基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥的作用機制

趙家更，曾慶云，祝木星

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南 250355）

川芎-延胡索藥對選自曹貽訓(xùn)名老中醫(yī)治療腰椎間盤突出癥的經(jīng)典驗方“腎痹湯”，在曹老多年治療腰椎間盤突出的過程當中，發(fā)現(xiàn)其對腰椎間盤突出癥的療效顯著。方中延胡索能夠活血、行氣、止痛，川芎則在此基礎(chǔ)上具有祛風(fēng)除濕之效?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，川芎主要由揮發(fā)性油類、苯酞內(nèi)酯、有機酚酸和板栗多糖等物質(zhì)所構(gòu)成；到目前為止，川芎中共記載有149個化合物，其已報道的生物學(xué)活性主要涉及對心血管疾病的療效、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗炎和抗氧化等功能，對細胞發(fā)炎因子和凋亡因子的控制也是川芎中表達這些生物學(xué)活性物質(zhì)的主要機制[1]。延胡索所具有的各種化學(xué)成份在中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、消化吸收網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、人體心血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)和垂體腎上腺皮層網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中均能形成影響，從而起到鎮(zhèn)定、抗緊張、催眠現(xiàn)象、止痛、抗心律失常、耐潰瘍、抗缺氧性心肌等功效[2]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，藥物的配伍一般遵循君臣佐使等觀念，而現(xiàn)代藥理研究多關(guān)注于單個藥物或單個成分對于相關(guān)疾病或靶點的作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多層次、多角度網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的特點，通過分析川芎-延胡索藥對的有效成分和藥效靶點，進一步篩選并進行富集分析，為臨床研究和應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分的獲取與篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺數(shù)據(jù)庫，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）中輸入川芎、北紫堇等進行檢索，并以生物有效利用量（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的條件，篩選出潛在的生物活性成份。

1.2 潛在有效成分對應(yīng)靶點的獲取與整理 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中進一步檢測出川芎、北紫堇等潛在有效成分及其所對應(yīng)的靶位，并于Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php）中找到對應(yīng)的人類基因，將其導(dǎo)出至Excel以備后續(xù)進行數(shù)據(jù)處理。

1.3 腰椎間盤突出癥靶點獲取 登錄GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），并以Lumbar Disc Herniation、Lumbar Disc Protrusion、Lumbar Intervertebral Disc Protrusion和Prolapse of Lumbar Intervertebral Disc等關(guān)鍵詞進行搜索，以獲取有關(guān)腰椎間盤突出癥的各種關(guān)鍵靶點信息，并導(dǎo)出至Excel中，為后期數(shù)據(jù)處理做好準備。

1.4 繪制韋恩圖并獲取交集靶點 運用Venny網(wǎng)站，通過上傳川芎、北紫堇藥物相對的相互作用靶位和腰椎間盤突出癥的相關(guān)靶位，完成韋恩圖的描繪并獲得藥物和患者的交集靶位。

1.5 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape軟件對收集到的藥品潛在活性成份和藥品與患者的交叉靶位進行分類處理，形成藥品-成分-病變-靶點系絡(luò)圖。

1.6 富集分析利用David數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)（https://David.ncifcrf.gov/）對交集靶基因?qū)崿F(xiàn)go解析和KEGG解析。

2 結(jié)果

2.1 潛在有效成分篩選結(jié)果 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫進行搜索，并在以生物有效利用量（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的條件下進行篩選，川芎的化學(xué)成分組成中有7個潛在有效成分，延胡索有49個潛在有效成分，其中谷甾醇（sitosterol）是二者中共同的重復(fù)成份，故總共得到了55個潛在活性成份，即谷甾醇、槲皮素、大豆甾醇、黃連素、延胡索堿等，詳見表1。

表1 川芎-延胡索藥對的潛在有效成分

續(xù)表

2.2 藥物、疾病交集靶點篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共發(fā)現(xiàn)與川芎、北紫堇等潛在活性成份對應(yīng)的靶位共858個，將上述靶位信息輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫中可以找到相應(yīng)的人類基因；從GeneCards數(shù)據(jù)庫中，搜索得到的腰椎間盤突出癥相關(guān)靶位共396個，在利用Venny網(wǎng)站進行大數(shù)據(jù)分析之后，得出藥物與病變所共同的靶位共46個，并進行韋恩圖的繪制，見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點韋恩圖

2.3 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖繪制 將藥品活性成份和靶點網(wǎng)絡(luò)信息輸入Cytoscape軟件，得到構(gòu)成藥品-成份-病情-靶點的網(wǎng)路圖，見圖2。圖中節(jié)點分為病癥、藥品、藥品成份、靶位，連線說明了病癥、藥品、藥品成份和靶位之間所存在的交叉關(guān)聯(lián)（其中紅色六邊形代表病癥，綠色六邊形代表藥品，藍色六邊形代表藥品成份，黃色圓圈代表交集靶點）。此圖可以明確顯示川芎-延胡索藥對通過多種成分、多種靶點對腰椎間盤突出癥發(fā)揮治療作用，其中度值（Degree值及節(jié)點連線數(shù)量）最高的5種成分為：槲皮素、二氫血根堿、荷包牡丹堿、13-甲基棕櫚酸酯、Izoteolin，說明這些成分為川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥的主要成分。

圖2 藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO分析 將藥物與疾病交集靶點的相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫進行富集分析，以P Value≤0.05為條件篩選出靠前的分子功能、生物學(xué)過程及細胞組分，繪制成柱形圖，見圖3～圖5。其中BP分析（圖3）排名靠前的有核糖核酸聚合酶ii啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter，18個靶點，39.13%）、信號傳導(dǎo)（signal transduction，15個靶點，32.61%）、基因表達的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of gene expression，13個靶點，28.26%）、炎癥應(yīng)答（inflammatory response，13個靶點，28.26%）、細胞增殖的負調(diào)節(jié)（negative regulation of cell proliferation，13個靶點，28.26%）等生物學(xué)過程。MF分析（圖4）排名靠前的有蛋白活性（cytokine activity，39個靶點，84.78%）、酶 結(jié) 合（enzyme binding，10個 靶 點，21.74%）、蛋 白 結(jié) 合（protein binding，10個 靶 點，21.74%）、細胞因子活性（cytokine activity，9個靶點，19.57%）、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（7個靶點，15.22%）等分子功能。CC分析（圖5）中排名靠前的有細胞外空間（extracellular space，26個靶點，56.52%）、細胞外區(qū)域（extracellular region，22個靶點，47.82%）、細胞溶質(zhì)（cytosol，19個靶點，41.30%）、質(zhì)膜（plasma membrane，17個靶點，36.96%）、細胞外外體（extracellular exosome，13個靶點，28.26%）等細胞組分。

圖3 GO分析生物學(xué)過程

圖4 GO分析分子功能

圖5 GO分析細胞組分

2.5 KEGG通路分析 使用David數(shù)據(jù)庫對川芎-延胡索藥對與腰椎間盤突出癥的46個交集靶點進行分析，得到P Value≤0.05的通路共84個，篩選其P Value最小的10條通路制成表格，見表2。結(jié)果顯示，川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥的機制主要涉及腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、恰加斯?。–hagas disease）、癌癥通路（pathways in cancer）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis）、百日咳（pertussis）、膀胱癌（bladder cancer）、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、利什曼病（Leishmaniasis）、甲型流感（influenza A）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等通路。因此，推測川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥可能與上述通路關(guān)系密切。

表2 P Value最小的10條通路

3 討論

腰椎間盤突出癥是脊柱外科的常見病之一，近年久坐、缺乏鍛煉已成為現(xiàn)代人普遍的行為習(xí)慣，這也導(dǎo)致了腰椎間盤突出癥發(fā)病率日益增長，患病年齡也在不斷減小。腰椎間盤突出癥主要表現(xiàn)為腰痛、下肢麻木及放射痛、肌力下降、活動受限、感覺減退等,中醫(yī)學(xué)將其歸為“腰腿痛”范疇，主要治療大法為活血化瘀、行氣止痛、祛風(fēng)散寒、補益肝腎等。腎痹湯是曹貽訓(xùn)名老中醫(yī)的經(jīng)典驗方，由芥子、獨活、三七、川芎、延胡索、白術(shù)、穿山龍、黃芪、黨參、全蝎、地龍、桂枝、茯苓、牛膝、丹參、當歸、白芍、赤芍、續(xù)斷、杜仲、槲寄生、巴戟天、狗脊、葛根、木瓜、甘草等26味中藥組成。方中川芎、延胡索配伍發(fā)揮活血行氣、散瘀止痛的功效，在多年的臨床用藥中，通過加減化裁應(yīng)對不同腰椎間盤突出癥病例，配合其他藥物及鍛煉，在保守治療過程中療效顯著，但川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥的作用機制尚不明確。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從川芎-延胡索藥對中檢索出55個有效成分，對應(yīng)靶點858個，其中與腰椎間盤突出癥致病靶點重合者共46個。在Cytoscape軟件構(gòu)成的藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖中，共有101個節(jié)點、301個邊，證明川芎-延胡索從多個靶點、利用多種成分對腰椎間盤突出癥進行治療。延胡索中的槲皮素作用于40個靶點，在所有成分中排名第一。槲皮素是一種天然的黃酮類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗感染、免疫抑制、心血管保護和血糖調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3]。王業(yè)楊等[4]研究表明，槲皮素可以抑制TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡從而減輕脊髓損傷。盧桃利等[5]研究表明，槲皮素可以促進小鼠脊髓損傷后巨噬細胞表型由M1向M2表型轉(zhuǎn)變，抑制炎性因子的表達，對炎性反應(yīng)的調(diào)控是其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的可能機制之一。二氫血根堿存在于多種植物的提取物中，具有廣泛的藥理作用。張乙濤等[6]研究表明，血根堿（sanguinarine）作為一種苯菲啶異喹啉類生物堿，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、改善肝功能及誘導(dǎo)細胞凋亡等作用。馬寧寧等[7]研究表明，二氫血根堿通過作用于ERK2、IKKβ、JAK1、PKC，影響下游蛋白表達，阻礙抗炎信號的傳遞，從而發(fā)揮抗炎作用。荷包牡丹堿，別名山烏龜堿，具有陣痛、鎮(zhèn)靜等功效。郭錳等[8]研究表明，荷包牡丹堿可以抑制人肝癌MHCC97-H細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲，該作用與下調(diào)VEGF、MMP-2、MMP-9基因表達及抑制JAK2/STAT3信號通路的活化有關(guān)。汪詩卉等[9]研究表明，荷包牡丹堿在體外對胃癌細胞的增殖與生長具有抑制作用，可促進其凋亡，其作用可能與Bcl-2/Bax降低導(dǎo)致Caspase-3活化有關(guān)。劉巖等[10]研究表明，荷包牡丹堿能有效抑制人肺腺癌細胞A549的生長，使細胞周期阻滯在S期，進一步誘導(dǎo)其凋亡，并使caspase-3蛋白活化。由此可見，川芎-延胡索藥對中的槲皮素、二氫血根堿、荷包牡丹堿等有效成分，具有抗炎、抗氧化、改善肝功能、抗腫瘤等功效，可能是治療LDH的有效成分。

從藥物-疾病-活性成分-靶點圖上可知，前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、μ型阿片受體（OPRM1）、雄激素受體（AR）、鈉依賴性血清素轉(zhuǎn)運蛋白（SLC6A4）、雌激素受體蛋白（ESR1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2）、乙酰膽堿酯酶（ACHE）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、縫隙連接α-1蛋白（GJA1）、原癌基因c-Fos（FOS）等可能是川芎-延胡索治療LDH的主要靶蛋白。GO富集分析得出，川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥主要涉及核糖核酸聚合酶ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達的正向調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答、細胞增殖的負調(diào)節(jié)、凋亡過程的負調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)，DNA模板、血管生成、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、對脂多糖的細胞反應(yīng)等生物學(xué)過程；涉及蛋白質(zhì)異二聚活性、受體結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚活性、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、絲氨酸內(nèi)肽酶活性、細胞因子活性、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合等分子功能；涉及細胞外空間、細胞外區(qū)域、細胞溶質(zhì)、質(zhì)膜、細胞外外體、線粒體、薄膜筏、細胞表面、細胞質(zhì)核周區(qū)、神經(jīng)元投射等細胞組分，其過程較為復(fù)雜。

經(jīng)過KEGG富集分析得出，被明顯富集的信號通路共有10條。其中腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）可誘導(dǎo)多種細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，包括凋亡、細胞存活、炎癥和免疫。黃蓓等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TNF信號通路中的TNF-α不僅可以使其信號通路發(fā)生異常，還可以與其他促炎性細胞因子刺激破骨細胞分化和活化，而引起骨丟失，刺激滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產(chǎn)生降解軟骨的蛋白酶，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨的破壞。張丹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1在成血管-成骨耦連反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，作為上游基因調(diào)控著體內(nèi)多種成血管、成骨基因的表達，促進血管形成的同時，協(xié)同促進骨的再生。劉莉菲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α通過直接調(diào)節(jié)多種骨組織細胞、促進骨血管生成、改變糖酵解途徑等方式對骨組織的生長和重塑過程進行調(diào)控，從而對骨相關(guān)腫瘤、股骨頭壞死、HO等病理過程產(chǎn)生重要影響。此外，癌癥、恰加斯病、甲型流感等信號通路也富集了較多的基因，因此推斷川芎-延胡索藥對可能通過以上信號通路發(fā)揮治療腰椎間盤突出癥的作用。

綜上所述，川芎-延胡索在治療腰椎間盤突出癥上具有多成分、多靶點、多途徑的特點。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步預(yù)測了川芎-延胡索治療LDH的核心靶點，以期為進一步的分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。