基于Cy7類菁染料分子探針的設計策略

秦文婕，黃一倬，羅 瀟，錢旭紅，楊有軍

（1.華東理工大學藥學院,上海 200237；2.華東師范大學化學與分子工程學院,上海 200241）

菁染料家族有許多成員，包括菁染料（Cyanine dyes）、半菁染料（Hemicyanine dyes）、噁桑醇染料（Oxonol dyes）、部花菁染料（Merocyanine dyes）和方酸染料（Squaraine dyes）等.其中，吲哚七甲川菁染料（Cy7）是一類典型的菁染料，由于其優(yōu)異的光物理性質(zhì)而得到了廣泛關注，并被用于生物醫(yī)學影像與生物傳感領域.隨著成像技術的逐漸完善以及合成方法的成熟，大量基于Cy7的分子探針被開發(fā)出來.2016年，Peng等［1］總結了2010～2015年間報道的近紅外熒光分子探針.2021年，Dai等［2］總結了具有應用于腫瘤診斷潛力的菁染料，2022年，Ren等［3］綜述了關于發(fā)射波長在1000 nm以上用于成像的探針的研究，總結了最近幾年菁染料在生物成像方面的進展.

本課題組［4］曾總結了熒光分子探針的通用型傳感分子機制（圖1）.包括光誘導電子轉移（PET）、熒光共振能量轉移（FRET）、共軛骨架調(diào)節(jié)、推拉電子修飾以及外圍電荷調(diào)節(jié)幾類.

Fig.1 Classic molecular probe design strategies[4]

本文根據(jù)染料熒光調(diào)控分子機制，對基于吲哚七甲川花菁染料的分子探針進行了綜合評述.

1 光誘導電子轉移

光誘導電子轉移（Photoinduced electron Transfer，PET）包含a-PET與d-PET兩種類型（圖2）.在a-PET體系中，一個熒光染料與一個電子供體相連.該電子供體的HOMO軌道能級介于染料的HOMOLUMO能級間.染料受激發(fā)進入激發(fā)態(tài)，電子供體HOMO軌道的一個電子轉移至染料單電子占據(jù)的原HOMO軌道，形成一個染料自由基陰離子和供體的自由基陽離子.這一過程導致染料熒光猝滅.在d-PET體系中，一個熒光染料與一個電子受體相連.該電子受體的LUMO軌道能級介于染料的HOMOLUMO能級間.染料進入激發(fā)態(tài)后，染料單電子占據(jù)的原LUMO軌道的電子轉移至受體的LUMO空軌道，同樣導致熒光猝滅.分析物可以通過與識別位點的相互作用阻斷PET過程來誘導熒光恢復，即PET的“On-off”模式.相反，PET的“Off-on”模式通過熒光猝滅實現(xiàn)目標的檢測［1］.

Fig.2 Schematic illustration of the a-PET and d-PET mechanism

1.1 PET類金屬離子探針

金屬螯合配體上常含多個氮、氧、硫等原子，可通過PET機制猝滅染料熒光.配體和金屬離子配位后，PET效應受到抑制，染料熒光得到恢復.利用這一機制，可開發(fā)PET類金屬離子探針.

1992年，Strekowski等［5］在Cy7共軛鏈骨架中心引入六元環(huán)（圖3），不僅大大提高了Cy7的穩(wěn)定性，也增加了可修飾位點.基于該結構骨架，1996年，他們合成出結構1和2［6］，并在1998年報道了結構1在金屬檢測方面的應用［7］.鄰羥基羧基是Al3+和Be2+離子的選擇性受體，在菁染料苯環(huán)上引入鄰羥基羧基，以檢測Al3+和Be2+.由于電荷從配體轉移到金屬離子上，干擾了熒光團的共振結構，導致1與高濃度Al3+和Be2+離子結合時發(fā)生熒光猝滅.之后通過在中間位置上修飾響應基團開發(fā)出各種金屬離子的檢測器，如Ozmen等［8］在2000年報道的第一個Cy7類鈣離子選擇性探針，通過引入特異性配體1，2-雙（2-氨基苯氧基）-乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸四鈉鹽（BAPTA）螯合鈣離子，782 nm處的熒光強度可增加4倍；Tang等開發(fā)出了結構3～6分別用于檢測鋅離子［9］、汞離子［10］、亞鐵離子［11］和銅離子［12］，這些探針都可對細胞進行成像.隨著成像技術的發(fā)展成熟，不少探針已應用于活體成像，如亞銅離子檢測器9［13］和Qian等［14］開發(fā)的兩個發(fā)射波長超650 nm的鎘熒光探針10和11.

Fig.3 Molecular structures of metal ion fluorescent probes 1—12 based on PET mechanism

2009年，Achilefu等［15］報道了結構12，這是第一個放射性核素衰變與熒光團結合的分子系統(tǒng)，證明了放射性核素衰變可以改變有機染料的熒光性質(zhì).這種通過放射性核素的衰變來監(jiān)測熒光增強的新方法有多種潛在的應用前景，如觀測核素衰變速度.此外，將放射性核素衰變與熒光增強相結合，可以為放射性核光學多模態(tài)生物成像提供一種獨特的互補信號機制.

1.2 PET類pH熒光探針

氮、氧原子的質(zhì)子化可大幅降低其供電子能力，進而降低其作為PET電子供體的能力.因此利用含氮、氧原子基團的質(zhì)子化和去質(zhì)子化可實現(xiàn)PET效應的調(diào)控，從而開發(fā)pH探針（圖4）.2007年，Tang等［16］合成了探針結構13.該探針對pH=4.0～6.5范圍內(nèi)的H+變化有響應，同時也可在10.5～11.8的pH范圍內(nèi)對H+作出響應.首次實現(xiàn)了在不同的激發(fā)和發(fā)射波長下對不同pH范圍內(nèi)的H+進行雙重測量.此外，它作為第一個用于細胞內(nèi)酸性pH成像的近紅外熒光探針，適用于研究內(nèi)環(huán)境為酸性的細胞器，該探針也被成功用于活體成像.之后，該課題組［17］又開發(fā)了一種對pH敏感的探針14，可對6.70～7.90范圍內(nèi)的微小pH波動呈線性和快速響應.

2017年，Cai等［18］報道了一種具有光熱效應的pH探針15，隨著pH值的增加（4.4～8.0）（圖4），探針吸收峰從637 nm轉移到792 nm，并且吸收強度增加，但熒光強度減弱.該探針不僅在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出高分辨率的光聲成像效果，也表現(xiàn)出有效的腫瘤光熱消融效果.2019年，Wu等［19］在花菁的中間碳上引入一個苯甲酰肼基團，得到pH敏感的近紅外探針16，其在pH=7.0～9.0范圍內(nèi)熒光可增強10倍，該探針首次成功應用在監(jiān)測轉基因糖尿病小鼠模型中急性傷口向慢性傷口發(fā)展過程中pH的變化.

Fig.4 Moleculars structure of pH fluorescent probes 13—16 based on PET mechanism(A),UV-Vis spectra and fluorescence spectra(Flu)of probe 15 in PBS,pH=4.4(B),UV-Vis spectra of probe 15 at various pH values in 20 mmol/L PBS buffer(C),emission spectra of probe 15 under increasing pH levels upon excitation at 637 nm(pH=4.4—8.0)(D)[18]

Fig.5 Molecular structures of ROS/N fluorescent probes 17—26 based on PET mechanism

1.3 PET類活性氧/氮熒光探針

多種對活性氧響應的原子或基團具有較高的電子云密度，可作為PET機制中的電子供體，如對一氧化氮響應的鄰苯二胺，對活性氧響應的鄰苯二酚、硫原子、硒原子等.與活性氧/氮（ROS/N）反應之后，這些基團變成吸電子基團，PET效應受阻，探針熒光恢復.

2005年，Nagano等［20］通過引入鄰苯二胺作為一氧化氮（NO）響應基團得到了Turn-on型探針17和18（圖5），實現(xiàn)了對小鼠腎臟的體外NO成像.2011年，Tang等［21］利用組氨酸（His）咪唑環(huán)的1，4-環(huán)加成反應，特異性清除1O2的性質(zhì)，合成了探針19以檢測1O2.探針可被1O2氧化，導致熒光恢復.該探針能對1O2快速響應且選擇性高，成功應用于活細胞和組織中1O2的檢測和成像.該課題組［22］還利用硒（Se）在體內(nèi)參與氧化還原循環(huán)的性質(zhì)設計了ONOO-響應的探針20，這是最早通過在Cy7骨架上引入硒原子以檢測ONOO-的探針.該探針可以被ONOO-氧化，被抗壞血酸（ASCH2）還原，氧化還原循環(huán)至少可以重復8次，氧化后的探針在770 nm處的熒光強度降低了5倍.他們還在RAW264.7細胞中成功實現(xiàn)了細胞氧化還原周期的實時成像.類似的，Han等［23］也開發(fā)了一種含硒的檢測ONOO-的探針21，該探針可被谷胱甘肽（GSH）還原，循環(huán)次數(shù)達5倍，熒光開啟可增強23.3倍（圖5），量子產(chǎn)率從0.05增加到0.12.之后該課題組［24］又將碲（Te）引入到熒光團22中，并將該探針成功應用于細胞和小鼠ONOO-/GSH氧化還原穩(wěn)態(tài)變化的實時成像.該課題組在2012年還開發(fā)了檢測過氧化氫（23）［25］和次溴酸（24，25）的探針［26］.探針23與過氧化氫反應導致熒光強度降低，當加入GSH到含有氧化型探針的PBS緩沖液中時，在10 min內(nèi)得到GSH偶聯(lián)物，熒光恢復.該探針能夠在這些不同類型的細胞系中檢測細胞內(nèi)過氧化氫和谷胱甘肽.探針24和25對次溴酸和抗壞血酸引起的氧化還原循環(huán)有響應，他們利用這一性質(zhì)將探針成功應用于連續(xù)監(jiān)測細胞內(nèi)次溴酸水平的變化.2016年，Chen等［27］設計并開發(fā)了一種高選擇性和高靈敏度檢測次氯酸和髓過氧化物酶（MPO）的熒光探針26，其（甲基硫代）-苯胺基部分可被次氯酸氧化，使熒光開啟.該探針可靶向線粒體，用于檢測生物樣品中次氯酸和MPO的活性.

1.4 PET類硫化物熒光探針

體內(nèi)的硫醇化合物［如半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和GSH］在生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用.利用其親核性或還原性，可選擇性切斷探針分子的PET電子供體結構片段，用以開發(fā)特異性檢測探針.如2012年，受Se—N鍵很容易被硫醇裂解的啟發(fā)，Wang等［28］引入強吸電子的2-硝基苯基硒烷和3-（三氟甲基）苯基硒烷作為電子受體（圖6），猝滅探針27和28的熒光，隨著GSH的加入，熒光強度（λem=750 nm）顯著增加.該探針在pH=4.0～8.6范圍內(nèi)對非蛋白硫醇和蛋白硫醇具有較高的反應性，可用于檢測活細胞和組織中不同水平的硫醇.2013年，Tang等［29］開發(fā)了另外一種含Se—N的檢測GSH的探針29，該探針的熒光可被過氧化氫恢復，這種循環(huán)至少可進行4次.該探針還成功地應用于監(jiān)測斑馬魚幼苗傷口邊緣過氧化氫的變化.之后Kim等［30］和Zhang等［31］分別報道了兩種生物硫醇檢測探針30和31，皆成功應用于細胞成像.

Fig.6 Molecular structures of fluorescent probes 27—37 for thiols based on PET mechanism

2015年，Yoon等［32］報道了一種選擇性檢測GSH的熒光探針32.該探針與Zhang等［31］采用了完全相同的設計策略.但由于哌嗪環(huán)的椅形構象和S—N鍵的距離與其它對硫醇缺乏選擇性的探針不同，且GSH和其它硫醇之間也存在結構差異，該探針具有GSH選擇性.又如2018年，Lee等［33］開發(fā)的探針33與GSH作用后在818 nm處發(fā)出強熒光，而Cys/Hcy只在807 nm處有弱熒光.同年，Yoon等［34］開發(fā)了兩種新的基于花菁的熒光探針34和35.探針34含有兩個菁基團，由對苯硫醚鍵連接.探針34相鄰的兩個花菁基團自猝滅，GSH誘導的硫醚鍵斷裂可恢復探針34的熒光.探針35具有3，5-三氟甲基苯硫醇部分，該部分由于光誘導電子轉移效應導致熒光猝滅，同樣，GSH導致3，5-三氟甲基苯硫醇的硫醇斷裂，并恢復熒光，對其它GSH無響應.

利用不同生物硫醇與熒光團反應活性的不同，不少研究選擇合適的熒光團修飾在花菁骨架上，構建了雙通道檢測器，較單通道熒光探針更有利于消除自吸收的影響.2019年，Yuan等［35］設計并合成了一種雙通道熒光探針36，該探針由兩個熒光團組成，可以很好地檢測細胞內(nèi)源性GSH.同年，Yin等［36］引入萘酰亞胺到熒光團中，得到可用于谷胱甘肽體內(nèi)成像的雙通道探針37.與GSH反應后，形成親核取代產(chǎn)物和硫解產(chǎn)物，并分別進行雙光子成像和近紅外成像.

2012年，Zhang等［37］受硫化鈉可以還原硝基的啟發(fā)，設計并合成了一種含有硝基的新型熒光探針38（圖7），用于細胞內(nèi)硫化氫檢測.該探針在pH為4.2～8.2的范圍內(nèi)穩(wěn)定.在755和809 nm處分別表現(xiàn)出最大的吸收和發(fā)射.探針38與硫化氫反應后熒光強度增加了12.7倍，量子產(chǎn)率從0.05增加到0.11.2017年，Li等［38］通過哌嗪單元將NBD組裝到花菁骨架上開發(fā)了一種新型探針39.由于硝基取代的苯并呋咱（NBD）部分和花菁骨架之間有效的PET過程，該探針在796 nm處顯示非常微弱的熒光，與H2S反應后，PET過程受阻，熒光強度增加87倍，探針對硫化氫的檢測限為39.6 nmol/L.利用該探針還實現(xiàn)了在小鼠肝臟中的H2S成像.

Fig.7 Molecular structures of H2S fluorescent probes 38 and 39

1.5 PET類硝基還原酶熒光探針

硝基咪唑具有很強的親電性，可作為d-PET分子探針中的電子受體.腫瘤缺氧微環(huán)境導致硝基還原酶的活性提高，可實現(xiàn)硝基的選擇性還原，從而抑制d-PET效應，恢復探針熒光.此類探針在檢測腫瘤缺氧環(huán)境中受到廣泛關注.2012年，Nagasawa等［39］報道了一種檢測腫瘤缺氧環(huán)境的探針40，這是首個用于觀察腫瘤缺氧狀態(tài)的熒光探針（圖8）.為了提高探針40的選擇性，在后續(xù)的報道中他們設計并合成了一種新的近紅外（NIR）熒光探針41，并用于生物體內(nèi)腫瘤缺氧環(huán)境成像［40］.同樣，Tang等［41］利用硝基咪唑的親電性得到了探針42，并將其成功應用于研究腫瘤發(fā)展進程與細胞內(nèi)缺氧水平之間的關系.另外，Li等［42］設計開發(fā)了一種含硝基苯的探針43，其硝基被還原后，電子重排可脫去酰胺部分，開啟熒光.

Fig.8 Molecular structures of nitroreductase fluorescent probes 40—43 based on PET mechanism

光誘導電子轉移機制是一類經(jīng)典的熒光探針分子設計機制，可被用于設計基于Cy7染料骨架的熒光增強或減弱型分子探針，常用的檢測底物和識別基團的構效關系研究也已比較成熟.但由于基于PET機制的探針無法實現(xiàn)熒光的完全猝滅，使得探針本身總是帶有一定的背景熒光，因此，探針的檢測靈敏度還需進一步提高.同時，由于Cy7吸收波長在近紅外區(qū)間，HOMO-LOMO能級差小，不易通過分子內(nèi)電子轉移猝滅熒光，設計開發(fā)新型的響應基團實現(xiàn)熒光猝滅也具有挑戰(zhàn)性.

2 共軛骨架的破壞與恢復

根據(jù)關于PET過程的Weller方程，Cy7染料母核的HOMO-LUMO間隙很小，激發(fā)光引入近紅外體系的能量太小，不易通過分子內(nèi)電子轉移猝滅熒光.因此，很難實現(xiàn)高效的PET猝滅熒光.為了進一步提高分子探針的檢測靈敏度，開發(fā)了基于Cy7共軛骨架破壞和恢復的分子探針，可實現(xiàn)熒光的完全開啟或關閉，極大提高了檢測靈敏度.同時，共軛骨架的破壞與恢復必然伴隨紫外-可見吸收的顯著改變，可以同時實現(xiàn)肉眼檢測.

2.1 中位內(nèi)酯或內(nèi)酰胺化

在Cy7染料的中位引入內(nèi)酯或內(nèi)酰胺基團，可實現(xiàn)染料共軛鏈的破壞，使得探針完全不發(fā)熒光（圖9）.受特定底物（如質(zhì)子和金屬離子等）激活，內(nèi)酯或內(nèi)酰胺開環(huán)，染料共軛骨架恢復，發(fā)出熒光.相較于傳統(tǒng)的調(diào)節(jié)七甲川花菁熒光的PET機制［43］，這一利用螺環(huán)可逆開關的策略可提高底物檢測的靈敏度.

Fig.9 Schematic diagram of Cy7-based fluorescent probe via spiro-cyclization

2015年，He等［44］提出螺旋化來開啟熒光，設計合成了兩個Turn-on型熒光探針44和45，并用于活細胞的pH（圖10）和活體動物的Hg2+成像.在該策略的啟發(fā)下，2017年，Citterio等［45］合成了46和47兩個探針分子，分別對Hg2+和Zn2+/Cd2+進行檢測.

Fig.10 Molecular structures of several pH and metal ion probes 44—47 based on spiro-cyclization(A),pH-dependence of the fluorescence emission spectra of probe 44[10μmol/L,V(PBS)/V(DMF)=95∶5]upon excitation at 745 nm(B),representative fluorescence images of the mouse injected with probe 44 during LPS-mediated inflammatory response in vivo(C)[44]

2.2 給體-雙受體菁染料

2011年，Shabat等［46］報告了一種基于給體-雙受體（A-D-A）菁染料（QCy7）的新型探針設計平臺（圖11），將Cy7的染料共軛骨架中的一個單鍵和雙鍵嵌入苯環(huán)，QCy7含有一個受保護的作為潛在供體的官能團和兩個帶正電荷的氮受體.在特定檢測底物的激活下，保護基團離去，隨后發(fā)生分子內(nèi)電子轉移，生成醌，同時，恢復Cy7的推拉電子共軛體系，從而發(fā)射熒光.巧妙實現(xiàn)了菁染料的增強型紫外-可見和熒光檢測.唯一遺憾的是，產(chǎn)物的吸收波長相比Cy7類花菁染料有較明顯的藍移.

Fig.11 Schematic diagram of QCy7-type fluorescent probe

2.2.1 ROS 該類探針通過引入活性氧響應基團作為離去基團，在與底物作用后，分子內(nèi)可以發(fā)生電荷重排，恢復D-π-A結構，使熒光開啟.基于該策略，Shabat等［46］率先設計了H2O2活化的QCy7熒光探針48（圖12），將H2O2觸發(fā)基團苯基硼酸通過醚鍵連接到QCy7的磺化衍生物上.當觸發(fā)裂解反應保護基團離去時，探針會形成一個去保護的酚類活性給體，通過一對π電子的分子內(nèi)電荷轉移，重建QCy7，形成了電子離域之間的推拉共軛體系，發(fā)射熒光.在H2O2存在下，探針48溶液逐漸恢復近紅外熒光，該探針還具有對外源性和內(nèi)源性H2O2的可視化能力.2016年，Tang等［47］通過構造五元環(huán)保護雙羥基實現(xiàn)了pH和H2O2雙響應的QCy7熒光探針49，實現(xiàn)了成像引導下的蛋白在腫瘤區(qū)域的傳遞.

Fig.12 Molecular structures of ROS/N probes 48—54 based on QCy7

Fig.13 Molecular structures of metal ion probes 55—57 based on QCy7

之后，基于類似的思路，通過改變熒光團上對活性物質(zhì)響應的觸發(fā)位點，領域內(nèi)開發(fā)了一系列探針用于檢測不同種類的活性氧.如Tang等［48］在骨架上引入可以選擇性識別臭氧（O3）的基團（3-丁烯基），開發(fā)了探針50，首次實現(xiàn)了抑郁小鼠大腦中臭氧的成像.Zhang等［49］引入烯丙基醚作為觸發(fā)位點，開發(fā)了檢測一氧化碳（CO）的比例型熒光探針51.Wang等［50］開發(fā)的親水性熒光探針52和53，其熒光可被次氯酸（HClO）開啟，是快速、敏感地檢測內(nèi)源性和外源性HClO的潛在工具.他們選擇保護基團N，N-二甲基硫代氨基甲酸酯（DMTC）作為響應基團，通過降低π-電子共軛來猝滅熒光.在次氯酸的存在下，DMTC裂解離去，釋放染料并恢復熒光信號.2018年，Ma等［51］報道了首個敏感型的羥基自由基探針54，當探針與羥基自由基反應時，在653 nm處的熒光增強倍數(shù)約為122倍，被成功應用于監(jiān)測鐵自氧化過程中微量羥基自由基的產(chǎn)生.

2.2.2 金屬離子 2015年，Govindaraju等［52］報道了一種亞銅離子探針55，選擇三（4-吡啶基）胺作為亞銅離子響應基團（圖13），在探針與亞銅離子絡合后，探針55熒光開啟.該探針被成功用于生物液體中的Cu+池的近紅外熒光檢測和體內(nèi)成像應用.2019年，Hu等［53］合成了一種近紅外的Pd2+探針56，該探針在Pd2+的存在下表現(xiàn)出明顯的熒光增強，檢測限低至0.52μmol/L.該探針熒光強度的變化可能是因為Pd2+誘導的丙炔醚鍵裂解，使探針56在光照射下，轉化為相應的酮結構，發(fā)射出熒光.該探針可用于含鈀催化劑Pd2+的成像.2019年，Tang等［54］報道了一種新的近紅外熒光探針57，F(xiàn)e2+將與探針57中的N4O配體結合，并在O2存在下導致C—O鍵斷裂，從而恢復QCy7共軛結構發(fā)出熒光.它可以對在藥物誘導的肝損傷中的Fe2+進行成像.

2.2.3 硫化物 2013年，Govindaraju等［55］開發(fā)了一種水溶性的檢測氧化型谷胱甘肽（GSSG）和GSH氧化還原過程的探針58（圖14），其發(fā)射波長為700 nm.該分子探針很容易與硫醇，特別是GSH發(fā)生反應，對pH穩(wěn)定.可用于監(jiān)測谷胱甘肽還原酶的活性，并作為評估氧化應激水平的工具.2019年，Chen等［56］設計并合成了兩種近紅外熒光探針59和60，用于實時成像和評估線粒體GSH在活細胞和體內(nèi)的保護作用.探針59與GSH反應后在728 nm處表現(xiàn)出熒光“開啟”，被成功應用于小鼠GSH成像.

Fig.14 Molecular structures of thiols probes 58—63 based on QCy7

Fig.15 Molecular structures of thiols probes 64—71 based on QCy7

2019年，Zhao等［57］開發(fā)了用于檢測硫化氫的熒光探針61和62.水溶性熒光探針61在沒有有機溶劑或表面活性劑的幫助下與硫化氫反應，熒光增強了115倍，檢測限為11 nmol/L.細胞成像實驗表明，探針61具有細胞滲透性，能夠敏感地檢測溶酶體中的硫化氫.2020年，Yuan等［58］設計合成了探針63并用于檢測H2S.隨著H2S含量的增加，以394 nm為中心的最大吸收峰逐漸減小，在480和610 nm處的吸收峰逐漸增加.結果表明，該探針的熒光強度在715 nm處顯著提高了25倍，其量子產(chǎn)率為0.107.這兩個探針均成功應用于小鼠體內(nèi)硫化氫的檢測.

2.2.4 酶 2013年，Tung等［59］報道了一種熒光探針64（圖15），用于檢測溶液中的β-Gal酶活性，在680 nm處有110倍的熒光開啟；將其乙?；蟮玫教结?5，可對細胞進行成像.與溶液中檢測酶活性不同，由于生物硫醇的作用，酶水解得到的產(chǎn)物不同，QCy7的核心結構被破壞，在560 nm（λex=530 nm）左右發(fā)射熒光.同年，Lepenies等［60］報道了類似結構的探針66并用于檢測細菌.

2013年，Zhang等［61］設計并合成了一種檢測硝基還原酶（NTR）活性的探針67.在與NTR反應后，硝基芐基部分的硝基被還原為氨基，在708 nm處熒光開啟.該氧化還原誘導的NIR熒光探針已成功應用于生理條件下高選擇性的NTR活性檢測.2016年，Hecht等［62］開發(fā)了類似的線粒體靶向的NTR探針68，并成功用于細胞成像.

2018年，Chen等［63］合成了一種由熒光團QCy7和堿性磷酸酶（ALP）識別基團磷酸單酯組成的熒光探針69.探針69主要分布在線粒體，可用于量化ALP在8種不同細胞系中的表達水平.由于其較高的成像分辨率和深層組織穿透能力，可以區(qū)分腫瘤小鼠和正常裸鼠體內(nèi)ALP的表達水平，具有應用于研究ALP在疾病診斷中的功能的潛力.

2022年，Su等［64］報道了兩個選擇性檢測和可視化NAD（P）H醌脫氫酶（NQO）的探針70和71.通過引入兩個親水磺酸基，熒光強度得到顯著提高.探針71已被應用于活細胞內(nèi)源性NQO的高對比度成像，并進一步用于體內(nèi)無創(chuàng)成像.

2.2.5 其它 2016年，Devaraj等［65］還開發(fā)了一種苯基乙烯基醚的QCy7探針72，用于RNA分析（圖16）.經(jīng)四嗪驅(qū)動的生物正交反應脫保護后，觀察到的熒光比探針72增加了70倍.受益于兩個反應基團之間的空間鄰近性，生物分子（如mRNA）可以有效地加速微摩爾水平的反應.通過制備探針72和四嗪-磺酸基-活性酯（NHS）偶聯(lián)物，可用于在體外和CHO細胞中檢測目標RNA.2021年，F(xiàn)eng等［66］報道了一種近紅外熒光探針73，它可以有效地檢測活細胞和小鼠體內(nèi)的CORM-3（CO供體）.與CORM-3反應后，在600 nm處熒光信號降低，743 nm處產(chǎn)生的熒光信號增加，可對CORM-3進行比率檢測.

Fig.16 Molecular structures of RNA or CO probes 72 and 73 based on QCy7

2.3 氧化破壞/恢復共軛鏈

2.3.1 氧化恢復共軛鏈 利用Cy7染料骨架的氧化恢復，可以實現(xiàn)無背景Turn-on型熒光探針的開發(fā)，目前，基于此類巧妙設計機制的探針還很有限.2008年，Tang等［67］開發(fā)了一種用于觀察活細胞中的脂質(zhì)氫過氧化物（ROOH）的選擇性探針74（圖17），氧化磷原子引起碳磷鍵斷裂，同時恢復Cy7染料骨架.該探針的最大吸收和最大熒光發(fā)射波長分別為747和770 nm，在pH=7.4～7.8范圍內(nèi)穩(wěn)定.探針與過氧亞油酸甲酯（MeLOOH）反應后，熒光量子產(chǎn)率由0.058增加到0.64，熒光強度與MeLOOH的濃度成正比，可用于ROOH的定量檢測.

Fig.17 Molecular structure of ROOH probe 74

2.3.2 氧化破壞共軛鏈 強氧化性物質(zhì)（如HClO和過氧亞硝酸根等）可以氧化花菁共軛鏈的雙鍵生成環(huán)氧化物，或進一步發(fā)生碳碳鍵斷裂生成烯醛結構，破壞Cy7的推拉電子體系從而猝滅熒光（圖18）.基于這一氧化破壞共軛鏈機制，研究者開發(fā)了不少活性氧熒光探針.

Fig.18 Detection mechanism of Cy7 conjugation disruption by ROS

2013年，Han等［68］開發(fā)的HOCl比率型（I566/I780）探針75～79，分別在600～800 nm之間有最大吸收峰，與HOCl作用后，在560 nm處出現(xiàn)新的吸收峰.探針75具有大的Stokes位移，它被成功地應用于活細胞的次氯酸成像.之后Wang等［69，70］陸續(xù)報道了兩種檢測HOCl的探針80和81并成功用于細胞成像（圖19）.

Fig.19 Molecular structures of hypochlorous acid fluorescent probes 75—81

2018年，Dong等［71］設計并合成了一系列基于Cy7的熒光比率探針來檢測肺中的次氯酸（圖20）.他們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)鏈和氨基都是探針實現(xiàn)肺靶向作用的重要部分，具有長疏水性脂鏈和親水性氨基的探針82在小鼠肺中有較高的積累，探針85在脾臟中的攝取量高于其它器官，具有短脂鏈的探針87在肝臟中分布較高，與吲哚菁綠（ICG）相似.因此，選擇了探針82進行活體實驗，并證明了探針82能夠在小鼠肺中捕獲脂多糖（LPS）誘導的次氯酸.這些發(fā)現(xiàn)可用于設計新的無創(chuàng)檢測HClO探針.

Fig.20 Molecular structures of hypochlorous acid fluorescent probes 82—87

2019年，Li等［72］開發(fā)了可用于水介質(zhì)次氯酸鹽（測試體系pH=4）的選擇性檢測器探針88（圖21）.其可與次氯酸根通過氧化裂解反應破壞共軛鏈.2020年，Yi等［73］開發(fā)了一種檢測HClO的雙光子吸收，三通道（560/650/780 nm）比率型探針89.尼羅紅部分對HClO不敏感，可作為內(nèi)標.當HClO/ClO-濃度小于20μmol/L時，3個熒光峰（560/650/780 nm）均呈下降趨勢，特別是在780 nm處的熒光幾乎完全猝滅.進一步增加HClO/ClO-濃度，在560 nm處的發(fā)射迅速下降，但在650 nm處同時觀察到約10倍的熒光增強.因此，利用探針89的兩個不同熒光峰（I560/I650和I650/I780）之間熒光強度的比值變化來實現(xiàn)HClO/ClO-濃度的準確定量（圖21）.探針89首次實現(xiàn)了在活體動物中對HClO/ClO-濃度進行比率檢測.

Fig.21 Molecular structures of hypochlorous acid fluorescent probes 88 and 89

2021年，Xing等［74］設計了一種獨特的雙波長近紅外探針90（圖22），用于同時監(jiān)測活性氧和活性氮的體內(nèi)外變化，并成功應用于監(jiān)測活細胞和活小鼠細菌感染過程中氧化和亞硝化應激過程.其檢測機制為探針的Cy5部分被超氧陰離子自由基或羥基自由基氧化恢復菁染料推拉電子體系，在660 nm處開啟熒光.而過氧亞硝酸鹽或次氯酸鹽（ONOO-，ClO-）誘導的Cy7結構被氧化降解導致800 nm處的熒光降低.可通過不同波長處熒光變化來分析細菌感染過程中自由基種類的變化.

Fig.22 Molecular structure and sensing mechanism of ROS probe 90

基于Cy7共軛骨架破壞和恢復的分子探針設計策略，可以實現(xiàn)熒光的完全開啟或關閉.通過消除探針本身的背景干擾，可以明顯提高探針的檢測靈敏度，在生物應用中表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢.在這一策略中被廣泛使用的方法主要是基于QCy7的骨架恢復和基于ROS的骨架破壞，而其它方法的檢測底物還較少，有望通過分子機制的創(chuàng)新進行進一步拓展.

3 連接在染料共軛鏈上外圍基團吸電子和供電子能力的調(diào)控

1992年，Patonay等［75］開發(fā)了在共軛鏈引入一個剛性氯環(huán)己烯環(huán)的七甲基菁染料，可增加光穩(wěn)定性，提高熒光量子產(chǎn)率，這種結構也為染料在中心環(huán)上的化學取代提供了一個反應位點.近年來，通過中心位置的親核取代反應獲得了許多作為生物傳感器和熒光探針的七甲基菁染料.2005年，Peng等［76］發(fā)現(xiàn)一種新的花菁類染料91（圖23），在七甲基花菁骨架中間位置引入氨基烷基，由于分子內(nèi)電荷轉移效應，染料具有更大的斯托克斯位移和更強的熒光，更適合用作熒光探針.2006年，該團隊［77］報道的3H-吲哚的N取代對染料的光穩(wěn)定性有很大的影響，在3H-吲哚環(huán)N原子上引入芐基可獲得更高的光穩(wěn)定性；引入給電子基團比吸電子基團有利于獲得更大的光漂白抗性探針92～95.

Fig.23 Molecular structures of modified Cy7 skeletons 91—95

在此結構基礎上，設計出一系列花菁類染料，通過改變花菁染料骨架中間位置的取代基團，來改變發(fā)射波長，用于傳感.在近紅外染料中，胺取代的Cy7通過修飾具有明確受體的氨基，導致分子內(nèi)部電荷轉移，被證明是設計近紅外探針的理想選擇，這種類型花菁的光物理性質(zhì)高度依賴于骨架中位共軛外圍基團的電子密度.

3.1 金屬離子

2002年，Patonay等［78］選擇冠醚為鋰離子（Li+）響應基團得到傳感器96（JCM-15C5）（圖24）.探針在乙腈中的發(fā)射波長為799 nm.在乙腈溶液中溶劑化的Li+與冠醚腔體相適配，供電子能力降低，發(fā)生熒光猝滅.JCM-15C5可用于痕量金屬的測定.2006年，Nagano等［79］報道了首例鋅離子（Zn2+）比例型探針97（DIPCY），胺取代的Cy7作為近紅外熒光團，二-（2-吡啶甲基）胺（DPEN）部分作為金屬螯合劑.與金屬離子配位后，DPEN基團的電子密度降低，降低了胺在熒光團中的給電子能力.隨著Zn2+濃度的升高，DIPCY在非離子兩性（HEPES）緩沖液中的吸收峰紅移44 nm（627～671 nm），并在760 nm處熒光增強，但過量的Co2+和Cu2+對Zn2+的檢測有一定的干擾.利用相似的機理，2008年，Liu等［80］在花菁骨架上引入Hg2+螯合劑二硫二氧單雜大環(huán)得到Hg2+比率型探針98，其在777 nm處的熒光可被Hg2+猝滅.

Fig.24 Molecular structures of probes 97 and 98 for metal ions detection

除Hg2+外，甲基汞離子（MeHg+）也因其高毒性而成為備受關注的檢測對象.Guo等［81］合成了3個Hg2+和MeHg+的比值傳感器，分別為探針99～101（圖25）.這些傳感器對Hg2+和MeHg+均顯示出雙激發(fā)（A810nm/A670nm）和雙發(fā)射（F830nm/F780nm）的比例響應.這種變化是由Hg2+和MeHg+促進環(huán)化過程引起的.取代基（仲胺、咪唑啉、叔胺）的給電子能力下降，大大降低了分子內(nèi)電荷轉移過程的效率，吸收光譜和發(fā)射光譜出現(xiàn)了較大的紅移.2013年，Li等［82］將硫脲亞基與Cy7結合得到探針102，在MeHg+的作用下，探針分子發(fā)生環(huán)化反應，吸收光譜發(fā)生紅移.

Fig.25 Molecular structure of probes 99—102 for detecting metal ions

3.2 硫化物

在Cy7骨架中間位置共價連接硫化物響應基團，硫化物與響應基團反應后，花菁染料中位的N/O共價連接的熒光調(diào)節(jié)劑通過分子內(nèi)或分子間親核反應離去，從而改變外圍基團的供電子能力，來改變發(fā)射波長，實現(xiàn)活細胞或體內(nèi)成像.

Fig.26 Molecular structure of sulfide cation fluorescent probe 103

2011年，Cao等［83］基于過渡金屬置換策略構建了首個硫化物陰離子近紅外熒光傳感器103（圖26）.傳感系統(tǒng)由菁染料、哌嗪連接劑、8-氨基喹啉配體和Cu2+組成.銅離子可以使游離的探針在pH=7.0的HEPES緩沖液/乙醇溶液（25 mmol/L，體積比=6∶4）中吸收光譜發(fā)生明顯紅移（78 nm），同時近紅外染料探針103的熒光幾乎可以被Cu2+完全猝滅，在Cu2+與硫化物陰離子形成穩(wěn)定的配合物后，染料探針103被釋放，794 nm處熒光開啟，觀察到高達27倍的熒光增強.該傳感器在乙醇水溶液中具有大的近紅外熒光開啟信號、高靈敏度和高選擇性.過渡金屬基置換策略為目標陰離子檢測探針的開發(fā)開辟了一條新的途徑.

2016年，Chen等［84］開發(fā)了Cy7骨架和氨基甲酸酯連接鏈的Cy-Dise探針104（圖27）.由于半胱氨酸氫過硫化物Cys-SSH具有低pKa特性，在中性pH條件下能夠形成親核陰離子，進攻Cy-Dise的Se—Se鍵，導致氮的脫保護和發(fā)射波長的藍移（797～749 nm）.Cy-Dise中半乳糖基團的存在使其能夠靶向肝臟，用于BALB/c小鼠的深部組織比率成像.對Spraque-Dawley（SD）大鼠（Walker-256腫瘤的正常和異種移植物模型）的檢查進一步表明了探針在肝臟中檢測Cys-SSH的潛在應用.

Fig.27 Sensing mechanism of probe 104 for Cys-SSH(A),dose dependent fluorescent emission spectra of probe 104 response to Gys-SSH(left:λex=730 nm;right:λex=614 nm)(B)[84]

他們基于這個思路，開發(fā)了一系列檢測硫化物的分子探針，實現(xiàn)了在體硫化物成像（圖28）.之后基于類似的思路，通過改變熒光調(diào)節(jié)劑，開發(fā)了探針105～107，利用2，4-二硝基苯磺酰（DNBS）［85］、疊氮基［86］、三氟甲磺酰胺［87］修飾花菁骨架中間位置，實現(xiàn)了超氧陰離子和多硫化氫的成像.

Fig.28 Molecular structure of sulfide fluorescent probes 105—107

除硫化物外，其它小分子（如神經(jīng)毒劑）的檢測也可以利用該機制.Hu等［88］報告了一種用于檢測神經(jīng)毒劑的探針108（圖29）.加入神經(jīng)毒劑模擬模型二乙氧基氯磷酸鹽（DCP）后，吸收峰紅移（615～784 nm），溶液顏色由藍色變?yōu)榫G色.Chen等［89］利用類似的傳感機制開發(fā)了一種單胺氧化酶成像探針109.該探針具有氨丙基氨基甲酸酯連接物，可以選擇性地檢測單胺氧化酶，導致750/803 nm熒光比值變化.該探針可用于評估MAO-B在小鼠衰老模型中對氧化應激的貢獻.2018年，該團隊［89］開發(fā)了一種花青素探針Mito-Cy-Sec（110），利用丙烯酰胺部分對硒半胱氨酸進行成像.Zhou等［90］報道了一種基于控制熒光開關機制的磷酸鹽離子近紅外化學傳感器111.

Fig.29 Molecular structures of small biomolecule detection probes 108—111

3.3 ROS

根據(jù)上述機制也可以開發(fā)用于活性氧檢測的探針.2013年，Jiang等［91］基于氨基甲酸酯化學特異性裂解構建近紅外比例熒光探針CyNB（112）用于H2O2的檢測（圖30）.一個吸電子的氨基甲酸酯基團修飾Cy7的胺取代基，可以有效地降低胺的電子密度，用特定的分析物觸發(fā)氨基甲酸酯基團裂解過程，釋放CyNB的近紅外染料，從而獲得顯著的比率熒光信號.

Fig.30 Detection mechanism of probe 112 for H2O2

Fig.31 Sensing mechanism of probe 113 for hypochlorous acid(A),UV-Vis absorption spectra(B)and fluorescence emission spectra(C)of probe 113 response to HOCl[92]

線粒體是次氯酸鹽（OCl-）產(chǎn)生的主要部位.OCl-水平異常會引起氧化還原失衡和線粒體功能的喪失.Lin等［92］以菁染料作為熒光發(fā)射器，異硫氰酸苯酯基團的硫原子作為OCl-的特定識別基團，設計了Mi-OCl-RP探針（113）（圖31）.異硫氰酸苯酯基團會被OCl-氧化釋放一個仲胺的花菁堿單元，經(jīng)過仲胺互變異構形成Cy-azyl.在pH=7.4的PBS緩沖溶液中Mi-OCl-RP與OCl-反應后，在580 nm處的吸收峰減少，一個以380 nm為中心的新吸收峰顯著增加，在440 nm處有一個等吸光點.Mi-OCl-RP在471 nm處的熒光強度增加，在651 nm處的發(fā)射光譜減少，溶液的顏色由紫藍色變?yōu)闇\黃色.這些結果表明可以利用比值法（I471/I651）檢測OCl-，發(fā)光強度比（I471/I651）與OCl-濃度在0～10μmol/L范圍內(nèi)呈線性相關，檢出限為0.35μmol/L.

3.4 pH值

通過調(diào)節(jié)吲哚基上氮原子的電荷來改變花菁骨架分子間的電荷轉移是控制花菁類探針熒光的一種有效策略.利用探針對質(zhì)子變化的特殊光物理化學響應可設計對pH敏感的花菁類探針.發(fā)射特性在很大程度上是由芳香環(huán)上兩個氮原子之間的共振效應決定的，因此，吲哚氮原子的質(zhì)子化會產(chǎn)生強熒光.另一方面，如此得到的酸化花菁的去質(zhì)子化會導致熒光猝滅.

2019年，Chen等［93］設計了一種pH敏感型探針114（圖32）.在酸性環(huán)境下，吲哚氮原子的質(zhì)子化會增強電荷轉移過程，吸收光譜發(fā)生紅移，并產(chǎn)生強烈的熒光發(fā)射.在此基礎上，將探針114與另一種染料（以萘酰亞胺為例）結合，得到的探針114用于細胞成像.以乙醇作為溶劑，在堿性介質(zhì)中，只有535 nm處有一個吸收峰.隨著pH的降低，535 nm處的吸收峰逐漸下降，出現(xiàn)一個新的吸收峰，并在795 nm處逐漸增強.在640 nm處存在一個明顯的等吸光點.同時，隨著酸度的增加，溶液的顏色由粉紅色變?yōu)樽仙⑦M一步變?yōu)榫G色，這驗證了其作為“肉眼”pH值指示劑的潛在應用價值.

Nagano等［94］構建pH傳感器的策略是通過二胺取代基的質(zhì)子化/去質(zhì)子化來控制胺基團的給電子能力.探針115的pKa值為6.8，細胞成像結果證明了通過熒光比率方法傳感器監(jiān)測細胞內(nèi)pH值變化的可能性.Zhang等［95］開發(fā)了一系列酸性pH敏感的熒光探針（116～119）并用于溶酶體追蹤（圖33）.通過在NIR-II染料骨架（Flav32和BTC33）的C7/C6位置引入溶酶體靶向哌嗪，創(chuàng)建了一系列染料，適合于溶酶體的酸性環(huán)境（pH=5.0～6.0）的傳感.由于哌嗪基團的質(zhì)子化，在較低的pH值下，這些染料的熒光增強.

Fig.32 Molecular structure of pH probe 114

Fig.33 Molecular structures of pH probes 115—119

Fig.34 Sensing mechanism of pH probes 120a—120f

2017年，Ohe等［96］開發(fā)了具有親核基團（氨基、羥基和巰基）的ICG衍生物120a～120e（圖34），作為pH響應探針.這些染料分別在pH=7～9，pH=5～7和pH=3～6范圍內(nèi)，在熒光開環(huán)結構和非熒光閉合結構之間表現(xiàn)出pH依賴的平衡.染料120d和120e適用于活性細胞的高靈敏度分析，還可用于腫瘤組織酸性部位的高對比度光學成像.

3.5 中位供電子基團(氧/氮原子)電子密度的調(diào)節(jié)

通過調(diào)節(jié)花菁染料中位氧原子或者氮原子的電子密度可實現(xiàn)Cy7熒光發(fā)射波長的調(diào)控，利用這種方法可設計比率型探針.這類探針具有斯托克斯位移大、檢測靈敏度高的特點（圖35）.

Fig.35 General probe design principle via electron density modification of the central O or N atom

3.5.1 金屬離子 2012年，Yoon等［97］設計制備了高靈敏度和高選擇性的比例型Zn2+熒光傳感器121（CTMPA）（圖36），探針121與Zn2+可以形成摩爾比1∶1的配合物，選擇560 nm作為激發(fā)波長，測量熒光強度比（I590nm/I730nm）對Zn2+進行定量檢測.他們將其成功用于監(jiān)測活細胞和生物體中的內(nèi)源性鋅離子，該探針是首個成功應用于檢測斑馬魚神經(jīng)瘤的熒光探針.2014年，Zhu等［98］開發(fā)了一種基于Tsuji-Trost allylic反應的鈀高選擇性傳感器122.利用熒光比值（I655nm/I825nm）變化對水樣品和活細胞中的鈀進行定量檢測，檢測限低至0.3μg/L.

Fig.36 Molecular structures of metal ion probes 121 and 122

3.5.2 pH值 1993年，Strekowski等［99］報道了首個通過調(diào)節(jié)中位氧來改變熒光發(fā)射波長的pH探針123（圖37），該探針在水溶液中不穩(wěn)定.在甲醇溶液中，pH＜3時，染料的最大吸收波長紅移（531～709 nm），在甲醇-水溶液（體積比=1∶1）中測得pKa=6.91，該染料適合作為有機溶劑介質(zhì)中的pH探針.為了解決這些染料在水溶液中不穩(wěn)定的問題，通過在探針中引入磺酸根以及羧基得到了3個水溶性pH探針124～126［100］.在甲醇中，648 nm處有最大吸收，pH=3時，出現(xiàn)以932 nm為中心、新的更強的吸收.

Fig.37 Molecular structures of pH probes 123—126

2016年，Tan等［101］開發(fā)了一種能監(jiān)測線粒體自噬、區(qū)分自噬溶酶體和其它溶酶體的對pH有響應的HQO探針（127）（圖38），它可以通過表現(xiàn)出不同的熒光特性來同時探測活細胞中的線粒體和自噬溶酶體.HQO選擇性地在線粒體中積累，但當功能失調(diào)的線粒體進化為自噬溶酶體時，HQO隨pH的降低而轉化為質(zhì)子化的HQOH+形式.由于HQO和HQOH+在低極性環(huán)境中分別在530/650 nm和710/750 nm處表現(xiàn)出不同的吸收和發(fā)射，發(fā)現(xiàn)探針在膠束中特別適合用于監(jiān)測線粒體自噬.該探針在pH=0～2.0范圍內(nèi)可再次被質(zhì)子化，受此啟發(fā)，2018年，Zhang等［102］開發(fā)了一系列探針128和129，這類探針可在極堿和極酸條件下工作.其中也利用表面活性劑進行了pH調(diào)劑.

Fig.38 Molecular structures of pH probes 127—129

2022年，Yin等［103］構建了一種腫瘤酸性微環(huán)境激活的納米探針Cy-TPA NPs（130）（圖39），該納米探針可以通過增強通透性和保留（EPR）效應在腫瘤部位積累，并被腫瘤酸性環(huán)境激活.在弱酸性環(huán)境下，Cy-TPA恢復到長共軛形式，在725 nm處表現(xiàn)出一個較強的吸收峰，其熒光和光熱治療能力被“開啟”可用于特異性近紅外熒光（NIRF）成像引導的光熱治療（PTT）.

Fig.39 Molecular structure of pH probe 130(A)and fluorescence imaging of 4T1 tumour-bearing mice after i.v.injection of Cy-TPA NPs at different time intervals(B)[103]

3.5.3 硫化物 2012年，Yoon等［104］報道了一種選擇性檢測半胱氨酸（Cys）的比率型探針CyAC（131）（圖40）.這是首個通過調(diào)節(jié)π共軛鏈長短的比率型Cys探針.在CyAC溶液中加入Cys后，CyAC的光譜可以發(fā)生顯著的變化（吸收光譜從770 nm變化到515 nm，發(fā)射光譜從780 nm變化到570 nm）.類似的，Chen等［105］將對硝基苯甲酸酯引入到花菁骨架上得到探針132，利用F640/F785對Cys進行檢測并將該探針成功用于小鼠體內(nèi)Cys成像.

Fig.40 Molecular structures of Cys fluorescent probes 131 and 132

Fig.41 Continuous detection of superoxide radical anion and H2S n by probe 133

2015年，Chen等［106］開發(fā)了一種多響應近紅外熒光探針133（圖41），用于超氧陰離子（O·2-）和多硫化物（H2Sn）檢測，探針133對O·2-和H2Sn依次響應.具體過程為Cy7的氮被O·2-氧化恢復染料共軛結構，在794 nm處產(chǎn)生弱熒光；而2-氟-5-硝基苯甲酸部分作為熒光調(diào)節(jié)劑，該基團中存在的雙親電中心可用于捕獲H2Sn，在H2Sn的作用下，探針133發(fā)生親核取代反應，隨后發(fā)生分子內(nèi)的親核反應脫去熒光調(diào)節(jié)劑，釋放出Hcy-Mito，并在625 nm處產(chǎn)生強烈熒光.該多響應探針可以作為一種直接的化學工具用于檢測細胞和小鼠的O和H2Sn.

2016年，Chen等［107］報道了兩個連續(xù)檢測超氧陰離子自由基和H2Sn的探針Hcy-Mito和Hcy-Biot（134和135）（圖42），分別用于檢測細胞和體內(nèi)的超氧陰離子自由基和H2Sn.Hcy-Mito對內(nèi)源性超氧陰離子自由基和H2Sn的檢測表現(xiàn)出顯著的靈敏度和選擇性.細胞實驗提示，H2Sn可以通過直接清除超氧陰離子自由基來保護細胞免受線粒體氧化應激的損害.而Hcy-Biot被成功用于活體成像，其可以靶向癌細胞以檢測癌細胞組織中的超氧陰離子自由基和H2Sn.

Fig.42 Continuous detection of superoxide radical anion and H2S n by probe 134 or 135

以上兩種連續(xù)檢測超氧陰離子自由基和聚硫化物的探針由于光譜重疊，不利于實際應用.因此經(jīng)過合理設計，該課題組又進一步設計開發(fā)了探針136（圖43），它在極低的背景信號干擾下，可實現(xiàn)對不同熒光采集窗口中超氧陰離子自由基和H2Sn的連續(xù)檢測［108］.

Fig.43 Continuous detection of superoxide radical anion and H2S n by probe 136

2013年，Tang等［109］開發(fā)了一種選擇性檢測硫化氫的比率型探針137（圖44）.探針137在700和780 nm處分別有最大吸收峰和發(fā)射峰.探針137與硫化氫反應后在3 min內(nèi)熒光被猝滅.隨后，在35 min內(nèi)，在625 nm左右（510 nm激發(fā)）處逐漸出現(xiàn)了一個新的藍移發(fā)射峰.他們利用熒光強度比（I625/I780）成功應用于細胞成像以及量化硫化氫.類似的，Yin等［110］報道了另外一種硫化氫檢測器138，探針與硫化氫反應后熒光開啟.

Fig.44 Molecular structure of hydrogen sulfide fluorescent probes 137 and 138

Fig.45 Molecular structure of a N2H4 probe 139

3.5.4 其它 2013年，Peng等［111］開發(fā)了一種檢測聯(lián)氨的比率型探針139（I810/I582）（圖45），首次在活小鼠中實現(xiàn)聯(lián)氨可視化.探針139與聯(lián)氨反應后，分別在530和624 nm處出現(xiàn)新的最大吸收和發(fā)射峰，熒光量子產(chǎn)率由0.044增加到0.340.

2018年，Chen等［112］報道了首個能聯(lián)合檢測O和Hg2+的三通道比例型熒光探針HCy-SeH（140）（圖46），以驗證Hg2+引起的細胞內(nèi)氧化應激.HCy-SeH有紅色熒光發(fā)射，吸收峰以755 nm為中心，發(fā)射峰以800 nm為中心.Cy=Se表現(xiàn)出綠色熒光發(fā)射，吸收峰以405 nm為中心，發(fā)射峰以567 nm為中心.與Hg2+反應后，最終產(chǎn)物Keto-Cy在510 nm處形成最大吸收，在607 nm處有發(fā)射峰，通過比值更好地定量檢測.HCySeH已成功應用于慢性汞中毒小鼠模型中O和Hg2+的檢測.之后他們將Se替換成S，得到了類似響應機制的檢測探針141［113］.探針HCy-SH可用于HEK 293細胞和小鼠模型的汞中毒檢測，對O的檢測限為65 nmol/L，對Hg2+的檢測限為72 nmol/L.

Fig.46 Continuous detection of superoxide radical anion and Hg2+by probe 140 or 141

2019年，Miao等［114］報道了一種用于硝基還原酶（NTR）上轉換發(fā)光探針Cy7-NO2（142）（圖47），用以在體內(nèi)檢測NTR.探針142響應基團為硝基苯環(huán).該探針在硝基還原酶作用后，850 nm波長激發(fā)下，在790 nm處發(fā)射熒光.2020年，Yin等［115］開發(fā)了一種對去甲腎上腺素（NE）響應的探針143.在NE存在下，探針143在640 nm處熒光開啟.在這項工作中，將該探針應用于高K+刺激下去甲腎上腺素胞吐信號通路的熒光成像.首次實現(xiàn)抗抑郁藥物對去甲腎上腺素干預效果的可視化.

Fig.47 Molecular structures of nitroreductase and norepinephrine fluorescent probes 142 and 143

2018年，Li等［116］報道了一種由改進的Suzuki偶聯(lián)得到的檢測CN-的探針144（圖48），實現(xiàn)了對氰根離子的定量檢測.該探針在乙腈中對氰根離子的檢測限為14 nmol/L，在CH3CN/H2O（V/V=9∶1）中的檢測限為0.23μmol/L.

Fig.48 Molecular structure of cyanogen fluorescent probe 144

2019年，Yin等［117］報道了一種用于弱酸性環(huán)境下脂肪酸（FA）的特異性檢測探針145（圖49）.當暴露于FA時，探針145在弱酸性環(huán)境（pH=3～6）中顏色變化明顯，從藍色變成綠色，而在中性或堿性環(huán)境中保持藍色.探針145的顏色在FA暴露下發(fā)生變化，這是由于FA縮合誘導的pKa增加和隨后在弱酸條件下的質(zhì)子化過程.探針145可在30 s內(nèi)對FA快速反應，靈敏度較高（檢測限為3.25μmol/L），選擇性好.該探針被成功用于弱酸性溶液和氣體環(huán)境中FA的快速檢測，這個工作為特定條件下FA的檢測提供了一種簡便而有效的策略.

Fig.49 Molecular structure of a fatty acid probe 145

2019年，Chen等［118］報道了一種可用于活細胞和體內(nèi)缺氧條件下檢測次氯酸的探針CyHOCl（146）（圖50）.該探針對次氯酸的反應靈敏，生物相容性好，被成功用于測量急性缺血小鼠模型體外解剖器官中的次氯酸，并用于實時監(jiān)測缺氧斑馬魚模型中次氯酸的變化.

Fig.50 Molecular structure of a hypochlorous acid fluorescent probe 146

大多數(shù)情況下，利用PET機制或者共軛骨架的破壞與恢復策略設計開發(fā)的探針只在一個熒光通道下發(fā)生強度的增強或者減弱，而基于Cy7共軛外圍基團吸電子和供電子能力調(diào)控策略開發(fā)的分子探針，在檢測前后通常具有不同的熒光發(fā)射波長，因此有潛力對待測底物實現(xiàn)比例型定量檢測.

4 熒光共振能量轉移

當一個熒光分子（供體分子）的熒光發(fā)射光譜與另一個熒光分子（受體分子）的激發(fā)光譜重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減，這一過程被稱為“熒光共振能量轉移”（FRET）［119］.Cy7與其它光譜匹配的染料可以形成FRET對，利用二者對底物的反應性差異，可以實現(xiàn)基于FRET機理的熒光探針構建，從而實現(xiàn)待測底物的比例型檢測［120］.

2010年，Nagano等［121］研究了Cy5和Cy7與ROS反應性的差異（圖51），發(fā)現(xiàn)Cy7比Cy5對ROS更敏感，共軛結構更容易被破壞.通過將Cy5和Cy7連接成功地開發(fā)了近紅外熒光探針FOSCY-1（147），用以檢測氧化應激水平.在沒有ROS的情況下，由于兩種菁染料分子的FRET效應，在Cy5的激發(fā)波長下，探針只發(fā)射微弱的Cy5對應的熒光，而Cy7通道熒光較強.然而加入ROS后，Cy7的多甲基鏈發(fā)生斷裂，F(xiàn)RET效應消失，Cy5熒光得到恢復.探針147可檢測HL60細胞、豬中性粒細胞和小鼠腹膜炎模型中的ROS.基于類似的研究思路，2016年，Qian等［122］開發(fā)了一種基于FRET的小分子熒光探針PNCy3Cy5（148），利用Cy3和Cy5對ONOO-的反應性差異監(jiān)測ONOO-.當ONOO-存在時，熒光強度在560 nm處增強，在660 nm處減弱（圖52）.兩個熒光發(fā)射通道強度比（F560/F660）在檢測前后顯示出高達324倍的動態(tài)增長，該探針對ONOO-的最低檢測限為0.65 nmol/L.

Fig.51 Molecular structure of a FRET probe 147 for ROS

Fig.52 Molecular structure of a FRET probe 148 with its spectral response to ONOO-[122]

羅丹明供體和Cy7也可以組成FRET染料對.如2012年Hanaoka等［123］報道的可逆FRET系統(tǒng)149（圖53），用于監(jiān)測活細胞中的重復缺氧-常氧循環(huán).2018年，Liu等［124］合成了一種基于FRET的近紅外pH熒光探針150，將羅丹明供體與Cy7受體連接，利用羅丹明的酸堿響應開關調(diào)控其熒光發(fā)射，同時通過FRET將信號通過Cy7反饋出來.

Fig.53 Molecular structures of FRET probes 149—152

此外，基于Cy7平臺的FRET機制在設計特定的酶敏感化學傳感器中也非常流行.如2017年Yoon等［125］開發(fā)的可被組織蛋白酶B激發(fā)的探針151，可用于腫瘤特異性近紅外成像和光療；2019年設計的探針152［126］可用于檢測組蛋白脫乙?；窼IRT1的活性.

5 總結與展望

綜合評述了用作各種分析物比色和熒光傳感器的吲哚七甲川菁染料，特別關注了它們的結構設計、檢測機制以及生物成像劑的應用.對于花菁染料骨架的修飾通常有6個位點，分別為對稱結構的吲哚氮原子上的取代基、吲哚苯環(huán)上的取代基、聚甲川鏈中位N/O上的修飾以及中心環(huán)上的取代.其中，聚甲川鏈中位N/O上通常與目標分子響應位點相連接.目前已經(jīng)探索了檢測pH、活性氧、活性氮、硫化物和金屬離子等活性小分子的化學傳感器，并根據(jù)檢測機制進行細致的分類，其中，基于PET以及改變共軛外圍基團吸電子和供電子能力的探針最為常見.這些花菁化學傳感器由于其合適的激發(fā)和發(fā)射波長以及在生物樣品中的良好生物相容性，是必不可少的生物成像劑.

吲哚七甲川花菁染料具有較高的摩爾消光系數(shù)，結構可修飾性位點多，調(diào)控策略豐富，熒光發(fā)射處于近紅外區(qū)間.在過去的幾十年里，許多基于經(jīng)典的花菁染料的熒光探針已經(jīng)被開發(fā)出來，用于體內(nèi)檢測.然而，由于生物組織具有背景熒光，亟需開發(fā)具有高對比度和靈敏度的深組織生物成像熒光團.為了擴大其在生物成像或生物傳感方面的應用，必須克服菁染料熒光團的幾個局限性：（1）菁染料仍然面臨量子產(chǎn)率低和穩(wěn)定性差的問題.如其光穩(wěn)定較差，在成像的過程中可能因為光解導致探針信號減弱，對待測底物的檢測造成一定的干擾；（2）水溶性差，易堆積，需要引入額外的親水性基團或者通過材料包裹改善溶解性.活體內(nèi)代謝過快等不足也限制了其在生物體內(nèi)中的應用.此外，作為醫(yī)學診斷和疾病治療的熒光指標的花菁探針需要進一步關注.基于菁平臺的理想特性，相關化學傳感器的開發(fā)有重要的意義.