TiN-Ag@Ag SERS基底制備及其對(duì)腺嘌呤的檢測(cè)性能與增強(qiáng)機(jī)制研究

安曉潔，趙 靜，裴 媛，王志武，劉艷坤，李 波，魏穎娜，魏恒勇，吳振剛*，李景武*

（1．華北理工大學(xué) 藥學(xué)院，河北 唐山 063210；2．唐山市人民醫(yī)院，河北 唐山 063001；3．華北科技學(xué)院河北危險(xiǎn)化學(xué)品安全與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 廊坊 065201；4．華北理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，河北 唐山 063210）

表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）可通過(guò)粗糙金屬或半導(dǎo)體表面增強(qiáng)效應(yīng)提升被檢測(cè)物的拉曼信號(hào)，具有快速、特異性強(qiáng)以及可進(jìn)行單分子檢測(cè)的特點(diǎn)，自被發(fā)現(xiàn)［1-2］以來(lái)一直備受關(guān)注。SERS技術(shù)在藥物分子檢測(cè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［3］，其中腺嘌呤分子的低濃度SERS檢測(cè)對(duì)生物和醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用有著重要意義［4］。

腺嘌呤分子是一個(gè)十分重要的生物分子，是核酸的4種核堿基之一，參與RNA和DNA合成，也是生命能量物質(zhì)ATP的重要組成部分。DNA分子的SERS信號(hào)中腺嘌呤為主導(dǎo)信號(hào)，對(duì)腺嘌呤的SERS進(jìn)行檢測(cè)是檢測(cè)DNA的有效分析手段［5］。此外，體內(nèi)腺嘌呤含量的變化可能會(huì)引起肺癌的發(fā)生，因此體內(nèi)腺嘌呤的含量也可視為早期肺癌的重要判斷依據(jù)。湯釗［6］以抗壞血酸為還原劑制備銀溶膠，并以其為增強(qiáng)基底對(duì)腺嘌呤水溶液及尿液樣進(jìn)行了SERS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)銀溶膠表現(xiàn)出SERS增強(qiáng)效果。

銀溶膠是目前SERS基底的常用材料之一，陳志杰等［7］使用銀溶膠為SERS基底對(duì)水和尿液中的舒芬太尼進(jìn)行了檢測(cè)。但由于銀的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致SERS檢測(cè)的應(yīng)用范圍受限［8］。氮化鈦（TiN）的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性以及生物兼容性優(yōu)異，同時(shí)展現(xiàn)出良好的SERS性能［9］?；诖酥苽滟F金屬∕氮化鈦復(fù)合基底，可改善貴金屬材料的穩(wěn)定性和生物相容性，并提升基底的SERS活性。Ban等［10］通過(guò)制備TiN-Ag復(fù)合基底，利用Ag與TiN之間的電荷轉(zhuǎn)移和較強(qiáng)的局部電磁場(chǎng)耦合效應(yīng)，大幅提高了基底的SERS靈敏度，同時(shí)基底的耐久性也得到了改善。Liu等［11］制備的Ag∕Au∕TiN復(fù)合薄膜憑借Ag∕Au∕TiN三者的耦合效應(yīng)，使得基底的SERS效應(yīng)顯著增強(qiáng)。Wang等［12］制備的Au@TiNx納米結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出拉曼散射增強(qiáng)效果。Ma等［13］通過(guò)在包裹Ag的TiN基底上組裝Au納米顆粒，借助Ag、TiN和Au之間的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)了良好的表面增強(qiáng)拉曼效果。利用貴金屬和TiN材料良好的協(xié)同耦合作用開發(fā)高性能的SERS基底，探討其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。

本文采用電沉積及自組裝法制備了TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜、TiN-Ag@Ag溶膠3種復(fù)合SERS基底，探討了3種基底對(duì)腺嘌呤的拉曼檢測(cè)性能，并分析了其拉曼增強(qiáng)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試 劑

四氯化鈦（TiCl4）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，130 × 104）以及腺嘌呤均購(gòu)自上海阿拉丁試劑網(wǎng)；無(wú)水乙醇購(gòu)自天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所；硝酸銀（AgNO3）、檸檬酸三鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨氣（99．99%）和氮?dú)猓?9．99%）購(gòu)自唐山市路北區(qū)萬(wàn)嘉氣體經(jīng)銷處。

1.2 SERS基底的制備

參考文獻(xiàn)［11］制備TiN薄膜與Ag溶膠。TiN薄膜制備：取6 mL四氯化鈦乙醇溶液，加入10 mL無(wú)水乙醇，2．5 mL DMF，1 g PVP，攪拌溶解。隨后以勻膠儀石英基片鍍膜，時(shí)間為20 s，轉(zhuǎn)速為3 500 r∕min。于烘箱80 ℃干燥24 h后，600 ℃下預(yù)燒，保溫30 min得到TiO2膜。將TiO2膜放入管式爐，以5 ℃∕min的速度升溫至1 000 ℃，之后通入800 mL∕min的NH3，保溫2 h，得到TiN薄膜。

Ag溶膠制備：取AgNO30．018 g加至100 mL去離子水中溶解，在水浴中加熱攪拌至沸騰。當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí)，滴加2 mL 0．1 g∕mL的檸檬酸鈉，反應(yīng)1 h得到黃綠色的Ag溶膠溶液。

TiN-Ag薄膜基底制備：取0．016 9 g AgNO3溶解于20 mL去離子水中，得到濃度為5 mmol∕L的AgNO3沉積液。以TiN薄膜基底為工作電極，金屬Pt為對(duì)電極，電壓為5 V，沉積時(shí)間為5 min，制備TiN-Ag薄膜基底。

TiN@Ag溶膠基底制備：將Ag溶膠在8 000 r∕min下離心10 min，除去上清液，將得到的下層液體與樣品混合均勻滴加在TiN薄膜表面，即得到TiN@Ag溶膠基底。

TiN-Ag@Ag溶膠基底制備：將Ag溶膠在8 000 r∕min下離心10 min，除去上清液，將得到的下層液體與樣品混合均勻滴加在TiN-Ag薄膜的表面，即得到TiN-Ag@Ag溶膠基底。

1.3 SERS檢測(cè)與表征

將腺嘌呤溶于去離子水中配制成不同濃度的溶液，滴加在TiN-Ag基底或與Ag溶膠1∶1混勻滴加在TiN和TiN-Ag基底上。采用DXR激光拉曼光譜儀（美國(guó)熱電公司）在激發(fā)波長(zhǎng)為633 nm，功率為1 mW，物鏡為10 ×，采集時(shí)間為10 s的條件下進(jìn)行SERS檢測(cè)，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行打點(diǎn)數(shù)據(jù)收集，點(diǎn)數(shù)為8。

采用JEM-2800F透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會(huì)社）觀測(cè)所合成Ag溶膠的形貌；利用Zetasizer Nano ZS90納米粒度分析儀（英國(guó)馬爾文公司）測(cè)定Ag溶膠的粒徑分布；借助D∕MAX2500PC X射線衍射儀（XRD，日本理學(xué)株式會(huì)社）和S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立株式會(huì)社）分析基底物相組成和微觀形貌；采用Lambda 750S紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)Perkinelmer公司）測(cè)試樣品的吸收曲線；利用Thermo 250X紫外光電子能譜（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）測(cè)試薄膜的功函數(shù)和價(jià)帶導(dǎo)帶位置。

2 結(jié)果與討論

2.1 TiN-Ag@Ag溶膠復(fù)合SERS基底的表征

利用透射電子顯微鏡觀察Ag溶膠的顆粒形貌，結(jié)果顯示合成的Ag溶膠納米顆粒呈準(zhǔn)球形，粒徑為50 ～ 100 nm，其衍射環(huán)明顯，表明合成的Ag溶膠為金屬Ag單質(zhì)（圖1A）。同時(shí)在高分辨率圖像中觀察到其晶格邊緣間距為0．23 nm（圖1B），與單質(zhì)Ag晶體的（111）晶面相對(duì)應(yīng)。利用紫外-可見分光光度計(jì)表征其等離子共振吸收峰，發(fā)現(xiàn)在419 nm附近出現(xiàn)了Ag納米顆粒的等離子體共振吸收峰［14-15］。以上結(jié)果表明，檸檬酸鈉將硝酸銀還原成Ag單質(zhì)納米粒子。

圖1 Ag溶膠的TEM圖（A ～ B）及其UV-Vis光譜（C）Fig．1 TEM images of Ag sol（A-B） and its’UV-Vis spectrum（C）

對(duì)TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜、TiN-Ag@Ag溶膠3種復(fù)合基底進(jìn)行XRD測(cè)試，結(jié)果如圖2A所示。XRD圖表明，TiN的（111）和（200）衍射峰分別出 現(xiàn) 在36．9°和42．9°。單 質(zhì)Ag晶 體 的（111）、（200）、（220）和（311）衍射峰分別出現(xiàn)在38．2°、44．4°、64．6°和77．4°。在TiN-Ag@Ag溶 膠 的XRD圖譜中，Ag單質(zhì)（111）的特征衍射峰越來(lái)越尖銳，表明越來(lái)越多的Ag單質(zhì)聚集在TiN表面，并優(yōu)先沿（111）面擇優(yōu)生長(zhǎng)。圖2B則顯示了3種基底的UV-Vis圖，如圖所示，400 ～ 600 nm處出現(xiàn)了共振吸收峰，與a和b相比，曲線c的吸收峰位置有紅移，表明Ag聚集在TiN表面，Ag和TiN之間存在共振耦合。

圖2 TiN@Ag溶膠（a）、TiN-Ag薄膜（b）、TiN-Ag@Ag溶膠（c）基底的XRD圖（A）和UV-Vis圖（B）Fig．2 XRD spectra（A） and UV-Vis spectra（B） of TiN@Ag sol（a），TiN-Ag film（b），TiN-Ag@Ag sol（c）

TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄 膜 和TiN-Ag@Ag溶膠的SEM形貌如圖3所示。圖3A顯示，少量的Ag納米粒子聚集在TiN薄膜的表面上。而TiN薄膜上沉積Ag后，其表面出現(xiàn)Ag納米棒，并呈現(xiàn)出樹枝狀的結(jié)構(gòu)（圖3B）。圖3C表明TiN-Ag基底上復(fù)合Ag溶膠后，Ag納米粒子分布在TiN薄膜表面沉積的Ag納米棒周圍。

圖3 TiN@Ag溶膠（A）、TiN-Ag薄膜（B）、TiN-Ag@Ag溶膠（C）的SEM圖Fig．3 SEM diagrams of TiN@Ag sol（A），TiN-Ag film（B） and TiN-Ag@Ag sol（C）

2.2 腺嘌呤理論圖譜與拉曼檢測(cè)

通過(guò)Gaussian軟件利用密度泛函理論（DFT）優(yōu)化了腺嘌呤的結(jié)構(gòu)并計(jì)算了其理論拉曼圖譜，如圖4所示。對(duì)腺嘌呤粉體進(jìn)行常規(guī)拉曼（NRS）測(cè)試，并以TiN-Ag薄膜為SERS基底，對(duì)0．01 mol∕L的腺嘌呤溶液進(jìn)行SERS檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?，與理論拉曼圖譜相比，腺嘌呤的常規(guī)拉曼譜、SERS圖譜中的部分拉曼峰位發(fā)生了偏移，但其基本特征峰較為吻合，主要特征峰歸屬見表1。造成峰位偏移的原因可能是腺嘌呤吸附在增強(qiáng)基底上時(shí)分子的構(gòu)型和偶極距發(fā)生了改變，也可能是理論計(jì)算中過(guò)多的電子以及外部溶劑的參與造成。

表1 腺嘌呤的DFT、NRS和SERS光譜歸屬Table 1 DFT，NRS and SERS spectral attribution of adenine

圖4 DFT優(yōu)化的腺嘌呤結(jié)構(gòu)（A）及其理論拉曼圖譜（B）Fig．4 DFT-optimized adenine structure（A） and its theoretical Raman atlas（B）

圖5 腺嘌呤的常規(guī)拉曼圖譜（A，粉體）及SERS圖譜（B，溶液）Fig．5 Conventional Raman atlas（A，powder） and SERS atlas（B，solution） of adenine

2.3 不同基底對(duì)腺嘌呤的SERS檢測(cè)性能分析

將0．01 mol∕L的腺嘌呤溶液（0．013 5 g，10 mL去離子水）分別吸附在TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜和TiN-Ag@Ag溶膠3種基底上，研究不同基底對(duì)腺嘌呤的拉曼增強(qiáng)性能。圖6A顯示，TiN-Ag薄膜基底的拉曼增強(qiáng)性能優(yōu)于在TiN@Ag溶膠基底；與另兩種基底相比，TiN-Ag@Ag溶膠作為基底的拉曼性能增強(qiáng)效果最強(qiáng)。圖6B顯示了腺嘌呤在不同基底上于740 cm-1和1 330 cm-1處的信號(hào)峰強(qiáng)度，可以看出其在TiN-Ag@Ag溶膠基底上特征峰的拉曼強(qiáng)度最高。

圖6 不同基底上腺嘌呤的SERS光譜（A）及其特征峰的拉曼強(qiáng)度（B）Fig．6 SERS spectra of adenine on different substrates（A） and adenine characteristic peak Raman intensity（B）

將腺嘌呤配成10-2、10-3、10-4、10-5mol∕L濃度梯度的溶液，以TiN-Ag@Ag溶膠為基底測(cè)試其SERS檢出限，結(jié)果見圖7?？梢钥闯?，隨著腺嘌呤溶液濃度的遞降，腺嘌呤的SERS信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。以腺嘌呤的溶液濃度（X）與相對(duì)應(yīng)的728 cm-1處的拉曼強(qiáng)度（Y）取對(duì)數(shù)之后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到Y(jié) =0．408X +3．843，相關(guān)系數(shù)（r2）為0．989 5。從圖中可以看出，當(dāng)溶液濃度低至10-5mol∕L時(shí)，仍可觀察到728 cm-1處特征峰的拉曼信號(hào)，因此腺嘌呤在TiN-Ag@Ag溶膠基底上的檢出限可達(dá)10-5mol∕L。說(shuō)明該基底適用性尚可，且靈敏度較高。與其他Ag納米基底［16］相比，本文基底制備過(guò)程簡(jiǎn)單，TiN薄膜基底機(jī)械性能好且穩(wěn)定［17］，在空氣中放置兩周仍可有較好的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)，具有一定的應(yīng)用前景。

圖7 不同濃度腺嘌呤在TiN-Ag@Ag溶膠基底上的SERS圖譜Fig．7 SERS spectra of different concentrations of adenine on the TiN-Ag@Ag sol substrate

2.4 SERS增強(qiáng)機(jī)制分析

測(cè)定了TiN薄膜的紫外光電子光譜（UPS）（圖8），確定TiN的UPS寬度為14．05 eV（16．55-2．50），TiN-Ag復(fù)合 后的UPS寬 度為13．26 eV（16．68-3．42）。通過(guò)將激發(fā)能（21．22 eV）與UPS光譜的寬度相減，估計(jì)出TiN基底的VB位于-7．17 eV，并得到功函數(shù)Φ為-4．67 eV，由于功函數(shù)為真空能級(jí)減去費(fèi)米能級(jí)后得到的值，由此可知其費(fèi)米能級(jí)位置。同理得到TiN-Ag復(fù)合后的功 函 數(shù) 為-4．54 eV。TiN薄 膜 的 禁 帶 寬 度［18］為2．73 eV，利用ECB帶=EVB-Eg（ECB、EVB、Eg分別代表半導(dǎo)體材料的導(dǎo)帶電勢(shì)、價(jià)帶電勢(shì)和禁帶寬度），得到TiN的CB位于-4．44 eV。結(jié)合高斯軟件中密度泛函理論計(jì)算腺嘌呤的LUMO和HOMO位置，得到其LUMO和HOMO分別為-0．99 eV和-6．34 eV。由圖9可知，電荷可以很好地從Ag轉(zhuǎn)移到TiN中，直至二者的軌道能級(jí)差相同，由于轉(zhuǎn)移過(guò)程，TiN-Ag界面內(nèi)會(huì)產(chǎn)生電荷積累和一定的電勢(shì)，這對(duì)局部電磁場(chǎng)效應(yīng)非常有利，因此，TiN-Ag復(fù)合后的基底拉曼性能提高，由于復(fù)合基底與腺嘌呤分子之間也存在電荷轉(zhuǎn)移，故腺嘌呤的拉曼信號(hào)更為增強(qiáng)。此外，當(dāng)藥物的HOMO和LUMO位置與腺嘌呤相似時(shí)，則基底與分析物分子之間同樣存在電荷轉(zhuǎn)移，如使用此基底對(duì)對(duì)乙酰氨基苯酚、茶堿、布洛芬、恩諾沙星等藥物進(jìn)行SERS檢測(cè)也可以得到很好的SERS增強(qiáng)效應(yīng)。

圖8 TiN（A）和TiN-Ag（B）的UPS光譜Fig．8 UPS spectra of TiN（A） and TiN-Ag（B）

圖9 TiN-Ag復(fù)合基底與腺嘌呤之間的電荷轉(zhuǎn)移示意圖Fig．9 Schematic diagram of charge transfer between TiN-Ag composite substrate and adenine

為對(duì)Ag溶膠、TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜、TiN-Ag@Ag溶膠基底的電場(chǎng)分布以及SERS增強(qiáng)機(jī)制進(jìn)一步分析，選擇400 ～ 700 nm波長(zhǎng)的光沿著y軸方向射入，利用時(shí)域有限分差法（FDTD）對(duì)基底進(jìn)行模擬，結(jié)果如圖10所示。比較Ag溶膠基底與TiN@Ag溶膠發(fā)現(xiàn)，TiN薄膜上復(fù)合Ag溶膠納米粒子后，在TiN薄膜與Ag納米顆粒的結(jié)合處出現(xiàn)明顯的“熱點(diǎn)”，提高了局域電場(chǎng)強(qiáng)度（圖10A ～ B）。TiN-Ag薄膜基底（圖10C）比TiN@Ag溶膠基底的電場(chǎng)強(qiáng)度強(qiáng)，是因?yàn)門iN薄膜與Ag納米棒的結(jié)合產(chǎn)生了明顯的表面等離子體耦合效應(yīng)。從圖10D可以看到，在TiN-Ag薄膜上復(fù)合Ag溶膠后，使得基底的電場(chǎng)強(qiáng)度增強(qiáng)效應(yīng)更為顯著，可能是因?yàn)門iN-Ag@Ag溶膠基底上除了具有TiN薄膜與Ag納米顆粒發(fā)生共振耦合作用明顯出現(xiàn)的“熱點(diǎn)”外，還具有Ag納米顆粒聚集在Ag納米棒之間形成的納米間隙提供的更多“熱點(diǎn)”，而“熱點(diǎn)”位置具有更強(qiáng)的表面等離子體共振效應(yīng)，“熱點(diǎn)”越多增強(qiáng)效應(yīng)越好，最終使得該基底的SERS活性增強(qiáng)最為顯著［19-20］。

圖10 不同基底的2D-FDTD模擬圖Fig．10 2D-FDTD simulation diagrams of different substrates

3 結(jié) 論

本研究成功制備了TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜及TiN-Ag@Ag溶膠3種復(fù)合基底，結(jié)果顯示納米Ag均勻分布在TiN表面，Ag和TiN之間存在共振耦合作用。利用UPS和FDTD對(duì)基底的增強(qiáng)機(jī)制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TiN-Ag@Ag溶膠基底的電場(chǎng)強(qiáng)度明顯比另外兩種基底更強(qiáng)，該基底除了具有TiN薄膜與Ag納米顆粒發(fā)生共振耦合作用明顯出現(xiàn)的“熱點(diǎn)”外，還具有因Ag納米顆粒聚集在Ag納米棒之間形成納米間隙而提供的更多“熱點(diǎn)”，而“熱點(diǎn)”位置具有更強(qiáng)的表面等離子體共振效應(yīng)，同時(shí)存在電荷轉(zhuǎn)移，使得SERS活性明顯提高。利用該復(fù)合基底對(duì)腺嘌呤溶液進(jìn)行SERS檢測(cè)，檢出限可達(dá)10-5mol∕L。