利用微計算機斷層掃描技術重建褐飛虱內部結構

舒潤國，周行，曹子雄，賀康，李飛*

（1.浙江大學農業(yè)與生物技術學院昆蟲科學研究所，浙江省作物病蟲生物學重點實驗室，杭州 310058；2.Object Research Systems（ORS）公司，加拿大 蒙特利爾（魁北克）H3B 1A7）

微計算機斷層掃描技術（micro-computer tomography technology, Micro CT）是一種常用的非破壞性三維（three-dimensional, 3D）成像和分析技術[1]，其主要原理是由X 射線發(fā)生器發(fā)射X 射線穿透標本，置于另一端的探測器記錄該過程，生成射線照片[2]。Micro CT 作為一種成熟的成像方案，已被廣泛應用于科學研究的各個領域[3-5]。該技術的主要優(yōu)點是在維持物體原有形態(tài)的情況下，以低至幾百納米的分辨率對物體內部結構進行監(jiān)測。樣品完成掃描后，包含樣品空間結構的圖像數據集可以直接存儲，將樣品定格于掃描時的狀態(tài)。這種技術能以任何可能的角度研究樣品外部和內部結構的細節(jié)[6]。昆蟲體積小、外骨骼和內部結構精細，對其內部組織和器官進行解剖觀察時難以維持形態(tài)完整性。Micro CT 掃描結果具有高分辨率和無損的特點，可以在不同尺度上對昆蟲內部結構進行三維重建[7-9]，獲得傳統(tǒng)形態(tài)解剖或組織切片方法難以獲得的三維精細結構，以用于精細觀察昆蟲和比較分析昆蟲發(fā)育過程中內部形態(tài)的結構變化[10-11]。因此，Micro CT在昆蟲發(fā)育和內部形態(tài)觀察等領域的研究中具有不可替代的優(yōu)勢。

褐飛虱（brown planthopper, BPH），拉丁名為Nilaparvata lugens，是一種重要的半翅目飛虱科水稻害蟲[12]。其在我國廣泛分布，北起吉林、南至廣東[13]。2017—2021年間，褐飛虱在我國南方地區(qū)總體偏重發(fā)生。2022年預測的我國褐飛虱發(fā)生面積為1.5億畝次（1畝=667.6 m2）[14]。每年我國有約2 667萬hm2水稻田遭受褐飛虱蟲害，造成的直接和間接經濟損失超過百億元，對我國水稻生產造成嚴重危害，也嚴重影響了我國水稻產量[15]。

了解昆蟲內部組織和器官的結構是昆蟲發(fā)育和基因功能研究的重要基礎。利用冷凍電鏡（cryoelectron microscopy, Cryo-EM）能夠獲得昆蟲內部器官的立體模型，但樣本處理流程復雜、設備成本高昂。相較于冷凍電鏡，Micro CT 具有操作簡單、成本低的優(yōu)勢，能夠提供組織和器官水平的清晰成像?；诖?，本研究利用Micro CT觀察并重建了褐飛虱的內部結構，以期確定一種適用于昆蟲樣品的染色方法、樣本重建和建模流程，獲得褐飛虱消化、生殖、神經以及肌肉等多個不同組織和器官的立體三維模型，為昆蟲形態(tài)學和發(fā)育生物學的研究提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料與設備

1.1.1 供試蟲源

褐飛虱來源于浙江大學昆蟲基因組與生物信息學實驗室。用水稻幼苗飼喂。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（25±1）℃，相對濕度（60±10）%，光照周期16 h 光照/8 h 黑暗。羽化后3～5 d，挑取10 頭成蟲用于染色，根據預染結果選取染色效果最好的褐飛虱雌、雄蟲各1頭，用于后續(xù)掃描、3D重構和建模。

1.1.2 試劑和儀器

布因氏固定液，購自上海吉至生化科技有限公司；標準魯格氏染色液，購自上海源葉生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS），購自上海撫生實業(yè)有限公司。RH-24 搖床，購自美國康寧儀器公司；SkyScan 1272 高分辨率三維X 射線顯微鏡，購自德國布魯克公司，詳細參數見表1。

表1 SkyScan 1272 CMOS技術參數Table 1 SkyScan 1272 CMOS specifications

1.2 褐飛虱染色、掃描、重構流程

染色流程：使用二氧化碳（CO2）麻醉褐飛虱成蟲后，將其轉移至含有1 mL 0.5%Triton X-100 PBS（0.5%PBST）的1.5 mL 離心管中。蓋上試管蓋，于試驗臺上輕微敲打后孵育5 min，使褐飛虱成蟲下沉到離心管底部。采用1 mL 的布因氏溶液固定試蟲16～24 h，隨后在1 mL PBS 中清洗3 次，每次30 min。清洗完成后使用標準魯格氏染液染色，轉移到搖床上孵育5 d。然后將褐飛虱在PBS中清洗，并用PBS保存以供掃描分析。樣品制作完成后的1周內進行掃描[5]。

上樣裝置：將褐飛虱樣本置于PBS中掃描。將200 μL 黃槍頭尖端封口，注入PBS 后放入樣本，槍頭上部使用封口膜密封。以聚丙烯為原材料的槍頭壁薄（壁厚200～300 μm）且具有相對較低的X射線吸收，同時其錐形的設計使樣品能夠穩(wěn)定地保存。上樣裝置見圖1A。

掃描流程：使用安裝SkyScan 軟件（Micro CT，v1.2.0，德國布魯克公司）的戴爾工作站控制SkyScan 1272高分辨率三維X射線顯微鏡掃描樣品（圖1B～C）。X 射線源電壓和電流分別設置為50 kV、70 μA。用尺寸為1 632像素×1 092像素的傳感器，像素為7.4 μm、圖片分辨率為4.0 μm 的相機進行掃描，掃描時長為1 h：43 min：42 s。隨機移動算法參數值設為30，以糾正樣品旋轉過程中可能出現的晃動導致的圖像模糊。平均幀數設置為6，以增加信噪比。

圖1 Micro CT內、外部結構Fig.1 Internal and external structures of Micro CT

重構流程：重建數據借助NRecon 軟件（Micro CT，v1.2.0，德國布魯克公司）完成。Micro CT 數據的重建受采集圖像數據的影響，包括圖像亮度、對比度。在褐飛虱的重建過程中，使用默認的移位校正來補償掃描過程中的樣品移動（即熱波動或緩慢的樣品運動），環(huán)形偽影矯正和射線硬化補償設置為默認值。輸出圖像的位深為16 Bit。重建后的圖像尺寸為620×620×912（像素×像素×切片數），每個體素大小為4.0 μm。

1.3 Micro CT 圖像分析

在技嘉工作站［i9-11900 英特爾酷睿處理器，3.00 GHz（16 核），128 GB 內存，英偉達GeForce RTX 3070Ti 顯卡（8 GB 內存）］上運行Dragonfly 軟件［v2022.1，加拿大Object Research Systems（ORS）公司；http://www.theobjects.com/dragonfly］以進行圖像分割。圖像分割的基礎方法是使用3D畫筆手動將需要提取的結構標記為感興趣區(qū)域（region of interest,ROI）。為了消除分割過程中的人為偏差，可以使用包含大津算法的畫筆快速提取高密度的區(qū)域。最后將ROI 轉換為三角片網格（mesh）模型以進行定量分析和可視化。圖像分割過程中，可以適當使用Dragonfly 軟件內置的深度學習功能實現自動分割。

2 結果與分析

2.1 褐飛虱內部組織和器官的建模流程

褐飛虱Micro CT圖像建模的流程見圖2。使用SkyScan 1272軟件控制儀器進行測量規(guī)劃和數據采集，以得到褐飛虱投影圖。利用NRecon軟件將褐飛虱投影圖重建成切片圖像序列組成的數據體，隨后將褐飛虱數據體導入Dragonfly 軟件進行姿態(tài)矯正和有效信號放大。手動繪制部分目標區(qū)域，供軟件進行深度學習，通過分割預覽圖和Dice函數評估深度學習分割的準確度。依據深度學習分割的效果決定選擇深度學習分割還是手動分割，分割完成后進行手工修復以糾正深度學習分割或手動分割的錯誤，最終得到褐飛虱內部組織和器官的精確模型。

圖2 原始Micro CT圖像的三維建模流程Fig.2 3D reconstruction procedures of the original Micro CT images

2.1.1 原始數據預處理

受樣品自身姿態(tài)和上樣裝置的影響，樣品的XY平面與樣品Z軸會存在一定的傾斜，使得組織特征無法被明顯識別，影響后續(xù)分割的精準性。所以，對采集到的Micro CT原始數據進行姿態(tài)矯正是建模前原始數據預處理中不可或缺的一步。圖3A1～A3是未進行姿態(tài)矯正的原始Micro CT圖像，圖3B1～B3是進行姿態(tài)矯正后的Micro CT圖像，可以看出校正后的圖像中褐飛虱內部組織呈對稱分布，組織特征更為明顯。

圖3 樣本姿態(tài)矯正前（A1～A3）和姿態(tài)矯正后（B1～B3）的Micro CT圖像Fig.3 Micro CT images before sample position correction(A1-A3)and after sample position correction(B1-B3)

Micro CT利用不同組織對X射線吸收的差異，將組織的密度進行量化處理后轉化為閾值，并直接作為圖像灰度密度值輸出。切片圖像序列組成的數據體位深通常為8 Bit（256 個灰度級數）或者16 Bit（65 536個灰度級數）。位深越高，圖像所記錄的灰度級數就越高，包含的密度信息也就越多，更有利于圖像分割，因此本研究使用16 Bit 來保存重建后的切片圖像。在Dragonfly 軟件中進行深度學習圖像分割時，基于分割區(qū)域的有效灰度密度值通常僅占總灰度級數的一小部分，為充分利用灰度密度的動態(tài)范圍和提高深度學習模型對灰度數據的識別能力，需要對原始輸出圖像的灰度密度值采取進一步的歸一化處理。具體來說，本研究發(fā)現包含有褐飛虱組織的灰度密度值主要位于［0，20 000］這一灰度區(qū)間，因此先將數據體中灰度密度值超出20 000的值替換為20 000，再將替換后的數據體灰度密度值通過線性轉換使其范圍拉伸至［0，65 536］。從圖4 中可以看出，有效信號放大后的數據灰度密度直方圖（圖4B）相對于此前（圖4A）明顯向右拉伸，表明實際有效的數據所占據灰度密度更多。

圖4 有效信號放大前（A）和有效信號放大后（B）的灰度密度直方圖Fig.4 Gray density histograms before effective signal amplification(A)and after effective signal amplification(B)

2.1.2 深度學習模型的訓練和評估運用

深度學習是以不少于2個隱含層的神經網絡對輸入進行非線性變換或表示學習的技術。該技術通過構建深層神經網絡進行各項分析活動，被廣泛應用在圖像識別和語音識別中[16]。褐飛虱肌肉組織具有較好的對稱性，是較為合適的深度學習樣本。因此，以褐飛虱肌肉組織為例，使用Dragonfly 軟件進行深度學習模型的訓練，以通過少量切片上的標記得到一個可以自動分割本數據體中所有其他切片圖像的模型。使用畫筆創(chuàng)建繪制不同Z軸位置的X-Y平面褐飛虱肌肉組織的ROI，盡可能選取差異較大的圖片繪制ROI以作為輸入數據，為深度學習模型訓練提供更多的信息。輸入的訓練數據如圖5 和表2所示，沿Z軸方向選取5張代表性切片，目標ROI使用綠色標記，剩余區(qū)域為背景ROI，使用紫色標記。

表2 訓練數據相關的體素信息Table 2 Voxel information related to training data

圖5 訓練數據的相關位置信息Fig.5 Related position information of training data

利用模型生成器生成深度學習模型，模型架構為U-N，把同一數據體中與標記切片相鄰的若干張切片同時作為模型輸入（即Dragonfly 軟件中的2.5D 維度），相鄰切片圖像設置為3，深度學習模型訓練參數設置見表3。使用Dragonfly 軟件的智能分割向導工具（Segmentation Wizard）時，所有手動標記的訓練數據會被分為訓練集、驗證集、測試集3個部分，訓練集用于深度學習模型的直接訓練，驗證集用于對模型進行調控以減少過擬合[17]，測試集用于對訓練完的模型進行評分（測試集數據完全不參與模型訓練）。輸入的5 個樣本被軟件劃分為41個可用圖像塊（Patch），其中32 個用于訓練，7 個用于驗證，2個用于測試。為了增加訓練數據量，軟件使用數據增強功能對原始訓練集進行翻轉、旋轉和扭曲等變形處理以擴充Patch數和提高模型的泛化性。在執(zhí)行移動步長（stride ratio）=0.25以及圖像個數增加20 倍之后，實際用于訓練模型的訓練集Patch數目達到6 321個。

表3 深度學習模型訓練參數Table 3 Training parameters of deep learning model

用訓練集損失值和驗證集損失值繪制損失函數曲線以評估深度學習訓練網絡的動態(tài)趨勢，結果如圖6 所示。當循環(huán)次數為1～20 時，隨著訓練循環(huán)次數的增加，訓練集損失值和驗證集損失值整體呈下降趨勢，表明深度學習訓練網絡正常。在循環(huán)次數達到20以后，訓練集損失值和驗證集損失值趨于穩(wěn)定，代表深度學習訓練網絡達到優(yōu)化瓶頸（圖6A）。為了得到直觀的訓練網絡展示效果，可在Dragonfly軟件中選取一張圖片作為“視覺監(jiān)控”（監(jiān)控圖片無需手工標記），每次循環(huán)后深度學習模型會基于訓練結果對該圖片進行預測，直接展現深度學習模型訓練后的分割效果。監(jiān)控圖結果如圖6B 所示，C0 圖中紅色標注為人工繪制的目標區(qū)域，C1～C30代表循環(huán)第1—30次后深度學習模型識別目標區(qū)域的效果。

深度學習模型最初完全無法識別出目標ROI（綠色），隨著訓練次數的增加，識別的精度逐步提高。當循環(huán)次數達到25時，通過監(jiān)控圖可以看出深度學習的結果和手動分割的結果相當接近，代表此時的模型已經可以用于下一步的分割（圖6B）。終止學習后，軟件會自動對訓練后的深度學習模型在測試集上計算Dice分數作為評分，此模型評分結果為0.96（滿分為1）。將該模型應用于褐飛虱數據體輸出深度學習提取的褐飛虱肌肉ROI（圖7）。需要注意的是，本案例中深度學習模型只在這一個數據體的少量切片上進行訓練從而提取這一個組織結構，因此該模型只能用于本數據體對應組織的分割，不具有更高的泛化性。更改輸入數據（如其他昆蟲的數據體）或更改分割組織（例如中樞神經系統(tǒng)），都需要重新進行深度學習模型的訓練。此外，利用深度學習分割的方法并不一定適用于所有組織，對于某些組織來說，花費在訓練高性能模型所需的時間成本可能超過直接對完整數據體進行人工分割。因此，在深度學習訓練分割不能快速達到理想效果時，我們轉為基于畫筆、輪廓線、插值等傳統(tǒng)方法的手動分割。

圖6 深度學習模型對應的損失函數曲線（A）和監(jiān)控圖（B）Fig.6 Loss function curve(A)and monitoring pictures(B)of deep learning model

2.1.3 手工修復與立體模型優(yōu)化

深度學習的運用簡化了煩瑣耗時的ROI提取過程，但其最終的輸出結果仍會存在部分偏差，例如缺失標記和多余標記。人工分割也會存在繪制時的筆誤。因此，為進一步提高ROI模型的精確性，深度學習分割或人工分割的結果都需要進行手工修復，即使用3D 畫筆填補ROI 缺失部分，擦除多余部分；使用Dragonfly 軟件中的ROI 修復程序過濾掉小體積的孤島ROI，利用平滑算法優(yōu)化ROI，最后將ROI導出為網格（mesh）。各個階段產生的結果如圖7所示，從左到右依次為深度學習模型分割的肌肉ROI（綠色）、經過手工修復的ROI（紫色）、平滑后的ROI（橙色）和最終的肌肉網格（mesh）模型（黃褐色）。

圖7 手工修復與立體模型優(yōu)化階段的肌肉模型輸出結果Fig.7 Muscle model output results from manual repair and stereological model optimizing stages

2.2 褐飛虱三維模型

依據上述分割流程，重建了褐飛虱體內的中樞神經系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)（圖8）。其中，中樞神經系統(tǒng)、消化道和生殖系統(tǒng)利用深度學習模型未能得到很好的分割效果，故以人工方式進行分割。肌肉組織則采用訓練好的深度學習模型進行分割。將深度學習分割和人工分割的結果經人工矯正和立體模型優(yōu)化后，得到了褐飛虱的中樞神經系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)的網格模型，并制作展示視頻（圖8中二維碼）。

在褐飛虱中樞神經系統(tǒng)中，其頭部復眼視葉、大腦的立體結構層次分明，咽腹側感覺中樞通過凸緣與大腦相連。前胸神經節(jié)、中胸神經節(jié)和后胸神經節(jié)組成的胸神經節(jié)凸起明顯。肌肉組織占據了胸節(jié)的主要空間，是褐飛虱運動和飛行的結構基礎。不同肌肉的形態(tài)以及在體內的傾斜角度差異明顯，以特定的模式排列于胸節(jié)內。食道、中腸和后腸依次相接，馬氏管以一定角度環(huán)繞于中腸后端，組成消化道。褐飛虱雄性生殖系統(tǒng)模型內，精巢和輸精管堆疊于附腺上方，射精管從中伸出。褐飛虱雌性生殖系統(tǒng)模型內，卵巢中可見發(fā)育時期不同的卵，側輸卵管位于卵巢的下方，向前匯聚與中輸卵管相連（圖8）。在得到不同組織和器官的三維模型后，利用Dragonfly軟件的測量功能統(tǒng)計模型對應的體積，結果見表4。需要指出的是，本測量結果僅反映單個褐飛虱樣本的情況，不具有普遍性。

表4 褐飛虱三維模型結構的體積Table 4 Volumes of structures of 3D model of BPH

圖8 褐飛虱內部結構三維模型Fig.8 3D model of internal structures of BPH

2.3 三維重構系統(tǒng)的成本與參數比較

利用德國布魯克公司的商業(yè)SkyScan 1272 Micro CT系統(tǒng)以及加拿大ORS公司的Dragonfly軟件，能夠實現以最低4.0 μm的像素分辨率對褐飛虱昆蟲內部結構進行分析。對其相關成本進行統(tǒng)計估算，并基于冷凍電鏡構建褐飛虱模型的成本[18]，對不同重構系統(tǒng)的成本進行比較，結果如表5 所示。從中可知：基于Micro CT的三維重構系統(tǒng)的搭建費用為300 多萬元，遠低于基于冷凍電鏡的三維重構系統(tǒng)所需的1 000 多萬元。此外，由于冷凍電鏡對樣品的處理有著特殊要求，還需要采購特殊的樣品處理裝置（如臨界點干燥儀和超薄冷凍切片機）來處理樣本，這進一步增加了使用成本。但是，基于Micro CT 的褐飛虱三維重構系統(tǒng)在精度上最高僅能達到4.0 μm，與冷凍電鏡的50 nm有著較大差距。以浙江大學儀器共享服務平臺公布的信息為參考，兩者使用過程中均按照掃描時間計費，使用Micro CT 為600 元/h，冷凍電鏡為900 元/h。本研究掃描的褐飛虱，其單個樣品掃描成本約為1 000 元。因此，基于冷凍電鏡的褐飛虱三維重構的單個樣本實際掃描成本為10萬～20萬元（表5）。由此可得，當研究的尺度位于微米水平時，Micro CT是更為經濟便利的成像方案。

3 討論

作為一種非侵入性成像技術，Micro CT 在材料、生物和醫(yī)學領域得到了廣泛應用。褐飛虱是一種重要的農業(yè)害蟲，其內部生理結構與之危害性密切相關。因此，系統(tǒng)揭示褐飛虱內部生理結構將有助于揭示該物種深層次的危害機制。但采用傳統(tǒng)的解剖學方法將組織從昆蟲體內分離的同時，也破壞了組織在個體背景下的分布情況。2021 年，WANG 等[18]利用大尺度三維電鏡技術重構出稻飛虱納米級分辨率的三維結構，發(fā)布了首個納米級的褐飛虱三維結構模型，為褐飛虱形態(tài)觀察提供了新的方式。但冷凍電鏡設備高昂的成本和樣品處理的復雜性，使得研究者很難將該技術廣泛用于褐飛虱研究結果的展示。由此，本研究以Micro CT為基礎，構建了一套適用于褐飛虱的三維模型重構流程，以相對較低的成本完成了包括褐飛虱中樞神經系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)在內的立體模型構建。同時，該研究也為利用Micro CT構建其他昆蟲立體模型提供了參考。

相較于傳統(tǒng)的解剖學，Micro CT的主要優(yōu)勢是能夠獲得精確的形態(tài)信息，進而方便研究者了解昆蟲內部組織和器官的正確分布位置和不同組織之間的相對位置關系。結果表明，通過合適的染色方法和組織建模流程，無需花費大量的時間和精力對昆蟲進行解剖，就可以獲得清晰的昆蟲組織結構，并從中獲得組織和器官的形態(tài)學信息。

本研究中的建模流程包括原始數據預處理，深度學習模型的訓練和評估運用，人工分割、矯正與立體模型優(yōu)化三大部分。經過處理后的原始數據，其信息準確度和豐度明顯提升，預處理后的圖像不僅有助于人工識別目標組織，也有助于深度學習模型提高識別的精確性。傳統(tǒng)的Micro CT模型構建，需要手工繪制幾百張平面圖堆疊得到三維模型，而深度學習只需要輸入幾張人工繪制的樣本，經過模型訓練和應用之后就能得到近似人工分割的結果。在訓練維度的選擇上，使用了2.5D 維度，將當前圖像的前后相鄰圖像也納入訓練范圍，增加了立體維度的數據，為深度學習增加了更多的樣本量。當訓練的結果達到預期時，即可終止訓練。深度學習雖然能實現自動化的分割，但受圖片質量、訓練次數和訓練樣本量等多種因素的影響，很難達到100%的精確度，因此本研究加入了人工糾錯的環(huán)節(jié)，對深度學習分割的ROI 進行最后校正。需要指出的是，以目前的技術水平，深度學習分割并不能完全適用于所有的組織。對于一些不規(guī)則或者無明顯特征的組織，有時經過長時間的深度學習訓練也很難達到可用的分割效果。以消化道為例，其在褐飛虱體內并不如肌肉一樣呈對稱分布，而是盤曲環(huán)繞在腹部，對此深度學習分割難以取得較好的分割效果。相較于花費較長時間去調整參數訓練深度學習模型，采用傳統(tǒng)的人工分割時間成本更低。但進行分割時，推薦先使用深度學習進行嘗試，最后考慮人工分割方案。

依據此建模流程，重構了褐飛虱中樞神經系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)的立體模型。與常規(guī)解剖相比，本研究建立的模型更為精確地展現了褐飛虱體內的三維結構，也保留了這些組織和器官的原始狀態(tài)。同時，這些模型還可用于空間體積和長度的定量分析，精準記錄褐飛虱生長發(fā)育中組織和器官的變化過程。

4 結論

本研究提出了一種基于Micro CT 的褐飛虱內部模型重構流程。基于該流程完成了褐飛虱體內中樞神經系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)立體模型的構建。研究結果表明，Micro CT可用于褐飛虱組織和器官級別的全背景成像，提供精確的三維形態(tài)分析，為褐飛虱的表型研究提供了一種行之有效的新方法。此方法還可以與基因突變研究結合，進行精準的形態(tài)變化的定量分析，為褐飛虱的發(fā)育提供更為豐富的信息。此外，基于全背景成像的特點，首先可以用該方法系統(tǒng)評估發(fā)育缺陷，然后使用高分辨率顯微鏡顯示特定發(fā)育缺陷，實現類似光電聯(lián)用顯微技術的效果。

致謝浙江大學農生環(huán)測試中心理化分析室的杏朝剛老師在樣本掃描方面給予了寶貴的協(xié)助和指導，特此感謝！