淺析食品微生物檢驗(yàn)樣品的采集和制備

王真禎

（南平市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建南平 353000）

食品微生物檢驗(yàn)主要是開(kāi)展樣品的采集、制備、檢驗(yàn)等工作，通過(guò)檢驗(yàn)分析出食品中的微生物或毒素，將其作為判定食品安全性的重要指標(biāo)。食品檢驗(yàn)樣品的采集與制備工作是微生物檢驗(yàn)的重要前提，對(duì)于檢驗(yàn)報(bào)告的出具以及檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義，因此做好檢驗(yàn)樣品的采集與制備工作尤為重要。

1 食品微生物檢驗(yàn)概述

食品微生物檢驗(yàn)可以有效防范人畜共患病的發(fā)生，是衡量食品是否符合食用標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)之一，也是判定食品能否食用的科學(xué)依據(jù)。通過(guò)食品微生物檢驗(yàn)，可判斷出食品的真實(shí)衛(wèi)生情況，能對(duì)食品的被污染程度做出合理的推斷。因此，嚴(yán)格控制食品微生物檢測(cè)各個(gè)環(huán)節(jié)，能夠顯著減少食品安全問(wèn)題，對(duì)食品安全、人類(lèi)健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展起著重要 作用。

2 食品微生物檢驗(yàn)樣品的采集工作要點(diǎn)

對(duì)食品微生物檢驗(yàn)樣品進(jìn)行采集，需要保證采樣的隨機(jī)性與代表性，通過(guò)微生物檢驗(yàn)分析產(chǎn)品質(zhì)量是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。因此，在樣品采集工作中，要選擇具有代表性的樣品，且取樣器件必須根據(jù)產(chǎn)品的類(lèi)型、狀態(tài)予以確定。

2.1 明確樣品采集要求

在開(kāi)展樣品采集工作前，需要明確采集要求，提前做好準(zhǔn)備，主要包括以下7點(diǎn)。①在提取樣品前需要先確認(rèn)貨和證完全符合。②取樣過(guò)程中應(yīng)避免水、空氣、光照等不良因素的影響，防止樣品受到污染。③樣品采集過(guò)程中使用的注射器、剪刀、采血管等均需經(jīng)過(guò)高溫殺菌處理，確保采樣過(guò)程中無(wú)任何污染。④通常采取隨機(jī)抽取方式采樣，如果對(duì)樣品存在微生物污染情況高度懷疑，可進(jìn)行集中采集。⑤樣品采集前后，在樣品容器上粘貼標(biāo)簽，標(biāo)明樣品的來(lái)源、名稱(chēng)、采樣時(shí)間和數(shù)量等詳細(xì)信息[1]。⑥樣品采集是微生物檢驗(yàn)工作中不可缺失的步驟，實(shí)驗(yàn)室必須提前保存記錄資料和程序操作，如樣品采集程序和取樣工作人員相關(guān)信息，甚至還要涵蓋設(shè)備、環(huán)境、采集地等信息。⑦完善樣品采集計(jì)劃，通過(guò)實(shí)施計(jì)劃促使樣品替代整個(gè)批次的產(chǎn)品，確保采集抽取機(jī)會(huì)一致。

2.2 科學(xué)確定采樣點(diǎn)

在食品微生物檢驗(yàn)樣品采集過(guò)程中，采樣點(diǎn)的確定會(huì)直接影響樣品采集質(zhì)量，因此對(duì)于采樣點(diǎn)的選擇要覆蓋食品生產(chǎn)到銷(xiāo)售的全過(guò)程，從而能夠通過(guò)檢驗(yàn)結(jié)果判定哪個(gè)環(huán)節(jié)導(dǎo)致食品出現(xiàn)微生物污染[2]。從當(dāng)前采樣工作情況來(lái)看，樣品采集點(diǎn)主要有如下3個(gè)。①食品原材料處。對(duì)食品原材料進(jìn)行采樣，常見(jiàn)的有原料、水、添加劑等。②食品生產(chǎn)線。對(duì)食品生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)開(kāi)展樣品采集工作，如半成品或原胚等，主要為了掌握食品生產(chǎn)中微生物的變化情況；③食品倉(cāng)儲(chǔ)。主要對(duì)食品存儲(chǔ)、運(yùn)輸環(huán)節(jié)中的微生物變化進(jìn)行采樣檢驗(yàn)。通過(guò)科學(xué)確定這3個(gè)采樣點(diǎn)，開(kāi)展針對(duì)性微生物樣品采集工作，能更精準(zhǔn)了解不同環(huán)節(jié)下的食品狀況，判斷引發(fā)微生物污染的具體環(huán)節(jié)。

2.3 合理應(yīng)用采樣方法

樣品采集方法需要結(jié)合食品類(lèi)型、狀態(tài)、有無(wú)外包裝等因素確定合理的采樣方法。從食品包裝來(lái)分，可分為以下兩種情況。①包裝食品采樣。針對(duì)開(kāi)袋即食型小包裝食品，為避免交叉污染，要盡量取原包裝，在檢驗(yàn)之前不能開(kāi)封；針對(duì)大包裝的液體食品，在采樣之前先混合，再用滅菌棒進(jìn)行混合均質(zhì)；針對(duì)大容器包裝的冷凍食品，則要對(duì)多部位實(shí)施無(wú)菌采樣，同時(shí)保證始終處于冷凍狀態(tài)。包裝食品的采樣要保證同一個(gè)批次和數(shù)量適中，且符合微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。②非包裝食品采樣。此類(lèi)食品涵蓋現(xiàn)場(chǎng)制作的散裝食品，具有一定特殊性，采樣時(shí)要保證及時(shí)性與針對(duì)性。具體來(lái)講要從多個(gè)部位實(shí)施無(wú)菌采樣，同時(shí)將各個(gè)樣品裝入不同容器中。針對(duì)散裝食品的采樣要遵循“三層五點(diǎn)”原則，即對(duì)表層、中層、下層的5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行采樣。對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中的食品要進(jìn)行檢驗(yàn)批次的合理劃分，分別進(jìn)行取樣[3]。從食品狀態(tài)來(lái)分，可分為以下兩種情況。①液態(tài)食品采樣。液態(tài)食品的采樣比較簡(jiǎn)單，通常采樣時(shí)只需進(jìn)行無(wú)菌混合，可連續(xù)或間歇攪拌，待勻質(zhì)后采樣即可。②固態(tài)食品采樣。魚(yú)肉類(lèi)食品要進(jìn)行內(nèi)外兩層采樣，其中內(nèi)層采樣要避免與表層出現(xiàn)交叉污染。對(duì)鮮肉要用滅菌工具采樣，冷凍食品無(wú)需解凍，直接用滅菌電鉆深層采樣。

2.4 包裝密封樣品

食品微生物檢驗(yàn)樣品采集完成后，要對(duì)其進(jìn)行完全密封的包裝處理，必須從采樣點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行封裝，直至送進(jìn)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室，且途中要盡可能避免無(wú)關(guān)人員與樣品接觸，提高樣品檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。通常會(huì)用專(zhuān)門(mén)的粘膠對(duì)樣品進(jìn)行密封包裝，放置在特定容器中保存好，做好詳細(xì)信息記錄。

3 食品微生物檢驗(yàn)樣品的制備工作要點(diǎn)

樣品制備是食品微生物檢驗(yàn)的重要工作，是獲得準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)。因此，制備處理過(guò)程一定要嚴(yán)格遵守制備要求和實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 液體樣品制備方法

對(duì)于液體樣品可充分搖動(dòng)液體，使樣品中的微生物分布均勻，然后用滅菌吸管提取25 mL液體樣品，與225 mL蒸餾水或生理鹽水混合，形成1∶10的樣品稀釋液。需要注意的是，吸管伸入樣品的深度不能大于2.5 cm。如果樣品已開(kāi)瓶或開(kāi)罐，必須做好表面的消毒工作，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作要求進(jìn)行操作。對(duì)于含有CO2的液體飲料先將樣品液體倒進(jìn)已經(jīng)殺菌完成的小瓶中，瓶口用滅菌紗布蓋住，輕微搖晃，等沒(méi)有氣體產(chǎn)生后再開(kāi)展檢驗(yàn)工作。酸性食品需用10%滅菌的NaCO3調(diào)節(jié)pH值至中性后才能開(kāi)展檢驗(yàn)。

3.2 半固體樣品制備方法

樣品無(wú)法用吸管直接吸取，可用滅菌容器稱(chēng)取樣品25 g，加入225 mL 45 ℃的滅菌生理鹽水或蒸餾水中，此類(lèi)樣品溶化后必須第一時(shí)間檢驗(yàn)。從樣品稀釋到接種，切記不能超過(guò)15 min。

3.3 固體食品樣品制備方法

固體食品的處理過(guò)程比較復(fù)雜，具體處理方法有如下4類(lèi)。①搗碎均質(zhì)法。將100 g或以上的樣品搗碎并混合均勻，從樣品中稱(chēng)取25 g投入裝有225 mL 稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)中，勻速混合1 min。此方法對(duì)大多數(shù)食品樣品有效。②剪碎振搖法。將100 g或以上的樣品剪碎并混合均勻，從樣品中稱(chēng)取25 g進(jìn)一步剪碎，放入帶有225 mL稀釋液和一定量玻璃珠（直徑為 5mm左右）的稀釋容器中，將瓶蓋封住，快速振搖60次。③研磨法。將100 g以上的樣品剪碎并混勻，稱(chēng)取25 g投入無(wú)菌缽中進(jìn)行充分研磨，研磨后放入帶有225 mL無(wú)菌稀釋液的稀釋瓶中，充分搖勻。④整粒振搖法。有自然保護(hù)膜的顆粒狀樣品，可直接稱(chēng)取25 g整粒樣品投入無(wú)菌稀釋瓶中，重復(fù)上述振搖操作[4]。

3.4 特殊樣品的制備方法

樣品制備對(duì)食品微生物檢驗(yàn)的結(jié)果精準(zhǔn)度有直接影響，由于一些食品本身的物化表現(xiàn)、對(duì)微生物的抑制作用、酸堿性等存在特殊性，因此對(duì)于食品微生物檢驗(yàn)樣品的制備方法要根據(jù)其特點(diǎn)進(jìn)行操作。①對(duì)于酸性或堿性的樣品，先將稀釋緩沖樣液的酸堿值調(diào)成中性。②對(duì)于大蒜、洋蔥等高抑制物質(zhì)或腌漬食品、酸堿性食品等，可采取緩沖蛋白胨水或其他稀釋液。③對(duì)于可可粉、奶粉等樣品，可適當(dāng)?shù)卣{(diào)整溫度和時(shí)間。④對(duì)于高脂肪樣品，可根據(jù)脂肪水平，在稀釋液中加入適量的聚山梨醇酯80，以促進(jìn)乳化。⑤對(duì)于冷凍樣品，置于實(shí)驗(yàn)室18～27 ℃ 溫度下，最多不超過(guò)3 h，在2 ℃左右不超過(guò)24 h。

3.5 樣品制備運(yùn)輸

食品微生物檢驗(yàn)樣品不能存放太久，且不同食品樣品對(duì)環(huán)境的要求也有顯著區(qū)別，因此在對(duì)樣品進(jìn)行制備的過(guò)程中，需要結(jié)合現(xiàn)實(shí)情況對(duì)環(huán)境合理把控。例如，若樣品容易變質(zhì)，工作人員需將其放置在干燥環(huán)境中，同時(shí)避免陽(yáng)光直射，溫度最好控制在-4～0 ℃，且盡快進(jìn)行檢驗(yàn)；若是貝類(lèi)食品，從樣品采集、運(yùn)輸、制備，再到最后的檢驗(yàn)工作環(huán)節(jié)，整個(gè)過(guò)程用時(shí)不能超過(guò)6 h；若是干制食品，工作人員要用塑料袋進(jìn)行密封保存，防止與空氣中的水分接觸，這類(lèi)食品應(yīng)當(dāng)在7 d內(nèi)完成檢驗(yàn)[5]。

4 樣品中微生物的檢驗(yàn)方法

食品微生物檢驗(yàn)方法多種多樣，不同被檢樣品適用于不同的方法原理，通過(guò)對(duì)不同的檢驗(yàn)方法進(jìn)行深刻了解，能夠?yàn)榫珳?zhǔn)檢驗(yàn)出食品微生物夯實(shí)基礎(chǔ)。微生物檢驗(yàn)方法有以下幾種。①抗體檢驗(yàn)。此方法應(yīng)用較為廣泛，在大量的抗體檢驗(yàn)方法中，最常見(jiàn)且應(yīng)用最便捷的是酶聯(lián)免疫吸附法。它主要是利用了酶聯(lián)免疫吸附方法對(duì)金黃色葡萄球菌的高敏感性，因此在金黃葡萄球菌這一微生物的檢驗(yàn)中得到大量應(yīng)用。②免疫技術(shù)檢驗(yàn)。該檢驗(yàn)方法主要利用了抗原、抗體之間的特定結(jié)合反應(yīng)，借助病原體的催化作用生成大量免疫球蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品微生物的檢測(cè)。該方法對(duì)肉毒梭菌、彎曲桿菌等病原菌的檢測(cè)有著良好效果。結(jié)合工作經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，免疫學(xué)技術(shù)法有精準(zhǔn)度高、操作便捷、無(wú)需分離樣品等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在假陽(yáng)性過(guò)多、靈敏度低等不足，因此在選擇此檢驗(yàn)方法時(shí)，需要根據(jù)實(shí)際情況合理確定。③電阻電導(dǎo)測(cè)定法。該方法主要是基于溶液導(dǎo)電率進(jìn)行測(cè)定，能夠有效檢驗(yàn)食品微生物的含量，利用蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等大分子物質(zhì)與氨基酸等小分子物質(zhì)存在導(dǎo)電度差異的特性，合理計(jì)算出微生物含量。④快速酶促反應(yīng)及代謝產(chǎn)物檢測(cè)法。其原理是利用細(xì)菌的高度繁殖過(guò)程產(chǎn)生的霉菌與指示劑反應(yīng)測(cè)定微生物的數(shù)量。⑤快速檢驗(yàn)法。此檢驗(yàn)方法大部分已經(jīng)商品化，常見(jiàn)的有染色成像計(jì)數(shù)法和ATP生物發(fā)光法。染色成像計(jì)數(shù)，即對(duì)細(xì)胞染色，測(cè)定樣品中的活菌數(shù)量，主要用到紫外線顯微鏡與熒光過(guò)濾膜，活細(xì)胞與死細(xì)胞分別呈現(xiàn)熒光橙和熒光綠。此方法的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)約0.5 h，如果樣品中的細(xì)菌數(shù)量太少，則要適量增加細(xì)菌數(shù)量。ATP生物發(fā)光法的原理是混合熒光素與ATP，將微生物的ATP轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庑盘?hào)，再根據(jù)熒光值判斷微生物數(shù)量。此檢測(cè)方法需 1.0 h左右，且如果微生物數(shù)量偏少，還要適量增加微生物。從效果來(lái)看，兩種方法只能對(duì)微生物數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法分辨微生物種類(lèi)。⑥分子生物法。該方法最常用的是核酸探針?lè)椒ǎ赐ǔＫf(shuō)的基因探針技術(shù)）以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)。其中，核酸探針?lè)椒ㄖ饕昧嘶蜃钚》肿用撗鹾颂擒账岱肿咏Y(jié)構(gòu)中堿基的特異性配對(duì)，用對(duì)應(yīng)細(xì)菌的已知DNA序列實(shí)施同位素標(biāo)記操作，添加至解旋過(guò)后的待測(cè)DNA樣品中，根據(jù)所得雙鏈DNA數(shù)量來(lái)判斷菌種數(shù)量和種類(lèi)，很好地解決了微生物檢測(cè)的特異性以及敏感性問(wèn)題[6]。

5 微生物檢驗(yàn)過(guò)程中存在的不足及完善對(duì)策

在樣品采集與制備過(guò)程中，存在樣品存放的環(huán)境和儀器設(shè)備監(jiān)管不到位，檢驗(yàn)樣品的采集不具有代表性，樣品制備的設(shè)備不夠完善，食品微生物采集、制備操作不夠規(guī)范等問(wèn)題。為了改善這些問(wèn)題，微生物檢驗(yàn)操作需要注意以下要點(diǎn)。

5.1 培養(yǎng)基質(zhì)量控制

加強(qiáng)樣品存放和檢驗(yàn)過(guò)程中的環(huán)境質(zhì)量控制，進(jìn)一步完善管理制度與規(guī)范實(shí)驗(yàn)流程，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化、科學(xué)化管理，以高質(zhì)量檢驗(yàn)活動(dòng)提高實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)水平。其中，需要重點(diǎn)關(guān)注培養(yǎng)基的質(zhì)量控制，培養(yǎng)基無(wú)法單獨(dú)開(kāi)展技術(shù)驗(yàn)證，而需要依據(jù)微生物實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)展開(kāi)評(píng)估，因此檢驗(yàn)單位必須參照《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展建設(shè)實(shí)驗(yàn)室的工作，且在日常檢驗(yàn)中嚴(yán)格遵守《微生物檢測(cè)理解與實(shí)施》中關(guān)于培養(yǎng)基的管理細(xì)則。對(duì)培養(yǎng)基的檢測(cè)可選用干熱加壓滅菌法，也可選用濕熱加壓滅菌法。

5.2 重視實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備的日常管理

在微生物檢驗(yàn)中，檢測(cè)設(shè)備最為關(guān)鍵，會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性造成直接影響。例如，在檢驗(yàn)易揮發(fā)的樣品時(shí)，可采用干冰冷凍粉碎機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行冷凍粉碎。無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室的換氣系統(tǒng)必須達(dá)到潔凈廠房的等級(jí)要求，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的墻壁、底板、天花板連接處必須帶有一定弧度，地面進(jìn)行防滑處理，保證儀器設(shè)備、桌椅設(shè)施的整潔度，避免實(shí)驗(yàn)人員和儀器設(shè)備、樣品等出現(xiàn)碰撞受損的情況。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有大量的設(shè)備設(shè)施，如水浴箱、培養(yǎng)箱、滅菌高壓鍋和滅菌箱等，都需要做好日常維護(hù)保養(yǎng)工作，定期進(jìn)行清潔與消毒，確保設(shè)備的性能完好。每一次維護(hù)保養(yǎng)都需要進(jìn)行調(diào)試記錄，并保存好相關(guān) 資料。

5.3 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)人員的培訓(xùn)和管理

實(shí)驗(yàn)人員是實(shí)驗(yàn)室作業(yè)中容易出現(xiàn)不規(guī)范操作的主要因素，為了規(guī)避實(shí)驗(yàn)人員采用不合理的操作方法，或是因?yàn)橹貜?fù)實(shí)驗(yàn)多次而對(duì)無(wú)菌操作觀念有所忽視，則一定要提高實(shí)驗(yàn)人員的能力和思想意識(shí)。食品微生物的檢驗(yàn)工作具有專(zhuān)業(yè)性、技術(shù)性特點(diǎn)，對(duì)從業(yè)者的專(zhuān)業(yè)素養(yǎng)要求非常高，可在單位內(nèi)部定期開(kāi)展技術(shù)人員培訓(xùn)工作，保證每一位實(shí)驗(yàn)人員均具備相應(yīng)資質(zhì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作規(guī)范進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)定，保證對(duì)樣品的收集、制備及實(shí)驗(yàn)操作均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。此外，非實(shí)驗(yàn)人員非必要不得進(jìn)入無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室，必須進(jìn)入時(shí)則要嚴(yán)格按照規(guī)定穿戴個(gè)體防護(hù)品。檢驗(yàn)單位應(yīng)當(dāng)在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室外設(shè)置醒目的警示標(biāo)志，用以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)意識(shí)。

5.4 加強(qiáng)無(wú)菌室管理

必須保證微生物檢驗(yàn)作業(yè)在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，確保所有設(shè)備設(shè)施、作業(yè)條件均達(dá)到檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，門(mén)窗、走廊、樣品區(qū)、管理區(qū)、清潔間等均需符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》規(guī)定的防護(hù)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)無(wú)菌室進(jìn)行日常消毒，用紫外線燈進(jìn)行照射滅菌，保證室內(nèi)干燥且清潔。在開(kāi)展檢驗(yàn)工作之前，應(yīng)當(dāng)選擇臭氧消毒法對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部空氣中的微生物進(jìn)行全面消殺，將無(wú)菌室封閉后，注入臭氧，濃度控制在 20 mg·m-3左右，靜置消殺35 min最優(yōu)，再進(jìn)行臭氧排放操作，濃度降至0.2 mg·m-3，隨后開(kāi)展食品微生物的室內(nèi)檢驗(yàn)工作。

6 結(jié)語(yǔ)

綜上，食品微生物檢驗(yàn)作為保障食品安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，且微生物污染有著廣泛性、隨機(jī)性的特點(diǎn)，因此對(duì)檢驗(yàn)工作要求較高。在食品微生物檢驗(yàn)中，樣品的采集與制備屬于必要工作，其規(guī)范程度直接關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)度，因此必須保證全程無(wú)菌操作，避免樣品被污染。樣品采集需保證代表性、時(shí)效性、完整性，樣品制備需要在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，防止出現(xiàn)污染和變質(zhì)。樣品采集與制備工作的規(guī)范性和精準(zhǔn)性是確保檢驗(yàn)結(jié)果客觀性、公正性的前提，可為實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供保障，提升食品檢驗(yàn)單位的權(quán)威性和專(zhuān)業(yè)性，為廣大消費(fèi)者的食品安全保駕 護(hù)航。