昆蟲熱激轉(zhuǎn)錄因子的研究進展

張超，王妮，施哲逸，陳敏，周文武，周瀛，祝增榮*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院昆蟲科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點實驗室，杭州 310058；2.浙江大學(xué)海南研究院，海南 三亞 572025）

全球氣候變化導(dǎo)致極端溫度事件的發(fā)生頻率大幅增加，并且伴隨持續(xù)增長的趨勢[1-2]。面對復(fù)雜多變的環(huán)境，昆蟲演化出了維持細胞和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的能力來增強它們在環(huán)境脅迫下的適應(yīng)性。昆蟲應(yīng)對環(huán)境脅迫的策略之一是對熱激蛋白（heat shock protein,HSP）的合成調(diào)控[1]。熱激蛋白也稱應(yīng)激蛋白或分子伴侶，根據(jù)分子量大小和氨基酸序列差異，昆蟲熱激蛋白主要分為4個家族：小熱激蛋白（small HSP, sHSP）、HSP60、HSP70 和HSP90[3]。當昆蟲暴露于熱、冷、擁擠和缺氧等脅迫環(huán)境時，大多數(shù)蛋白的合成減少，但熱激蛋白合成反而增加，它們可促使相關(guān)蛋白進行重折疊、分配、運輸和降解，進而維持細胞的正常功能[3]。熱激蛋白的轉(zhuǎn)錄激活通常由熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factor, HSF）控制。作為一種在生物應(yīng)激時被激活的轉(zhuǎn)錄因子，HSF在酵母、擬南芥、果蠅、魚、雞、小鼠和人類等生物體內(nèi)普遍存在。雖然HSF在植物和哺乳動物中數(shù)量眾多，但在許多昆蟲中目前只發(fā)現(xiàn)了HSF的單個基因。本文對昆蟲HSF的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程以及功能進行了概述，并對未來的研究方向提出了展望。

1 昆蟲HSF 的基本結(jié)構(gòu)

在哺乳動物中，HSF 家族至少有7 個成員：HSF1～HSF5、HSFX 和HSFY，其中HSF1 是主要的調(diào)節(jié)因子[4]。在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）體內(nèi)只有1 個HSF，其結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動物的HSF1 類似[5]。生物體轉(zhuǎn)錄因子的功能主要由其結(jié)構(gòu)特征決定，昆蟲HSF 包含4 個保守的結(jié)構(gòu)域：DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain, DBD）、七肽重復(fù)區(qū)域A/B（heptad repeat regions A and B,HRA/B）、C 末端的七肽重復(fù)區(qū)域（heptad repeat region of C end,HR-C）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transactivation domain,TAD）（圖1）。

圖1 昆蟲熱激轉(zhuǎn)錄因子的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 General structure of HSF in insects

DBD結(jié)構(gòu)域位于HSF蛋白的N端，其內(nèi)部結(jié)合域疏水中心存在1 個“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”（helixturn-helix）的疏水結(jié)構(gòu)[6]。由于該結(jié)構(gòu)域在不同物種間高度保守，因此也被認為是HSF 的特征結(jié)構(gòu)域。與其他轉(zhuǎn)錄因子不同，雖然HSF 的“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”結(jié)構(gòu)不與DNA直接接觸[7]，但是HSF的這個特征結(jié)構(gòu)可以通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用來介導(dǎo)HSF 三聚體的形成和支持DNA 結(jié)合能力的獲得[8-9]。HR-A/B結(jié)構(gòu)域位于DBD的下游，該結(jié)構(gòu)域由2個七肽疏水的重復(fù)序列A和B組成。該結(jié)構(gòu)域具有分子間疏水作用，可促使3 個HSF 單體形成一種細長、平行的具有DNA結(jié)合活性的同源三聚體結(jié)構(gòu)[10]。HR-C 結(jié)構(gòu)域位于C 末端，該結(jié)構(gòu)域在脊椎動物和昆蟲的HSF中非常保守。有研究表明，HR-C 結(jié)構(gòu)域可與HR-A/B 結(jié)構(gòu)域作用，進而抑制HSF形成同源三聚體[11]。TAD結(jié)構(gòu)域位于HR-C結(jié)構(gòu)域的下游，即C 末端，是HSF 最不保守的區(qū)域。目前，對HSF 的C 末端區(qū)域結(jié)構(gòu)知之甚少，但比較明確的是C 末端區(qū)域促進了下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，且調(diào)節(jié)了HSF轉(zhuǎn)錄激活的強度[12]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，HSP70 可以與HSF 的TAD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進而解除HSF的三聚體形態(tài)[13]，這暗示著TAD結(jié)構(gòu)域可能在HSF 單體和三聚體形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中具有特殊功能。

2 昆蟲HSF 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

轉(zhuǎn)錄是蛋白質(zhì)合成的第一步，HSF 對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對其表達至關(guān)重要。以下主要從HSF 的三聚體化、HSF的核定位、HSF的磷酸化以及熱激蛋白對HSF的反饋調(diào)節(jié)4個方面闡述昆蟲HSF對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

2.1 HSF 的三聚體化

昆蟲HSF在正常條件下以無活性的單體形態(tài)存在，當受到脅迫時，HSF活化，并由單體轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘耐慈垠w形態(tài)[14]。因此，HSF由單體向同源三聚體形態(tài)的轉(zhuǎn)變是HSF活化的前提[15]。昆蟲HSF的激活和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的簡化模型如圖2所示。當應(yīng)激發(fā)生時，昆蟲細胞的pH 值降低，這能促使單體的HSF易位到細胞核中，并轉(zhuǎn)變?yōu)槿垠w形態(tài)結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)保守的反向重復(fù)序列——熱激元件（heat shock element,HSE）nGAAn（n代表任意核苷酸）上，進而調(diào)控靶基因的表達[16-17]。由于HSF 同源三聚體的每個DBD都要結(jié)合1個nGAAn序列，故HSF與熱激元件的穩(wěn)定結(jié)合需要3個具有交替取向的nGAAn序列，即GAAnnTTCnnGAA[18-19]。研究表明，HSF 和HSE 的結(jié)合能力會受到熱激蛋白基因啟動子和轉(zhuǎn)錄區(qū)的乙?；降挠绊懀敳捎媒M蛋白去乙?；敢种苿╋曃构墪r，熱激蛋白基因啟動子和轉(zhuǎn)錄區(qū)的乙?；教岣?，HSF 與HSE 的結(jié)合能力增強[20]。此外，應(yīng)激開始時，昆蟲HSF 與HSE 的結(jié)合十分迅速，果蠅DmHSF與DmHSP70啟動子的結(jié)合在應(yīng)激發(fā)生后幾秒鐘內(nèi)即可被檢測到，并且啟動子上DmHSF 分子數(shù)在約1 min 時即可達到飽和狀態(tài)[21]。應(yīng)激結(jié)束后，昆蟲細胞即恢復(fù)到正常狀態(tài)，HSF 則又從同源三聚體形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的單體形態(tài)[22]。

圖2 昆蟲熱激轉(zhuǎn)錄因子的激活和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的簡化模型Fig.2 Simplified model for activation and transcriptional regulation of HSF in insects

2.2 HSF 的核定位

HSF 核定位信號（nuclear localization signal,NLS）區(qū)域的活化是HSF 進入細胞核行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，在人類Hela 細胞中，在無脅迫時HSF1分散在細胞質(zhì)中，在應(yīng)激時HSF1則主要分布在細胞核中[23]。HSF1 從細胞質(zhì)向細胞核的轉(zhuǎn)移和形態(tài)轉(zhuǎn)變的激活，則依賴于NLS對核區(qū)的定位。然而，在果蠅SL2 細胞中，突變果蠅DmHSF的NLS區(qū)域后，在熱激狀態(tài)下DmHSF可以在細胞質(zhì)中三聚體化并和DNA結(jié)合；而當細胞從熱激恢復(fù)到正常條件下時，HSF的三聚體形態(tài)在細胞質(zhì)中也能夠可逆地轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w形態(tài)[24-25]。這意味著對于昆蟲而言，在細胞核和細胞質(zhì)中均可發(fā)生HSF形態(tài)的轉(zhuǎn)變。

2.3 HSF 的磷酸化

一般認為，HSF的磷酸化對HSF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性以及HSF 與HSE 的結(jié)合至關(guān)重要[14]。在應(yīng)激發(fā)生時，HSF 上的多個位點被磷酸化，隨后HSF 才具有轉(zhuǎn)錄活化的功能[26]。然而，研究發(fā)現(xiàn)果蠅的DmHSF 磷酸化水平在熱激前后保持不變，而且DmHSF磷酸化與否對其DNA結(jié)合活性及形態(tài)轉(zhuǎn)變沒有影響[27]。因此，昆蟲HSF 磷酸化是否有其他特定的功能，尚待進一步研究。

2.4 熱激蛋白對HSF 的反饋調(diào)節(jié)

盡管激活HSF的各類環(huán)境信號存在性質(zhì)上的不同，但它們在分子調(diào)控水平具有相似性，因為它們通常會導(dǎo)致細胞中異常蛋白增加，進而細胞需要合成更多的熱激蛋白作為分子伴侶來結(jié)合異常蛋白，以維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。熱激蛋白含量為熱激蛋白基因的表達效率提供了一個有效的參考點——當熱激蛋白含量足夠時，HSF 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性會受到抑制，進而抑制熱激蛋白基因的表達。在果蠅中，DmHSP70基因過量表達可抑制其他熱激蛋白的表達，而過低表達則可誘導(dǎo)DmHSP70基因和其他熱激蛋白基因的快速表達，這表明DmHSP70 是DmHSF 的負調(diào)控因子[28]。此外，MARCHLER 等[29]在酵母雙雜交實驗中也發(fā)現(xiàn)，DROJ1（人類HSP40/HDJ1 在果蠅中的同源物）可以和DmHSF 相互作用，并最終證實了DROJ1 與DmHSP70/DmHSC70和DmHSP90 之間通過協(xié)同作用來抑制DmHSF 的活性。然而，熱激蛋白并非都充當HSF的負調(diào)控因子，有些熱激蛋白也可以正調(diào)控HSF 的表達，如干擾蓮草直胸跳甲（Agasieles hygrophila）的AhHSP70或AhHSP21基因表達后，均會導(dǎo)致AhHSF基因的表達量降低[30]。

3 昆蟲HSF 的主要功能

早在1990年，模式昆蟲黑腹果蠅的HSF就已經(jīng)被鑒定[31]。隨后，果蠅HSF 的功能也逐漸被揭示。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)、基因組測序技術(shù)和基因編輯技術(shù)的發(fā)展，多種昆蟲的HSF得到鑒定。盡管在眾多昆蟲中只有單個HSF，但其功能具有多樣性。已鑒定的昆蟲HSF 及其功能如表1所示。

表1 已鑒定的昆蟲熱激轉(zhuǎn)錄因子及其功能Table 1 Identified HSFs in insects and their biological functions

3.1 響應(yīng)溫度脅迫

昆蟲是變溫動物，其生長發(fā)育極易受環(huán)境溫度的影響。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲的HSF在響應(yīng)溫度脅迫中至關(guān)重要。一般認為，昆蟲在受到溫度脅迫后會激活HSF，進而誘導(dǎo)熱激蛋白的表達。如二化螟盤絨繭蜂（Cotesia chilonis）暴露在36 ℃高溫或6 ℃低溫條件下，CcHSF和CcHSP11.0基因的表達均會明顯上調(diào)[33]。也有研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有的熱激反應(yīng)都遵循這個規(guī)律，如三葉草斑潛蠅（Liriomyza trifolii）在受到高溫脅迫時，體內(nèi)LtHSF基因的轉(zhuǎn)錄水平反而降低[41]；不同地理種群的蓮草直胸跳甲遭受高溫時，HSF 的表達趨勢也體現(xiàn)出差異，其中湖南蓮草直胸跳甲種群AhHSF基因的表達量顯著降低，而海南蓮草直胸跳甲種群AhHSF基因的表達量則顯著提高[32]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，HSF 在遭受溫度脅迫時表達趨勢的不同可能與其復(fù)雜的可變剪切有關(guān)。例如，果蠅HSF 存在4 條不同的可變剪接體（DmHSF-A、DmHSF-B、DmHSF-C、DmHSF-D），其中DmHSF-B 在37 ℃高溫脅迫下表達量顯著升高，DmHSF-D在4 ℃低溫脅迫下表達量顯著升高，而DmHSF-A、DmHSF-C 以及DmHSF 總表達量均沒有顯著變化[5]。可變剪接體的表達模式對同一脅迫產(chǎn)生不同響應(yīng)的現(xiàn)象，暗示著HSF不同的可變剪接體在應(yīng)激時可能發(fā)揮不同的功能，這一機制有待深入研究。

3.2 參與調(diào)控昆蟲的發(fā)育和生殖

除了參與昆蟲對溫度脅迫的應(yīng)答之外，HSF 還參與調(diào)控昆蟲的發(fā)育和生殖過程。例如，果蠅DmHSF基因的突變會導(dǎo)致幼蟲發(fā)育停滯和死亡，而且使DmHSF突變果蠅的卵細胞形成過程受阻，但是DmHSF 突變果蠅和野生型果蠅的熱激蛋白的表達水平?jīng)]有顯著差異，因此DmHSF可能通過非熱激蛋白途徑來調(diào)節(jié)卵細胞的發(fā)生[46]。KUCHAR 等也發(fā)現(xiàn)，發(fā)育相關(guān)基因even-skipped的增強子上含有幾個潛在的DmHSF結(jié)合位點，并證實了在果蠅胚胎發(fā)育過程中DmHSF能夠調(diào)節(jié)even-skipped基因的表達[45]。此外，調(diào)節(jié)DmHSF也能影響衰老，如降低DmHSF的活性會加速組織老化，縮短果蠅壽命；相反，過表達DmHSF則會延長果蠅的壽命[48]。JIN等在利用注射雙鏈RNA（double-stranded RNA,dsRNA）的方法沉默AhHSF基因表達后，蓮草直胸跳甲的存活率和產(chǎn)卵量均顯著降低[30]，也進一步證實了HSF 對昆蟲的發(fā)育和生殖過程至關(guān)重要。

3.3 參與昆蟲滯育

昆蟲滯育是受光周期、溫度和食物等多種外界環(huán)境因素影響的生物學(xué)過程，對延續(xù)昆蟲種群具有重要意義。目前，昆蟲滯育的具體機制還有待深入研究，但熱激蛋白參與調(diào)控昆蟲胚胎、幼蟲、蛹和成蟲滯育已在一些研究中得到證實[3]。如SIRIGINEEDI 等通過比較家蠶（Bombyx mori）的滯育卵和非滯育卵中熱激蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，前者中BmHSP70基因的表達水平顯著高于后者，推測BmHSP70基因在家蠶卵的滯育誘導(dǎo)中發(fā)揮作用[49]。作為熱激蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，HSF 能夠通過特異性識別并結(jié)合熱激蛋白基因啟動子區(qū)的HSE，從而調(diào)控?zé)峒さ鞍谆虻霓D(zhuǎn)錄和表達。KIHARA等發(fā)現(xiàn)家蠶的BmHSFd可以和BmHSP70a和Samui（一種冷脅迫誘導(dǎo)基因）的HSE 相結(jié)合，進而調(diào)控BmHSP70a和Samui基因的表達[38]。此外，CHEN等也發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的4 條HaHSF可變剪接體均能夠調(diào)節(jié)HaHSP70基因的表達[36]。這些研究結(jié)果表明，HSF通過調(diào)控多個基因的表達來參與昆蟲滯育過程，并且在昆蟲滯育過程中發(fā)揮重要作用。

3.4 其他生物學(xué)功能

HSF在昆蟲響應(yīng)低氧脅迫中同樣起著重要的作用。在缺氧環(huán)境中，果蠅的缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxiainducible factor-1,HIF-1）可通過和DmHSF基因的內(nèi)含子結(jié)合以直接上調(diào)DmHSF基因的表達，進而上調(diào)熱激蛋白的表達；而DmHSF 表達量較低的幼蟲在缺氧環(huán)境中只有約50%可以順利進入蛹期，與正常缺氧幼蟲相比，DmHSF 表達量較低的幼蟲存活率顯著降低[50]，說明HSF 可能參與響應(yīng)昆蟲的低氧脅迫。

除了參與響應(yīng)溫度脅迫和低氧脅迫等非生物脅迫外，昆蟲HSF也受到病害等生物脅迫調(diào)控。例如，果蠅C病毒（DrosophilaC virus,DCV）感染果蠅S2細胞，會導(dǎo)致果蠅S2細胞的DmHSF基因和熱激蛋白基因DmHSP70、DmHSP23和DmHSP26的表達水平提高，表明感染DCV會誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)的熱休克反應(yīng)。在感染DCV 后，與野生型果蠅相比，過表達DmHSF的果蠅存活時間被顯著延長，體內(nèi)病毒量也被長期控制在檢測不到的水平，而DmHSF缺失果蠅則表現(xiàn)出對DCV的高度敏感性[47]。因此，HSF所介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)可能是昆蟲先天抗病毒免疫的重要原因。

4 展望

HSF 參與昆蟲的許多生命活動，不論昆蟲處于正常狀態(tài)還是應(yīng)激狀態(tài)，HSF都在昆蟲的各種生物學(xué)過程中扮演重要角色。目前，HSF的研究主要集中在模式昆蟲黑腹果蠅中，在其他昆蟲中的研究還有待深入開展；此外，對HSF 功能的研究也主要集中在溫度脅迫上，而在面對擁擠、饑餓和光照等其他脅迫時，昆蟲體內(nèi)的HSF起到何種作用尚有待進一步研究。如WANG 等[51]發(fā)現(xiàn)紫外光會顯著影響棉鈴蟲熱激蛋白的表達，并推測HSF參與棉鈴蟲對光脅迫的響應(yīng)。此外，HSF響應(yīng)環(huán)境脅迫的調(diào)控機制不僅在昆蟲中不明晰，在其他生物中也尚未被探明。有關(guān)哺乳動物的研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下葡萄糖神經(jīng)酰胺會被迅速分解以提供糖基合成葡萄糖苷膽固醇，而生成的葡萄糖苷膽固醇能進一步誘導(dǎo)HSF1的激活和HSP90的合成[52-54]，這為HSF的調(diào)控機制研究提供了線索。但在昆蟲中，HSF如何感知脅迫信號并進行傳導(dǎo)，尚有待更深入的研究。近年來，隨著越來越多昆蟲HSF 被克隆與鑒定，研究表明昆蟲HSF不僅在熱休克反應(yīng)中起作用，而且可以通過調(diào)控非熱激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄進而在各種應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞過程和分子機制中起作用[55-56]。然而，對于HSF 可以調(diào)控的下游靶基因卻知之甚少。在后續(xù)的研究中，可以運用染色質(zhì)免疫共沉淀測序（chromatin immunoprecipitation-sequencing, CHIPSeq）等分子生物學(xué)技術(shù)深入解析HSF 的下游靶基因，以加深對昆蟲HSF調(diào)控機制和功能的認識。