高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中9種禁用染料類藥物殘留

孫良娟，李紅權(quán)，蔡潤斌，莊姜云，唐慶強，唐媛媛，鐘 鍵，黃 武*

（1．湛江海關(guān)技術(shù)中心，廣東 湛江 524001；2．福州海關(guān)技術(shù)中心，福建 福州 350000）

亮綠（BG）又名堿性綠、燦爛綠，與孔雀石綠（MG）、結(jié)晶紫（CV）及其代謝產(chǎn)物隱性孔雀石綠（LMG）、隱性結(jié)晶紫（LCV）同屬于堿性三苯甲烷類染料，工業(yè)上常用作著色劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常用作魚類水霉病、寄生蟲病的治療藥物［1］。但此類化學(xué)物質(zhì)具有明顯的致畸、致癌、致突變的生物毒性。針對孔雀石綠和結(jié)晶紫及其氧化產(chǎn)物，多數(shù)國家和地區(qū)已嚴(yán)禁其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，并規(guī)定水產(chǎn)品中不得檢出此類物質(zhì)，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號也將其列入《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》，禁止其用于食用動物的養(yǎng)殖過程，但該類藥物的非法使用仍時有發(fā)生［2-5］。而關(guān)于亮綠目前國內(nèi)尚無相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)與限量標(biāo)準(zhǔn)。

亞甲基藍(lán)（MB）又名堿性湖藍(lán)、美藍(lán)，是一種人工合成的噻嗪類染料，在溶液中以離子型化合物存在，可通過與微生物酶系統(tǒng)競爭氫離子，使酶處于無活性狀態(tài)，達(dá)到消毒殺菌目的，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上常用來替代孔雀石綠、結(jié)晶紫，用于防治水霉病、寄生蟲病等魚類疾病，也作為抗真菌藥物和水體消毒劑用于活魚運輸，提高魚類的生存率［6-7］。亞甲基藍(lán)有天青A（AZA）、天青B（AZB）和天青C（AZC）3種代謝物。與孔雀石綠和結(jié)晶紫相比，亞甲基藍(lán)的毒性低，在孔雀石綠和結(jié)晶紫被禁用后，亞甲基藍(lán)成為較好的替代品，但當(dāng)其使用濃度超過安全范圍時，仍會引起水生動物大量死亡，且高濃度的養(yǎng)殖廢水會造成環(huán)境污染。研究表明，亞甲基藍(lán)對鳑鲏魚幼魚的安全濃度為0．96 mg∕L［8］，對三角魴的安全濃度為1．24 mg∕L［9］，對凡納濱對蝦的安全濃度為0．935 mg∕L［10］。目前，美國已禁止在食用水產(chǎn)動物中使用亞甲基藍(lán)，日本《肯定列表》規(guī)定亞甲基藍(lán)在水產(chǎn)品中的最高殘留限量為10 μg∕kg［11］，而國內(nèi)尚未有相關(guān)明確規(guī)定。

水產(chǎn)品中三苯甲烷類獸藥的檢測方法主要有膠體金法［12-14］、酶聯(lián)免疫法［15-17］、液相色譜法［18-19］以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［20-22］等，但同時檢測三苯甲烷類與噻嗪類藥物的文獻(xiàn)報道較少。楊方等［23］采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對水產(chǎn)品中亞甲基藍(lán)及3種代謝物進(jìn)行檢測，但未檢測孔雀石綠、結(jié)晶紫、亮綠。余瑋玥等［24］建立了同時檢測水產(chǎn)品中亮綠、亞甲基藍(lán)及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，但未包括孔雀石綠和結(jié)晶紫。侯建波等［25］采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時檢測水產(chǎn)品中的三苯甲烷類和噻嗪類藥物，采用MCAX柱固相萃取凈化，使用2種洗脫液分別洗脫三苯甲烷類和噻嗪類藥物，洗脫過程繁瑣且耗時長。本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用鹽析萃取和固相萃取的凈化方式，建立了檢測水產(chǎn)品中三苯甲烷類和噻嗪類共9種藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法靈敏度高，適用性強，準(zhǔn)確性好，可用于水產(chǎn)品中主要禁用染料類藥物的殘留檢測和風(fēng)險監(jiān)控，以確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SCIEX Qtrap 4500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（SCIEX公司）；Turbo Vap LV型氮吹濃縮儀（Zymark公司）；T18型均質(zhì)器（IKA公司）；3-18K型高速冷凍離心機（西格瑪公司）；TDL-5-A型低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Multi Reax渦旋振蕩器（Heidolph公司）；AL204-IC型分析天平（梅特勒公司）；Waters XSelect HSS T3 液相色譜柱（2．1 mm × 100 mm，3．5 μm，Waters公司）；Phenomenex Luna C18色譜柱（2．1 mm × 50 mm，5 μm）；Waters Atlantis? T3柱（2．1 mm × 100 mm，3 μm）；MCX萃取柱（6 mL∕500 mg，美國Waters公司）；丙磺酸（PRS）固相萃取柱（3 mL∕500 mg，廣州信譜徠公司）；HR-XC陽離子柱（3 mL∕300 mg，北京振翔公司）；濾膜（0．22 μm，上海安譜公司）。

亮綠、天青A（100 μg∕mL，天津阿爾塔公司）；亞甲基藍(lán)（97．1%）、天青B（88．8%）、天青C（51．9%）（天津阿爾塔公司）；孔雀石綠及代謝物、結(jié)晶紫及代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg∕mL，天津阿爾塔公司）；乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；甲酸（色譜純，Aladdin公司）；乙酸銨（色譜純，迪馬公司）；鹽酸羥胺、對甲苯磺酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；洗脫液為乙腈-50 mmol∕L乙酸銨（pH 4．5，體積比1∶1）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量的亞甲基藍(lán)（97．1%）、天青B（88．8%）、天青C（51．9%）標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為100 μg∕mL的儲備液，于-18 ℃保存；準(zhǔn)確移取一定體積的100 μg∕mL上述9種藥物儲備液，用乙腈逐級稀釋成質(zhì)量濃度為50 μg∕L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提 取待測樣品取可食部分，攪碎混勻，制成肉糜狀樣品，裝入潔凈樣品袋中，于-18 ℃冰箱冷凍保存。準(zhǔn)確稱取肉糜狀樣品3．0 g（精確至0．01 g），加入1 mL 0．25 g∕mL的鹽酸羥胺、2 mL的0．5 mol∕L對甲苯磺酸、2 mL的0．1 mol∕L乙酸銨（pH 4．5），渦旋振蕩5 min，使樣品均勻分散，加入10mL乙腈、4 g氯化鈉，劇烈振蕩15 min，40 ℃超聲提取10 min。在4 ℃下以12 000 r∕min離心10 min，移取上清液至氮吹管中，再加入10 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并提取液。

1.3.2 凈 化提取液在40 ℃下氮氣吹掃濃縮至2 mL左右，加入4 mL經(jīng)乙腈飽和的正己烷，渦旋振蕩1 min，4 000 r∕min離心10 min，移取下層乙腈層至PRS固相萃取柱（預(yù)先用2 mL乙腈活化），再向氮吹管中加入2 mL乙腈重復(fù)上述步驟。待樣液流盡后，用1 mL水和1 mL乙腈淋洗并減壓抽干萃取柱，用6 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液于帶刻度玻璃試管中，于40 ℃氮吹至2 mL左右，用流動相定容至3 mL，過0．22 μm濾膜后上機測定。

1.4 儀器條件

色譜柱：Luna C18液相色譜柱（2．1 mm × 50 mm，5 μm），柱溫：35 ℃，流速：0．35 mL∕min，進(jìn)樣量：10 μL。流動相：A為5 mmol∕L乙酸銨（含0．1%甲酸），B為乙腈。洗脫梯度為：0 ～ 2．0 min，5% ～95% B；2．0 ～ 4．0 min，95% B；4．0 ～ 4．1 min，95% ～ 5% B；4．1 ～ 6．0 min，5% B。

離子源：電噴霧離子源，掃描方式：正離子模式，監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，電離電壓為5 500 V，離子源溫度為550 ℃，霧化氣壓力為345 kPa，輔助加熱氣壓力為380 kPa，氣簾氣（N2）壓力為207 kPa。9種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下9種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 9 target compounds in MRM mode

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將甲醇稀釋的1 μg∕mL的9種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蠕動泵以0．01 mL∕min流速注入電噴霧離子源中，在持續(xù)的恒流狀態(tài)下進(jìn)樣，優(yōu)化各待測物的質(zhì)譜參數(shù)。9種待測物均為離子型化合物，在正離子模式下以［M］＋形式存在，通過一級質(zhì)譜掃描（Q1 scan）方式，獲得各待測物的質(zhì)譜圖并確定各自的母離子質(zhì)量數(shù)。通過二級質(zhì)譜掃描即碎片離子掃描（Product ion scan）獲得各待測物的碎片離子圖，確定碎片離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)。選取響應(yīng)高、干擾小的碎片離子與母離子組成離子通道，盡量避免選取脫水峰。在MRM模式下，分別精確優(yōu)化各待測物子離子的去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)，確定最佳質(zhì)譜電壓參數(shù)。進(jìn)一步優(yōu)化離子源的噴霧電壓、電離溫度、霧化氣壓力、輔助加熱氣壓力等參數(shù)，使各待測物的靈敏度最高，確定最佳質(zhì)譜條件如“1．4”所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

C18柱是目前采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測有毒有害物質(zhì)常用的色譜分離柱，本實驗分別考察了Luna C18柱（2．1 mm × 50 mm，5 μm）、XSelect HSS T3柱（2．1 mm × 100 mm，3．5 μm）、Atlantis? T3柱（2．1 mm × 100 mm，3 μm）對9種目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果顯示，以甲醇-水體系作為流動相時，3種色譜柱均出現(xiàn)拖尾、峰形變寬的現(xiàn)象；以乙腈-水體系作為流動相時，9種化合物的峰形得到較大改善，可能與乙腈在反相色譜柱上的洗脫能力大于甲醇有關(guān)。因此選擇乙腈作為有機相。流動相中加入甲酸可提高待測化合物的離子化效率，進(jìn)而提高其響應(yīng)值；乙酸銨作為緩沖鹽，可起到改善峰形、提高分離度的作用，因此在水相中加入0．1%甲酸與5 mmol∕L乙酸銨進(jìn)一步考察3種色譜柱對9種待測物的分離效果。結(jié)果表明，XSelect HSS T3柱對天青C的保留能力弱，峰形前延、不對稱，隱性結(jié)晶紫的峰寬變寬，響應(yīng)值低；Atlantis? T3柱對亞甲基藍(lán)與3種代謝物無法實現(xiàn)基線分離，且天青C的峰形不理想；Luna C18色譜柱可有效分離9種待測物，各組分的峰形尖銳、對稱，響應(yīng)好，靈敏度高，且天青C與隱性結(jié)晶紫的峰形明顯改善。因此，選用Luna C18柱作為分離色譜柱。進(jìn)一步優(yōu)化梯度洗脫條件，使各組分的靈敏度最佳。圖1為最優(yōu)條件下10μg∕L的9種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM圖。

圖1 最優(yōu)條件下9種目標(biāo)化合物的MRM圖（10 μg∕L）Fig．1 MRM chromatograms of 9 target compounds under optimal conditions（10 μg∕L）

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 液液萃取方式的選擇文獻(xiàn)［23-25］采用乙腈-0．1 mol∕L乙酸銨（pH 4．5）緩沖溶液作為提取劑，同時加入鹽酸羥胺溶液防止孔雀石綠、結(jié)晶紫被氧化，加入對甲苯磺酸溶液與9種離子型待測物結(jié)合成離子對，以提高提取效率。但由于加入多種鹽溶液，導(dǎo)致提取液中含有大量水，極大地影響了濃縮效率和效果；為除去水分需在提取液中加入二氯甲烷，導(dǎo)致萃取液體積大，濃縮時間長，操作繁瑣且耗時。

在農(nóng)獸藥殘留分析中，鹽析萃取法是常用的除水方法。因此，考察了在提取液中加入氯化鈉的除水效果。樣品加標(biāo)實驗結(jié)果表明，當(dāng)加入足量氯化鈉并充分振搖離心后，水相與乙腈分層明顯，上層乙腈層溶液澄清透明，9種待測物的回收率均在80%以上。同時，氯化鈉的鹽析作用還能促使提取的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)在水相中沉淀，減少提取液中的有機雜質(zhì)，提高待測物的響應(yīng)值。本實驗選擇在提取液中加入約4 g氯化鈉，使水相達(dá)到飽和，利用鹽析萃取作用，實現(xiàn)了水相和有機相的分離且效果良好。

2.3.2 固相萃取柱的選擇9種待測物均為自身帶電荷的陽離子型化合物，使用具有陽離子交換吸附性能的萃取柱更有利于提高待測物的吸附凈化效率。混合型陽離子交換柱（MCX）是以高度交聯(lián)的聚苯乙烯和二乙烯基苯為基質(zhì)、表面鍵合磺酸基的陽離子交換吸附柱；丙磺酸固相萃取柱（PRS）是以硅膠為基質(zhì)、表面鍵合丙磺酸的強陽離子交換吸附柱；HR-XC陽離子柱的填料性質(zhì)與MCX柱類似。上述3種萃取柱對陽離子型化合物均有良好的吸附保留能力，因此考察了其對9種化合物的吸附凈化效果。移取1 mL 50 μg∕L的9種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于3支玻璃管中，各加入2 mL按照“1．3．1”處理得到的羅非魚空白基質(zhì)提取液，混勻后轉(zhuǎn)移至上述3種用乙腈活化的萃取柱中，用2 mL乙腈洗滌玻璃管2次并依次過柱。洗脫液為乙腈-50 mmol∕L乙酸銨（pH 4．5，1∶1）。結(jié)果表明，MCX柱和HR-XC柱對9種化合物的吸附作用較大，洗脫效果差，回收率低，兩柱的回收率分別為69．8% ～ 82．7%和69．2% ～78．3%；PRS柱的回收率較為理想，9種化合物的回收率為82．3% ～ 93．7%。因此，選擇PRS柱作為固相萃取凈化柱。

2.3.3 洗脫液的選擇文獻(xiàn)［24］采用乙腈-0．1 mol∕L乙酸銨（pH 4．5，1∶1）作為PRS柱的洗脫液，并將洗脫液濃縮定容至3 mL后上機測定，但濃縮后上機液中乙酸銨的濃度增大，過高濃度的鹽溶液增加了質(zhì)譜儀污染的風(fēng)險。文獻(xiàn)［26］采用相同的洗脫液，將洗脫液稀釋10倍后直接上機測定，由于三苯甲烷類與噻嗪類藥物均為禁用藥物，監(jiān)控要求不得檢出，此種方式不利于提高方法的靈敏度。本實驗考察了pH值均為4．5的25、50、75、100 mmol∕L的乙酸銨溶液與乙腈等體積混合作為洗脫液的洗脫效果。移取1 mL 50 μg∕L的9種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入用乙腈活化的PRS萃取柱中，分別用上述4種洗脫液進(jìn)行洗脫。由于9種待測物均為染料類藥物，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液呈藍(lán)綠色，上柱后可被填料吸附形成色帶。加入洗脫液后，待測物形成的色帶在柱填料的移動速度隨著乙酸銨濃度的增加而增快，表明洗脫液的洗脫能力隨著乙酸銨濃度的增大而增強，所需洗脫時間隨之縮短，洗脫液用量隨之減少。按照乙酸銨濃度由高到低順序，待測物色帶完全脫離萃取柱所需的洗脫液體積依次為4、5、6、10 mL。綜合考慮，實驗選擇乙腈-50 mmol∕L乙酸銨（pH 4．5，1∶1）作為洗脫液，9種待測物的回收率在78．4% ～ 97．1%范圍內(nèi)，可滿足方法學(xué)要求。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)水產(chǎn)品樣品成分復(fù)雜，雖然提取液經(jīng)過凈化處理，但仍有部分雜質(zhì)可能與待測物隨流動相進(jìn)入質(zhì)譜離子源，對目標(biāo)化合物的離子化效果產(chǎn)生影響，進(jìn)而導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)（ME）。采用下式計算基質(zhì)效應(yīng)：ME = （1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率∕溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）× 100%［27］。分別以空白羅非魚樣品提取液和乙腈-0．1%甲酸溶液（2∶8，體積比）配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液并上機測定，得到9種化合物的ME為31．8% ～ 76．4%，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此采用空白基質(zhì)匹配法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以抵消基質(zhì)效應(yīng)，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4.2 線性范圍、檢出限與定量下限準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用空白基質(zhì)提取液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液，以各待測化合物的質(zhì)量濃度（x，μg∕L）為橫坐標(biāo)，各化合物定量離子的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。以空白羅非魚作為樣品基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)實驗，加標(biāo)濃度為0．5、1．0、2．0、5．0、10．0 μg∕kg，采用本方法進(jìn)行前處理和檢測，以定量離子色譜峰的信噪比S∕N≥ 3且滿足方法準(zhǔn)確度要求時的最低濃度為方法檢出限（LOD），以S∕N≥ 10對應(yīng)的最低濃度為定量下限（LOQ）。結(jié)果顯示，9種待測物均在0．5 ～ 20．0 μg∕L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r2＞ 0．99），LOD均為0．5 μg∕kg，LOQ均為1．0 μg∕kg（見表2）。

表2 9種目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r2），limits of detection（LODs） and limits of quantitation（LOQs） of 9 target compounds

2.4.3 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為進(jìn)一步驗證方法的可行性與適用性，分別對空白羅非魚、金鯧魚、南美白對蝦和青蟹樣品在0．5、1．0、5．0 μg∕kg水平下進(jìn)行了加標(biāo)回收率和精密度實驗（n= 7）。如表3所示，9種待測物在上述樣品基質(zhì)中的平均回收率為76．8% ～ 104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4．3% ～10%，表明方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好，能滿足分析檢測要求。

表3 9種目標(biāo)化合物在4種樣品中的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 7）Table 3 Average recoveries and RSDs of 9 target compounds spiked in four samples（n = 7）

2.5 實際樣品檢測

采用本方法對實驗室留存的海鱸魚、石斑魚、羅非魚和斑節(jié)蝦共16個樣品進(jìn)行檢測，均未檢出目標(biāo)化合物。對健康羅非魚（體質(zhì)量200 ～ 300 g）進(jìn)行亞甲基藍(lán)藥浴實驗，藥浴質(zhì)量濃度約為1 mg∕L，4 h后采樣，取肌肉部分按照本方法進(jìn)行測定。羅非魚肌肉中檢出亞甲基藍(lán)和天青B，含量分別為3．41、1．89 μg∕kg，未檢測到天青A和天青C。圖2為檢出亞甲基藍(lán)與天青B的樣品的MRM圖。數(shù)據(jù)表明，本方法準(zhǔn)確可靠，可操作性強，能夠滿足水產(chǎn)品中三苯甲烷類與噻嗪類藥物殘留的檢測要求。

圖2 羅非魚陽性樣品中亞甲基藍(lán)（A）和天青B（B）的MRM圖Fig．2 MRM chromatograms of methylene blue（A） and azure B（B） in tilapia positive samples

3 結(jié) 論

本文建立了檢測水產(chǎn)品中三苯甲烷類與噻嗪類共9種禁用染料類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，樣品經(jīng)乙腈-0．1 mol∕L乙酸銨（pH 4．5）提取后，采用鹽析萃取、正己烷液液萃取和固相萃取的凈化方式，凈化效果良好，有效去除了干擾，提高了靈敏度。在優(yōu)化的實驗條件下，9種待測物在0．5 ～ 20．0 μg∕L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0．5 μg∕kg，定量下限為1．0 μg∕kg，樣品加標(biāo)回收率為76．8% ～ 104%，RSD為4．3% ～ 10%。本方法定量準(zhǔn)確，靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于水產(chǎn)品中禁用染料類藥物的日常檢測和殘留監(jiān)控。