成為核酸編碼中應(yīng)用最廣泛的工具之一.針對不同目標(biāo)物的特征，可通過不同的分子反應(yīng)使其攜帶DNA條碼，再通過這些條碼上不同的熒光信號來區(qū)分目標(biāo)物［22，23］.由于單一條碼分子的熒光強(qiáng)度難以直接檢出，可聯(lián)合核酸擴(kuò)增技術(shù)實現(xiàn)信號放大［24］.近年來，等溫擴(kuò)增以其溫和的反應(yīng)條件、快速有效的擴(kuò)增和簡單的操作被廣泛用于生物成像分析中［25］.在等溫擴(kuò)增中，常用的反應(yīng)有滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（Rolling circle amplification，RCA）、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）、引物交換反應(yīng)（Primer exchange reaction，PER）和催化發(fā)夾組裝反應(yīng)（Catalyzed hairpin assembly，CHA）等.其中，RCA是環(huán)狀探針和部分序列互補(bǔ)配對的引物探針雜交后，在聚合酶的作用下延伸引物并生成重復(fù)序列的過程.通常與單分子熒光原位雜交技術(shù)（Single-molecule fluorescentin situhybridization，smFISH）聯(lián)合使用，雜交與重復(fù)序列互補(bǔ)的熒光探針來產(chǎn)生可檢測的熒光信號點.PER是由單鏈引物和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA在聚合酶的作用下反復(fù)進(jìn)行鏈置換反應(yīng)，從而將引物末端延長出重復(fù)序列的過程，可通過連續(xù)雜交信號探針放大檢測信號.HCR是一對部分互補(bǔ)的發(fā)夾序列在被單鏈核酸雜交觸發(fā)后，通過鏈置換反應(yīng)不斷交替打開更多發(fā)夾并生成長鏈DNA的過程.CHA與HCR類似，但兩對發(fā)夾互補(bǔ)后形成的雙鏈結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，從而使觸發(fā)反應(yīng)的單鏈核酸恢復(fù)游離狀態(tài)，繼續(xù)引發(fā)下一組發(fā)夾發(fā)生反應(yīng)，生成大量的短鏈DNA.與RCA和PER相比，HCR和CHA不需要酶介導(dǎo)，但序列的設(shè)計較為復(fù)雜［25～27］.因此，聯(lián)合核酸編碼與擴(kuò)增技術(shù)，通過特異性識別轉(zhuǎn)化分子特征為獨特DNA條碼的擴(kuò)增，可實現(xiàn)特異、靈敏的單細(xì)胞多組分檢測，對于當(dāng)前生物和臨床醫(yī)學(xué)研究都有重大意義.

Fig.1 Progress in nucleic acids-encoded amplification for single-cell imaging

本文介紹了單細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像分析的最新進(jìn)展，結(jié)合本課題組近期的研究成果，根據(jù)不同的編碼原理從原位和活細(xì)胞角度對細(xì)胞內(nèi)的核酸編碼擴(kuò)增成像方法進(jìn)行介紹（圖1），并對該技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行展望與分析.

1 原位核酸編碼擴(kuò)增成像

核酸編碼擴(kuò)增是將核酸編碼與等溫擴(kuò)增結(jié)合從而實現(xiàn)多目標(biāo)物識別轉(zhuǎn)化檢測的一種方法.其中最重要的一步就是通過化學(xué)反應(yīng)給多種目標(biāo)物標(biāo)記上不同的DNA條碼.目前常用于原位細(xì)胞成像的核酸編碼方式主要基于雜交反應(yīng)、化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)、抗原-抗體免疫反應(yīng)與組合反應(yīng)等，可與等溫擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合，實現(xiàn)后續(xù)的信號放大.

Fig.2 Schematic of MERFISH[37]

1.1 基于雜交反應(yīng)的編碼原理

基于堿基互補(bǔ)配對原則的雜交反應(yīng)是堿基相關(guān)反應(yīng)中最常見的一種，也是核酸探針進(jìn)行檢測、成像和編碼的基礎(chǔ).在核酸探針上修飾同位素［28］、生物素［29］或熒光基團(tuán)［30］等可以對目標(biāo)物進(jìn)行成像和分析.對于已知序列，可以設(shè)計互補(bǔ)的核酸探針直接進(jìn)行雜交反應(yīng)編碼［31，32］；對于未知序列，則需要先連接上帶有已知序列的通用接頭再進(jìn)行編碼.smFISH是雜交編碼成像的常用方法，通過熒光基團(tuán)修飾的短核酸探針與目標(biāo)物上不同的序列區(qū)域雜交，使目標(biāo)物修飾上多個熒光分子，從而放大信號，實現(xiàn)單分子熒光成像［33，34］.由于熒光基團(tuán)種類的限制，smFISH很難成像多種目標(biāo)物［35，36］.

Zhuang等［37］提出的多重糾錯熒光原位雜交（Multiplexed error-robust FISH，MERFISH）技術(shù)利用FISH組合標(biāo)記和能夠糾錯的編碼方法進(jìn)行單細(xì)胞中核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）的成像，解決了smFISH在單個細(xì)胞中同時成像的RNA種類數(shù)量受限的問題，實現(xiàn)了空間分辨的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析.針對特定目標(biāo)RNA序列可設(shè)計連續(xù)雜交不同區(qū)域的多個編碼探針，放大檢測信號.編碼探針由一段雜交序列和兩段讀出序列組成，每輪雜交時加入一種與某段讀出序列互補(bǔ)的熒光探針，有熒光信號的記為“1”，沒有熒光信號的記為“0”（圖2）.經(jīng)過N輪雜交后，形成一段含有N個字節(jié)的二進(jìn)制碼，再通過漢明距離降低編碼錯誤率，最終可以通過14輪雜交實現(xiàn)單細(xì)胞中1001種RNA的成像［圖3（A）］.由于FISH探針存在脫靶問題，在增加編碼輪數(shù)、成像更短的RNA以及成像組織樣本時，會產(chǎn)生脫靶背景［38］.研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)非特異性結(jié)合脫靶熒光探針的主要物質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以選擇將樣本嵌入聚丙烯酰胺中以減小脫靶背景.樣本內(nèi)的RNA錨定在聚丙烯酰胺基質(zhì)上，隨后去除蛋白質(zhì)，再進(jìn)行MERFISH.實驗結(jié)果表明，該方法在藍(lán)綠光譜范圍內(nèi)使得MERFISH成像從2個通道擴(kuò)展到4個通道，并且性能沒有降低.因此減少了雜交編碼的輪數(shù)，縮短了檢測時間，提高了MERFISH的通量［38］.基于MERFISH原理，該課題組發(fā)展了一系列應(yīng)用.在掃描基因變異文庫中［39］，為每個含有待測遺傳變異的質(zhì)粒隨機(jī)地分配一個條形碼，使得每個細(xì)胞只檢測一種高豐度的被編碼的RNA，多輪熒光成像后進(jìn)行信號的匯總，這樣更亮的信號就有更低的錯誤率.通過這種方法識別了更亮更穩(wěn)定的熒光蛋白YFAST中的60000個變異位點.此外，Zhuang等［40］還利用MERFISH建立一個分子級和空間分辨的小鼠初級運(yùn)動皮層細(xì)胞圖譜［圖3（B）］.在MERFISH基礎(chǔ)上，他們結(jié)合分枝DNA（branched DNA，bDNA）擴(kuò)增進(jìn)行信號放大［41］.在MERFISH第一步雜交完成后，加入一端與讀出條碼互補(bǔ)、另一端帶有多段重復(fù)序列的初級信號放大條碼進(jìn)行第一次放大.二級信號放大條碼的結(jié)構(gòu)與初級信號放大條碼一樣，一端與初級信號放大條碼互補(bǔ)雜交，另一端與多個熒光探針雜交，使MERFISH的信號進(jìn)行兩輪放大，提高效率.

Fig.3 Data of application of MERFISH

Cai等［42］提出了連續(xù)單分子熒光原位雜交（Sequential FISH，seqFISH）的方法，對固定細(xì)胞中的信使RNA（Message RNA，mRNA）進(jìn)行連續(xù)探針雜交，每輪探針帶有不同顏色的熒光團(tuán)，在一輪雜交結(jié)束后，通過DNA酶降解探針，再進(jìn)行下一輪雜交［圖4（A）］.因為細(xì)胞是固定的，所以對應(yīng)每個mRNA的熒光點在每輪成像中都保持在原位，由此產(chǎn)生一種獨特的熒光序列條碼，實現(xiàn)mRNA的成像.由于smFISH在組織成像中較難實現(xiàn)，當(dāng)前發(fā)展的基于seqFISH的方法都是細(xì)胞成像.為了實現(xiàn)復(fù)雜組織的成像，他們從信號放大和高效的誤差修正兩方面對seqFISH進(jìn)行改進(jìn)，對海馬的結(jié)構(gòu)組織進(jìn)行單細(xì)胞分辨率的解析［43］.該方法采用單分子雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Single-molecule HCR，smHCR）進(jìn)行信號擴(kuò)增，多個編碼探針雜交到mRNA上后，探針上突出的單鏈部分通過互補(bǔ)雜交打開帶有熒光-猝滅基團(tuán)的發(fā)夾1，發(fā)夾1再用同樣的方式打開發(fā)夾2，不斷循環(huán)生成帶有很多熒光基團(tuán)的DNA長鏈聚合物.該smHCR產(chǎn)物可以被DNA酶消化，并且mRNA在腦組織切片中可以重新雜交，從而實現(xiàn)HCR-seqFISH［圖4（B）］.

Deisseroth等［44］提出了一種能在完整組織中進(jìn)行RNA原位測序的方法，命名為空間分辨轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增示值圖譜分析（Spatially-resolved transcript amplicon readout mapping，STARmap）.他們將含有不同DNA條碼的掛鎖探針雜交到mRNA上，在RCA過程中加入一部分氨基修飾的堿基，最終得到含有多個相同條碼和氨基修飾的RCA產(chǎn)物.丙烯酸N-羥基琥珀酰亞胺酯與氨基反應(yīng)，得到丙烯酰胺基修飾的RCA產(chǎn)物，隨后與丙烯酰胺單體共聚形成水凝膠-DNA擴(kuò)增子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).該結(jié)構(gòu)由共價鍵連接，可以在后續(xù)去除蛋白和多輪探針清洗中保持穩(wěn)定.DNA條碼由5個隨機(jī)堿基組成，形成1024個不同的條碼.只有當(dāng)讀出探針和熒光探針與DNA條碼完全雜交時，才能穩(wěn)定連接并產(chǎn)生熒光信號.每輪識別一個堿基，讀出探針的堿基數(shù)逐個遞增，熒光探針的堿基數(shù)逐個遞減［圖4（C）］.在一輪識別結(jié)束后，加入甲酰胺去除核酸探針，消除測序過程中錯誤的累積.最后通過與相應(yīng)的基因進(jìn)行序列比對，STARmap實現(xiàn)了小鼠大腦切片上單細(xì)胞分辨率的160～1020個基因的檢測.

Fig.4 Schematic of hybridization encoded amplification methods

Fig.5 Schematic and data of SeqEA[46]

Yin等［45］提出了一種基于FISH的信號放大方法，命名為基于交換反應(yīng)的熒光原位雜交信號放大法（Signal amplification by exchange reaction-FISH，SABER-FISH）.DNA條碼由信號識別條碼和信號放大條碼兩部分組成，信號識別條碼和目標(biāo)物互補(bǔ)雜交，信號放大條碼預(yù)先在體外通過PER合成含有重復(fù)序列的長鏈.當(dāng)DNA條碼和目標(biāo)物雜交后，每輪加入一種與信號放大條碼互補(bǔ)的熒光探針進(jìn)行快速雜交成像，然后用低離子強(qiáng)度緩沖液迅速洗脫探針，再進(jìn)行下一輪雜交，以實現(xiàn)多輪編碼擴(kuò)增成像.

Li等［46］提出了一種熒光編碼擴(kuò)增方法——核酸序列編碼擴(kuò)增（Sequence-encoded amplicon，SeqEA），利用目標(biāo)RNA介導(dǎo)環(huán)形識別探針環(huán)化并觸發(fā)RCA信號放大，通過熱力學(xué)調(diào)控RCA產(chǎn)物與熒光探針的雜交效率實現(xiàn)熒光信號的改變，即可對目標(biāo)物進(jìn)行熒光編碼.與傳統(tǒng)RCA熒光成像不同的是，SeqEA中RCA的掛鎖探針分為兩段條碼，分別對應(yīng)帶有紅色和綠色熒光基團(tuán)的兩種熒光探針.改變掛鎖探針上與熒光探針對應(yīng)段的堿基序列，就會產(chǎn)生不能與熒光探針完全配對雜交的RCA產(chǎn)物，從而降低熒光探針的雜交效率，使熒光強(qiáng)度降低（圖5）.通過這種方法設(shè)計了36個雙色熒光條碼，當(dāng)使用更多顏色的熒光基團(tuán)時，SeqEA的編碼能力可以成倍提高.

基于FISH發(fā)展的多輪雜交編碼成像實現(xiàn)了大量目標(biāo)物的檢測，并在后續(xù)發(fā)展中不斷完善，對于構(gòu)建文庫和生物體的全局分析起到了非常重大的作用.但是雜交編碼原理僅能識別序列差異，無法分辨堿基修飾基團(tuán)、核酸空間鄰近關(guān)系等非序列特征信息.

Fig.6 Schematic and data of Clicker-FISH[53]

1.2 基于化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)的編碼原理

化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)編碼通常是將化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)標(biāo)記到核酸探針上，通過化學(xué)基團(tuán)與目標(biāo)物之間的特定化學(xué)反應(yīng)使目標(biāo)物標(biāo)記上不同的DNA條碼.DNA編碼的小分子文庫篩選中提供了很多修飾方法和化學(xué)反應(yīng)［16，47，48］，其中，點擊化學(xué)反應(yīng)因其生物相容性好、操作簡單、反應(yīng)條件溫和而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像中［49～52］.

在本課題組的研究工作［53］中，點擊化學(xué)反應(yīng)編碼滾環(huán)擴(kuò)增的熒光原位雜交成像（Click-encoded rolling FISH，Clicker-FISH）已被用于單細(xì)胞RNA多聚腺苷酸化及結(jié)構(gòu)的可視化成像.胞內(nèi)RNA會在其加工過程中產(chǎn)生多聚腺苷酸（Polyadenylic acid，polyA）尾巴，部分RNA還會折疊成部分單鏈、部分雙鏈的莖環(huán)結(jié)構(gòu).成像可獲取PolyA、單鏈RNA（Single-stranded RNA，ssRNA）和雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA，此方法中即莖環(huán)結(jié)構(gòu)）等加工與結(jié)構(gòu)信息，揭示其亞細(xì)胞時空分布，對于解析細(xì)胞狀態(tài)具有重要意義.結(jié)合活細(xì)胞代謝標(biāo)記和固定細(xì)胞化學(xué)修飾標(biāo)記方法，使3種目標(biāo)物分別標(biāo)記上不同的化學(xué)基團(tuán)，其標(biāo)記方法分別對應(yīng)以下3種反應(yīng)機(jī)理：（1）2-炔基腺苷（2-Ethynyl-adenosine，2-EA）在活細(xì)胞代謝中被聚合到polyA尾巴上；（2）細(xì)胞固定后，疊氮修飾的RNA?；噭ˋzide-modified 2-methylnicotinic acid imidazolide，NAI-N3）特異性與單鏈暴露的2-OH基團(tuán)發(fā)生?；磻?yīng)；（3）在365 nm紫外光照射條件下，通過環(huán)辛烯功能化的補(bǔ)骨脂素衍生物（Trans-cyclooctene psoralen，TCO-Pso）標(biāo)記RNA雙鏈區(qū)域，與雙鏈RNA上的嘧啶對交錯反應(yīng)［圖6（A）］.隨后，銅催化的疊氮與炔烴、無銅的疊氮與二苯并環(huán)辛炔（Dibenzocyclooctyne，DBCO）和烯烴與四嗪（Tetrazine，Tz）3種點擊化學(xué)反應(yīng)分別將3種不同的DNA條碼標(biāo)記到目標(biāo)物上.對3種DNA條碼進(jìn)行RCA后，雜交熒光探針進(jìn)行成像［圖6（B）］.基于此原理，該方法在增加DNA條碼的情況下也可以實現(xiàn)RNA及相關(guān)蛋白的可視化成像，與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組成像方法進(jìn)行整合后，在研究轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)及序列成像方面也有很大的應(yīng)用潛力.

此外，本課題組還通過偶聯(lián)編碼進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)表觀修飾的識別與成像.Zhao等［54］提出了一種利用生物正交的化學(xué)標(biāo)記成像單細(xì)胞內(nèi)兩種氧化胸腺嘧啶的方法.他們對5-羥甲基尿嘧啶［5-（Hydroxymethyl）uracil，5hmU］和5-甲?；蜞奏ぃ?-Formyluracil，5fU）偶聯(lián)編碼標(biāo)記后擴(kuò)增，結(jié)合熒光成像和測序，實現(xiàn)了對基因組中兩種氧化胸腺嘧啶的量化和精確繪制.在5-羥甲基尿嘧啶磷酸激酶（5hmU DNA kinase，5-HMUDK）作用下，γ磷酸炔基化的三磷酸腺苷類似物（Adenosine triphosphate-γ-alkyne，ATP-γalkyne）通過化學(xué)酶標(biāo)法特異性識別5hmU并標(biāo)記上炔基，疊氮修飾的DNA條碼通過點擊化學(xué)反應(yīng)連接上炔基修飾的5hmU.隨后，硼氫化鈉將5fU還原成5hmU，用同樣的方法給5fU標(biāo)記上另一種DNA條碼，對兩個條碼進(jìn)行RCA和FISH成像，實現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)兩種修飾堿基的可視化定量.

除了點擊化學(xué)反應(yīng)，馬來酰亞胺與巰基的偶聯(lián)反應(yīng)應(yīng)用也很廣泛.本課題組將微液滴凝膠與偶聯(lián)核酸編碼整合，提出了一種差異化成像單細(xì)胞內(nèi)兩種5-羥甲基嘧啶的方法，命名為單細(xì)胞微流凝膠液滴5hmU和5hmC差異可視化（Single-cell 5hmU and 5hmC differentiated visualization in microfluidic hydrogel droplets，sc5hmU/5hmC-microgel）［23］.在液滴捕獲單細(xì)胞后，利用凝膠結(jié)構(gòu)固定胞內(nèi)的大分子核酸.γ磷酸巰基化的三磷酸腺苷類似物（Adenosine-5-O-thiotriphosphate，ATP-γ-S）在5-HMUDK作用下將5hmU特異性標(biāo)記上巰基，隨后T4噬菌體β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（T4 phageβ-glucosyltransferase，β-GT）將5-羥甲基胞嘧啶（5-Hydroxymethylcytosine，5hmC）特異性標(biāo)記上疊氮葡萄糖.再通過化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)使馬來酰亞胺和DBCO修飾的DNA條碼分別標(biāo)記到5hmU和5hmC位點，經(jīng)RCA后成像兩種堿基的位置（圖7）.該方法實現(xiàn)了對于相似組分的編碼成像，并結(jié)合微流液滴進(jìn)行單細(xì)胞分析，擴(kuò)大了微流芯片和核酸編碼擴(kuò)增成像的應(yīng)用.

Fig.7 Schematic and data of sc5hmU/5hmC-microgel[23]

與利用雜交反應(yīng)進(jìn)行條碼標(biāo)記的方式相比，化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)可以對未知序列以及不能直接雜交核酸探針的目標(biāo)物（如修飾堿基、蛋白和雙鏈核酸等）進(jìn)行DNA條碼的標(biāo)記，擴(kuò)大了核酸編碼的應(yīng)用范圍.但是目前反應(yīng)條件溫和、高效、生物相容性好的化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)種類有限，如何拓展更多的反應(yīng)也是需要關(guān)注的方面之一.

1.3 基于抗原-抗體免疫反應(yīng)的編碼原理

抗原-抗體免疫反應(yīng)在生物分析檢測中已經(jīng)發(fā)展成熟，在此基礎(chǔ)上的三明治信號放大方法也有很多種，如抗體-抗原-抗體、抗體-抗體-核酸等.由于抗體本身具有識別功能且種類很多，因此將抗體與DNA條碼通過通用的偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合在一起形成抗體-核酸編碼探針可以擴(kuò)大目標(biāo)物的識別范圍［55］.

Yin等［56］利用同時帶有N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）酯基和馬來酰亞胺基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)將抗體和DNA條碼連接到一起形成抗體-核酸探針.NHS酯基和馬來酰亞胺基團(tuán)分別與賴氨酸上殘留的氨基和巰基修飾的DNA條碼發(fā)生反應(yīng)［圖8（A）］.抗體-核酸探針可以直接識別目標(biāo)物，也可以作為二級抗體進(jìn)行信號放大.作者還將Tz修飾的DNA條碼和反式環(huán)辛烯（Trans-cyclooctene，TCO）修飾的納米抗體通過點擊化學(xué)反應(yīng)結(jié)合到一起.納米抗體尺寸可以達(dá)到～1.5 nm×2.5 nm，在很大程度上提高了熒光信號空間位置的準(zhǔn)確性.此外，他們還提出了一種快速洗脫成像的方法［57］，也應(yīng)用在SABER-FISH中.修飾不同DNA條碼的抗體-核酸探針識別目標(biāo)物后，每輪加入一種熒光探針雜交，再用低離子強(qiáng)度緩沖液迅速洗脫探針，進(jìn)行下一輪雜交，原則上可以循環(huán)無限次.由于每輪反應(yīng)時間很短，探針雜交不夠穩(wěn)定，因此容易被洗掉，但也會帶來熒光信號弱且不穩(wěn)定的問題.

Fig.8 Schematic of antigen-antibody encoding methods

Nolan等［58］提出了一種高度多路成像的方法索引共檢測（Co-detection by indexing，CODEX），通過比較正常小鼠與患免疫疾病小鼠的脾臟，觀察脾細(xì)胞的相互作用動力學(xué).將5′突出的雙鏈DNA條碼修飾到抗體上，每組抗體上5′突出的長度逐個遞增，稱為索引（Index）堿基，每輪增加的Index堿基都和上一輪不同.每組包含兩個抗體，同組抗體上的兩個DNA條碼只有5′端的第一個堿基不同，作為信號堿基，并且這兩個堿基不會出現(xiàn)在Index堿基里.每輪成像加入3種堿基，分別與帶有熒光團(tuán)的兩種信號堿基和一種Index堿基互補(bǔ)，成像后用三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽［Tris（2-carboxyethyl）phosphine hydrochloride，TCEP］洗掉熒光基團(tuán)，再進(jìn)行下一輪成像［圖8（B）］.雖然理論上兩種Index堿基可循環(huán)使用，能檢測無限個目標(biāo)物，但由于堿基數(shù)量限制，每輪只能成像兩種目標(biāo)物，難以實現(xiàn)高通量檢測.

為了進(jìn)一步放大熒光信號，Luo等［59］將抗原-抗體免疫反應(yīng)與HCR結(jié)合在一起，稱為免疫響應(yīng)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Immunosignal HCR，isHCR）方法.該方法將免疫熒光信號放大2～3個數(shù)量級.一級抗體識別抗原后，生物素標(biāo)記的二級抗體與一級抗體結(jié)合，鏈霉親和素修飾的DNA探針與生物素反應(yīng)后標(biāo)記在目標(biāo)物上，HCR放大信號后進(jìn)行熒光成像.雖然和熒光基團(tuán)直接標(biāo)記相比，isHCR實現(xiàn)了熒光信號增強(qiáng)，但是受限于二級抗體的數(shù)量，能檢測的目標(biāo)物有限.如果在HCR的過程中結(jié)合二次編碼擴(kuò)增，就能擴(kuò)大檢測范圍.

Liu等［60］提出了熒光寡核苷酸聯(lián)免疫吸附斑點法（Fluorescence-based oligo-linked immunospot，F(xiàn)OLISPOT），通過酶聯(lián)免疫吸附斑點法（Enzyme-linked immunospot，ELISpot）和兩輪PER放大信號方法的結(jié)合，將檢測限降為ELISpot檢測限的2%，并實現(xiàn)了多輪檢測.捕獲抗體、抗原和檢測抗體形成三明治結(jié)構(gòu)，檢測抗體和DNA條碼通過馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺酯交聯(lián)劑連接到一起.隨后，通過第一輪PER延長與抗體上DNA條碼互補(bǔ)的鏈，該鏈又作為第二輪PER的底物，生成大量可與熒光探針互補(bǔ)雜交的單鏈，實現(xiàn)熒光信號的放大.固定在孔板上的捕獲抗體提供了洗滌界面，使得反應(yīng)體系可以進(jìn)行多輪熒光成像，即修飾相同熒光分子的不同核酸探針可以在不同輪次內(nèi)成像.本方法每輪成像只用了兩種熒光分子，如果增加每輪中熒光分子的種類，可以在多輪洗滌中識別更多目標(biāo)物［圖9（A）］.

Fig.9 Data and schematic of FOLISPOT and CCFB

Kashida等［61］提出了顏色變換熒光條碼（Color-changing fluorescent barcode，CCFB）方法，通過多肽與肌動蛋白結(jié)合或抗原抗體結(jié)合使目標(biāo)蛋白帶上組合條碼，隨后進(jìn)行多輪鏈置換反應(yīng)對目標(biāo)多輪成像，形成不同順序和顏色的熒光編碼.與之前方法不同的是，熒光探針用D-蘇氨醇非環(huán)核酸（AcyclicD-threoninol nucleic acids，D-aTNA）代替DNA.D-aTNA自身能形成非常穩(wěn)定的雙鏈，但不能與DNA或RNA形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu).加入D-aTNA單鏈猝滅探針后，與熒光探針通過鏈置換形成的熒光猝滅雙鏈產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不會被其它DNA單鏈置換，因此不需要在每輪識別后洗滌，縮短了每輪檢測的時間.此外，與DNA熒光探針相比，D-aTNA熒光探針也有更高的猝滅效率和信噪比［62］.不同組合的探針核酸序列是相同的，調(diào)整所帶熒光基團(tuán)的順序即可實現(xiàn)不同的編碼，因此鏈置換的反應(yīng)是通用的，避免了大量不同核酸鏈的引入［圖9（B）］.巰基修飾的D-aTNA組合探針通過交聯(lián)劑連接到抗體或鬼筆環(huán)肽上，進(jìn)行抗原或纖維狀肌動蛋白的識別.由于重復(fù)的熒光基團(tuán)也有順序差異，因此增加鏈置換的次數(shù)可以在有限熒光基團(tuán)種類的基礎(chǔ)上實現(xiàn)更多種目標(biāo)物的檢測.

基于抗體識別的核酸編碼擴(kuò)增，可檢測的目標(biāo)物種類更豐富、特異性更強(qiáng).但是抗體尺寸較大且二抗種類有限，在識別過程中容易造成位置信息不準(zhǔn)確.而納米抗體雖然尺寸縮小很多，但是制備過程較復(fù)雜.

1.4 基于組合反應(yīng)的編碼原理

為了獲取多種目標(biāo)物間的位置關(guān)系、相互作用情況等多層次分子信息，本課題組開發(fā)了基于多種分子逐級反應(yīng)的組合編碼原理.在偶聯(lián)反應(yīng)編碼的基礎(chǔ)上，Zhao等［63］利用1，3-茚二酮（1，3-Indandione，AI）疊氮衍生物將5-甲?；奏ぃ?-Formylcytosine，5fC）特異性標(biāo)記上疊氮基團(tuán)，并與DBCO修飾的DNA條碼發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)，同時采用sc5hmU/5hmC-microgel方法標(biāo)記5hmC，由此可為兩種目標(biāo)物分別標(biāo)記上部分序列互補(bǔ)的單鏈DNA條碼.進(jìn)一步開發(fā)鄰近連接反應(yīng)編碼原理，通過鄰近分子激活新的DNA條碼，可在獲得不同分子信息的同時獲得鄰近分子的關(guān)聯(lián)信息.掛鎖探針和兩種DNA條碼分別有一段互補(bǔ)序列，只有當(dāng)兩種條碼足夠近，即5hmC和5fC位點相鄰時，掛鎖探針才能與兩個條碼發(fā)生鄰近連接反應(yīng)［64，65］被激活，在RCA后進(jìn)行熒光成像.在識別過程中，鄰近連接的掛鎖探針標(biāo)記后，再用另外兩種掛鎖探針對剩余的5hmC和5fC位點進(jìn)行標(biāo)記，避免了先占用鄰近連接的位點.

針對更加復(fù)雜的生物分子的空間鄰近關(guān)系，本課題組發(fā)展了細(xì)胞大分子錨定的DNA步移索引成像方法（Cellular macromolecules-tethered DNA walking indexing，Cell-TALKING）［22］方法，通過組合偶聯(lián)反應(yīng)編碼、抗原-抗體免疫反應(yīng)編碼和鄰近連接反應(yīng)編碼成像組蛋白與其周圍5hmC，5hmU和5fU的位置關(guān)系.在這4種目標(biāo)物的標(biāo)記方法中，組蛋白的條碼通過抗原-抗體免疫反應(yīng)標(biāo)記，5hmC的標(biāo)記方法與sc5hmU/5hmC-microgel方法［23］相同，5hmU和5fU的標(biāo)記方法與生物正交的化學(xué)標(biāo)記成像單細(xì)胞內(nèi)兩種氧化胸腺嘧啶的方法［54］相同.位于組蛋白上的中心條碼和周圍表觀修飾的3種DNA條碼有一段通用的雜交互補(bǔ)序列，稱之為“鄰近條碼”.當(dāng)組蛋白與第一個目標(biāo)物鄰近時，中心條碼和第一個DNA條碼發(fā)生雜交，并在聚合酶作用下延伸，互補(bǔ)形成一段帶有切刻酶位點的序列.加入切刻酶后，互補(bǔ)鏈在作用位點處發(fā)生斷裂，雜交長度變短，雙鏈解旋，中心條碼恢復(fù)一端游離狀態(tài)，同時第一個DNA條碼被標(biāo)記上中心條碼的互補(bǔ)序列.通過不斷重復(fù)這個過程，組蛋白周圍所有鄰近的3種表觀修飾位點都會被標(biāo)記上中心條碼，再通過RCA后成像其位置.CELL-TALKING的位置關(guān)系在已知修飾位點距離的DNA折紙上也進(jìn)行了驗證（圖10）.

Fig.10 Schematic and data of Cell-TALKING[22]

Raj等［49］聯(lián)合雜交反應(yīng)和化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)，提出了一種放大FISH信號的檢測方法，即點擊化學(xué)反應(yīng)放大熒光原位雜交法（Click-amplifying FISH，clampFISH）.他們將一級掛鎖探針的兩個末端分別修飾炔基和疊氮基團(tuán)，掛鎖探針與目標(biāo)物mRNA雜交后，在銅催化下發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)連接成環(huán)，降低了環(huán)直接雜交目標(biāo)物時的非特異性吸附.與連接酶將堿基連接成環(huán)相比，點擊化學(xué)反應(yīng)連接提高了連接效率.沖洗后，帶有熒光基團(tuán)的二級掛鎖探針通過同樣的方法雜交到一級掛鎖探針上.不斷循環(huán)這個過程，每一級熒光探針都與上一級探針發(fā)生雜交-點擊化學(xué)反應(yīng)，直到熒光信號達(dá)到理想強(qiáng)度.

組合反應(yīng)編碼方法通常是先用一種編碼方式使目標(biāo)物標(biāo)記上DNA條碼，再通過二次編碼使之前的DNA條碼再被標(biāo)記一個新的條碼.多次編碼對于逐步深入研究目標(biāo)物之間的關(guān)系發(fā)揮了重大作用.

2 活細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像

由于細(xì)胞膜具有選擇透過性，無法重復(fù)進(jìn)行雜交清洗，因此在固定細(xì)胞中常用的smFISH和RCA等方法不能直接應(yīng)用在活細(xì)胞中.目前常用的活細(xì)胞內(nèi)成像的方法主要有3類：第一類是通過細(xì)胞膜的胞吞胞吐作用，將帶有核酸探針的納米材料運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)激活后進(jìn)行后續(xù)的反應(yīng)［66～68］；第二類是用和細(xì)胞膜類似的物質(zhì)（如脂質(zhì)體）包裹探針，通過膜融合將探針運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)［69～71］；第三類是將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)檢測所需的核酸或蛋白進(jìn)行成像［72～74］.

納米粒子在大量運(yùn)輸核酸探針進(jìn)入細(xì)胞方面有著顯著優(yōu)勢，金納米粒子和硅納米粒子都是常用的納米材料［75～77］.Zhang等［78］制備了一種負(fù)載DNA的金納米粒子3D水凝膠結(jié)構(gòu)（Au nanoparticle DNA hydrogel，AuDH），包含3種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的脫氧核糖核酶（DNAzyme）、與之部分序列互補(bǔ)的DNA熒光探針和激活的金屬離子.當(dāng)AuDH進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，目標(biāo)物微核糖核酸（microRNA，miRNA）通過鏈置換反應(yīng)與DNA熒光探針雜交，打開AuDH，發(fā)夾DNAzyme和金屬離子被釋放出來.DNA熒光探針再次通過鏈置換反應(yīng)打開DNAzyme的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，目標(biāo)物miRNA被釋放，繼續(xù)打開下一個AuDH，實現(xiàn)第一次循環(huán)放大.與DNA熒光探針雜交的DNAzyme在金屬離子的激活下，切斷底物中的核糖核苷酸位點，使熒光探針的熒光團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅端，發(fā)出熒光信號.同時，DNAzyme與底物解旋后恢復(fù)游離狀態(tài)，再識別下一個底物，實現(xiàn)第二次循環(huán)放大.AuDH負(fù)載了3套不同的miRNA檢測系統(tǒng)，可以實現(xiàn)3種miRNA的同時成像［圖11（A）］.除了金納米粒子外，Yao等［79］合成了負(fù)載染料的介孔二氧化硅納米猝滅劑（Black hole quencher-doped mesoporoussilica nanoparticles，qMSNs）.他們用目標(biāo)miRNA互補(bǔ)鏈封裝染料，將與甘油醛3-磷酸脫氫酶（Gyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA互補(bǔ)的發(fā)夾熒光探針修飾在納米粒子表面.miRNA與互補(bǔ)鏈結(jié)合后，染料被釋放，發(fā)出熒光信號；同時，GAPDH的mRNA將發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)，恢復(fù)熒光.該方法雖然結(jié)構(gòu)設(shè)計相對簡單，但沒有循環(huán)放大信號的功能，在多檢測和信號擴(kuò)增上還有待進(jìn)一步改善.Zhao等［66］設(shè)計了一種金納米粒子負(fù)載的DNA信號放大系統(tǒng)，可以同時成像細(xì)胞內(nèi)的miRNA和端粒酶.納米粒子上帶有兩種包含氧橋鳥嘌呤（Oxoguanine，oG）損傷位點和熒光基團(tuán)的DNA發(fā)夾以及兩種未激活的DNA“開關(guān)”.納米粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，miRNA與其對應(yīng)開關(guān)的封鎖鏈發(fā)生鏈置換反應(yīng)，激活單鏈DNA開關(guān).開關(guān)再通過鏈置換反應(yīng)打開發(fā)夾，形成帶有oG位點的DNA雙鏈.同時，端粒酶在識別其對應(yīng)開關(guān)后將末端延長從而激活，延長后的DNA單鏈開關(guān)同樣通過鏈置換反應(yīng)打開發(fā)夾并形成含有損傷位點的雙鏈結(jié)構(gòu).細(xì)胞內(nèi)的8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（Human 8-oxoguanine glycosylase 1，hOGG1）識別并切除oG，形成脫嘌呤嘧啶（Apurinic-Apyrimidinic，AP）位點，在體內(nèi)堿基切除修復(fù)系統(tǒng)（Base-excision repair，BER）的作用下，雙鏈解旋，釋放出熒光信號和已激活的單鏈開關(guān)，進(jìn)行下一輪的識別和放大.

由于納米金類的納米材料制備繁瑣，且生物毒性存在爭議，因此利用DNA組裝的納米結(jié)構(gòu)在活細(xì)胞編碼中也發(fā)揮著重要作用.Xiang等［80］設(shè)計了一種多色編碼的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)Tetrahedron nanostructure（TetrNano），用于多路檢測細(xì)胞內(nèi)miRNA.通過對4條單鏈進(jìn)行熱退火和連接，得到含有兩個熒光猝滅發(fā)夾的四面體DNA納米結(jié)構(gòu).MiRNA-21和miRNA-155分別打開兩個發(fā)夾，使其恢復(fù)熒光，實現(xiàn)兩種目標(biāo)物的同時成像［圖11（B），（C）］.為了進(jìn)一步放大信號以檢測更低濃度的目標(biāo)物，Yang等［81］組裝了一種類似章魚觸手的納米結(jié)構(gòu).兩組CHA探針、AS1411適配體和生物素標(biāo)記的DNA鏈組成了DNA三棱鏡納米結(jié)構(gòu)（DNA triangular prism，DTP）.3個DTP通過鏈霉親和素組成Streptavidin DTP（SA-DTP）.AS1411適配體可以幫助SA-DTP更順利地進(jìn)入細(xì)胞.當(dāng)miRNA-21在第一個DTP上觸發(fā)對應(yīng)的CHA后，由于空間約束效應(yīng)，重新釋放的目標(biāo)會快速傳遞到相鄰的DTP上，觸發(fā)其CHA，從而實現(xiàn)信號放大，miRNA-155同理［圖12（A）］.雖然DNA納米結(jié)構(gòu)的序列結(jié)構(gòu)設(shè)計較復(fù)雜，但在生物相容性和可控性方面有著顯著優(yōu)勢.

類膜結(jié)構(gòu)的運(yùn)輸可以提高運(yùn)輸效率，同時避免復(fù)雜的組裝過程.Zhao等［69］發(fā)現(xiàn)，通過脂質(zhì)體將DNA回路所需的探針運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)后，細(xì)胞內(nèi)的端粒酶會激活啟動探針，開啟回路.隨后，兩種RNA分別觸發(fā)各自的鏈置換循環(huán)反應(yīng)，放大信號［圖12（B）］.二進(jìn)制編碼原理同MERFISH.該方法利用細(xì)胞內(nèi)熵驅(qū)動的多重DNA回路和信號編碼，分析了細(xì)胞內(nèi)端粒酶和兩種RNA的關(guān)系.與常用的酶驅(qū)動擴(kuò)增體系相比，無酶信號放大由于反應(yīng)條件簡單，避免了酶促反應(yīng)中pH值和離子濃度的限制，在活細(xì)胞內(nèi)效率更高.Dong等［82］通過腫瘤細(xì)胞膜囊泡包裹修飾在納米粒子上的熒光探針和雙鏈特異性核酸酶（Double-specific nucleases，DSN），對細(xì)胞內(nèi)的3種miRNA進(jìn)行成像.當(dāng)miRNA與熒光探針結(jié)合形成雙鏈后，會被DSN迅速識別并將DNA鏈水解，發(fā)出熒光信號.miRNA被釋放后繼續(xù)雜交下一條熒光探針，以此實現(xiàn)信號放大.

Fig.11 Schematic and data of nanoparticles and DNA nanostructures encoded amplification methods in live cells

Pederson等［83］提出了CRISPRainbow方法，可以在活細(xì)胞內(nèi)利用可編程的規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）及其內(nèi)切酶失活相關(guān)蛋白9（Dead CRISPR Associated Protein，dCas9）系統(tǒng)進(jìn)行DNA標(biāo)記成像.與之前改造規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白9（CRISPR Associated Protein9，Cas9）蛋白的方法不同，CRISPRainbow中結(jié)合熒光蛋白的對象為向?qū)NA（Single guide RNA，sgRNA）.選用藍(lán)色、綠色和紅色的熒光蛋白，將帶有與目標(biāo)序列互補(bǔ)的sgRNA與含有6種組合熒光蛋白（3種單色和3種組合色）結(jié)合位點的適配體連接，構(gòu)建的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，通過CRISPR-dCas9靶向結(jié)合目標(biāo)物，進(jìn)行熒光成像［圖12（C）］.在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊又提出了CRISPR-Sirius方法，將8組重復(fù)的MS2RNA適配體插入到sgRNA四環(huán)上，結(jié)合更多的熒光蛋白，進(jìn)一步放大了熒光信號，可以檢測更低拷貝數(shù)的目標(biāo)物［84］.

活細(xì)胞中條形碼的表達(dá)水平受多種因素影響，可能干擾后續(xù)檢測的準(zhǔn)確度，因此，Elowitz等［85］開發(fā)了一種不依賴于條形碼表達(dá)的高精度原位檢測技術(shù)Zombie.將T7/SP6/T3噬菌體啟動子驅(qū)動的DNA條碼整合到基因組中，這些條碼在細(xì)胞中由于缺乏相關(guān)酶而不會表達(dá).細(xì)胞內(nèi)的堿基編輯器或其它DNA修飾酶可以選擇性地改變條形碼序列，以增加條形碼的多樣性.細(xì)胞固定后，引入噬菌體的RNA聚合酶，使帶有DNA條碼的目標(biāo)序列開始原位轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，RNA轉(zhuǎn)錄本由此開始積累并擴(kuò)散，再通過FISH進(jìn)行成像分析.此外，Zombie還可以有效區(qū)分20個堿基對長度的DNA條形碼上單個堿基的差異.在編碼成像中既保留了細(xì)胞的空間位置信息，也提高了條碼分析精確度.類似的方法也可以追蹤體細(xì)胞突變的譜系信息.Cai等［86］提出了基于基因工程誘導(dǎo)突變與光學(xué)原位讀取的細(xì)胞歷史記錄（Memory by engineered mutagenesis with opticalin situreadout，MEMOIR）方法，將CRISPR/Cas9和seq-FISH結(jié)合，編碼后通過原位成像分析譜系遺傳信息.條碼由10段重復(fù)序列組成，在CRISPR/Cas9特異性切割下產(chǎn)生隨機(jī)的條碼缺失.每段條碼還帶有一段不被Cas系統(tǒng)識別的顏色條碼，通過seqFISH共定位成像.Cas系統(tǒng)與seqFISH結(jié)合也可以實現(xiàn)細(xì)胞中染色質(zhì)動態(tài)的可視化［87］.熒光蛋白標(biāo)記的dCas9在活細(xì)胞中靶向到目標(biāo)位點，隨后將細(xì)胞固定，通過seqFISH多輪成像.這類在活細(xì)胞中編碼、固定細(xì)胞后成像的方法有效解決了活細(xì)胞中不能多輪洗滌探針的問題.

活細(xì)胞中核酸編碼擴(kuò)增受到細(xì)胞膜選擇透過性、生物相容性、無界面等諸多限制，在多輪編碼成像多種目標(biāo)物方面還有很大的阻礙.目標(biāo)物的編碼方式和擴(kuò)增方式都與固定細(xì)胞中的有所不同.如何在活細(xì)胞中實現(xiàn)成百上千甚至更多種目標(biāo)物的編碼成像，依然是需要繼續(xù)研究的問題.

Fig.12 Structure of DNA nanostructures and circuits and schematic of CRISPRainbow

3 總結(jié)與展望

本文綜合評述了單細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像分析的方法以及在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展.通過核酸編碼擴(kuò)增的方式對現(xiàn)有方法進(jìn)行了分類和總結(jié)，部分方法列于表1.核酸編碼與信號擴(kuò)增結(jié)合，不僅可用于基于雜交識別的核酸序列檢測（如mRNA和miRNA），還拓展應(yīng)用于核酸非序列特征（堿基修飾、空間鄰近）以及蛋白等多層次、多水平目標(biāo)物分析，極大擴(kuò)展了單細(xì)胞熒光成像的目標(biāo)物范圍與應(yīng)用場景.

核酸編碼擴(kuò)增利用化學(xué)反應(yīng)特異性識別標(biāo)記特定目標(biāo)物，將相似結(jié)構(gòu)分子間的微小化學(xué)結(jié)構(gòu)差異轉(zhuǎn)化為預(yù)先設(shè)計的DNA條碼的擴(kuò)增反應(yīng).進(jìn)一步聯(lián)合多輪擴(kuò)增編碼，即可同時特異、靈敏地檢出上萬種目標(biāo)物，為細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)聯(lián)合分析提供了有力的工具，在全基因組的數(shù)據(jù)分析和生物組織譜圖繪制中發(fā)揮重大的作用.

目前，單細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像還面臨一些挑戰(zhàn).首先，缺少高通量、自動化的單細(xì)胞成像方法.目前組學(xué)級別的目標(biāo)物編碼成像大多依賴多輪雜交、清洗，步驟繁瑣，耗時較長，檢測通量受限，迫切需要發(fā)展快捷、簡便、能滿足規(guī)模化單細(xì)胞并行檢測的成像方法與平臺.其次，目標(biāo)物標(biāo)記條碼的方式單一.除序列雜交與抗原-抗體免疫識別外，對于其它分子特征仍局限于點擊化學(xué)等少數(shù)幾種反應(yīng)，發(fā)展反應(yīng)效率高、反應(yīng)條件溫和的多類型生物正交反應(yīng)，將為單細(xì)胞成像分析提供更多的分子工具.最后，由于細(xì)胞膜的選擇透過性，外界物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的方式與效率有限，信號方式單一，放大效率不足，多目標(biāo)物檢測難度極大.如何在活細(xì)胞中進(jìn)行多輪編碼，以獲取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)隨時間、空間的動態(tài)變化信息，是值得關(guān)注的重點問題.

Table 1 Properties of in situ nucleic acids-encoded amplification methods