丹酚酸B減輕骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨組織損傷

騫立剛，孫 博，于 泊，陳 康，馬 錚，陳濤平，王云飛

河北大學附屬醫(yī)院 骨科，河北 保定 071000

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis)是中老年人發(fā)病率較高的慢性疾病，可引發(fā)患者骨關(guān)節(jié)炎性反應，嚴重時導致關(guān)節(jié)軟骨壞死，影響患者正常行動[1]。低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)可促進低氧適應性基因的高表達，加劇炎性反應，誘導血管生成[2]。HIF-1可促進下游血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的高表達，VEGF是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病程度的重要標識之一[3]。

丹酚酸B(salvianolic acid B)主要存在于丹參中，已證實具有抗感染、消菌、抗病毒等功效，在治療關(guān)節(jié)炎疾病中發(fā)揮重要作用[4]。丹酚酸B可促進成骨分化，緩解骨質(zhì)疏松引起的關(guān)節(jié)炎[5]。推測其對于切斷交叉韌帶法(anterior cruciate ligment transection，ACLT)誘導產(chǎn)生的骨關(guān)節(jié)炎也具有治療作用。本研究構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，首次探討丹酚酸B是否通過調(diào)控HIF-1/VEGF信號通路對骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的軟骨組織損傷產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動物

SPF級雄性SD大鼠72只，7周齡，體質(zhì)量(260±15) g[萬泰滄海(廈門)生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(閩)2018-0002]。

尼美舒利(海南康芝藥業(yè)股份有限公司)；丹酚酸B(源葉生物科技有限公司)；HIF-1激活劑1,4-DPCA(圣克魯斯生物技術(shù)公司)；大鼠白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)檢測試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒(子科生物ZIKER公司);大鼠一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)檢測試劑盒(上海韻泰信息科技有限公司);番紅固綠染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司);Masson染色試劑盒(上海尚寶生物科技有限公司);GAPDH抗體、HIF-1抗體、VEGF抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)抗體和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠分為假手術(shù)組、骨關(guān)節(jié)炎組、尼美舒利組、丹酚酸B高(40 mg/kg)和丹酚酸B低劑量組(10 mg/kg)及丹酚酸B+HIF-1激活組(丹酚酸B 40 mg/kg和HIF-1激活劑1,4-DPCA 2 mg/kg)，每組12只。采用ACLT法構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型[6]。采取腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)給予20 d。

1.2.2 血清炎性相關(guān)因子水平的檢測：末次注射24 h后，麻醉各組大鼠，隨后立即處死，暴露腹主動脈，抽取2.5 mL血液，4 ℃ 6 000 r/min離心5 min，取上層血漿，按照試劑盒說明書方法檢測IL-6、TNF-α和iNOS含量。

1.2.3 顯微CT機骨質(zhì)量分析：各組大鼠腹主動脈取血后，切開表面皮膚，剝離表面組織，取出大鼠踝骨，剝離關(guān)節(jié)處軟骨組織，部分軟骨組織置于4%多聚甲醛中固定，部分液氮處理，研磨成粉末后，凍存?zhèn)溆?。清除大鼠踝骨表面附著的組織，反復清洗，確保骨表面無其他附著物。置于4%多聚甲醛中固定12 h，通過顯微CT機對骨表面進行掃描，電流40 μA，控制電壓90 kV，掃描厚度約為10 μm，掃描角度360°，幀數(shù)為1。對掃描圖像進行三維重構(gòu)和骨質(zhì)量分析，測定骨體積分數(shù)(BV/TV)、踝骨表面積與骨體積比值(BSA/BV)。

1.2.4 染色觀察軟骨組織病理學變化：取出固定好的軟骨組織，加入EDTA脫鈣處理，不同濃度乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制作石蠟切片，切片厚度5 μm，切片脫蠟至水，按照試劑盒說明書方法進行番紅固綠染色。

Masson染色：鐵蘇木精染色5 min，清水反復沖洗，鹽酸分化后沖洗直至返藍，品紅染色3 min，冰醋酸沖洗20 s，1%磷鉬酸水溶液處理2 min，苯胺藍染色3 min，冰醋酸沖洗20 s，不同濃度乙醇梯度脫水，樹脂封片后上鏡觀察染色結(jié)果。

1.2.5 Western blot檢測軟骨組織HIF-1、VEGF、MMP-13、cleaved caspase-3蛋白：取出凍存?zhèn)溆玫能浌墙M織粉末，加入1 mL裂解液，充分混勻振蕩裂解蛋白質(zhì)，加入蛋白質(zhì)提取液提取蛋白質(zhì)，與上樣緩沖液混合后，加熱變性加入凝膠孔道中，電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(GAPDH抗體、HIF-1抗體、VEGF抗體、MMP-13抗體及cleaved caspase-3抗體，1∶1 500)，4℃孵育過夜。TBST反復清洗，加入羊抗兔二抗(1∶1 500)，常溫孵育35 min，TBST反復清洗，將發(fā)光液A液和B液混合后倒于膜上，室溫浸泡60 s，取出用濾紙吸干多余水分，置于掃描系統(tǒng)，進行條帶分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸B對骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠骨質(zhì)量的影響

與假手術(shù)組相比，骨關(guān)節(jié)炎組踝骨BV/TV顯著降低(P<0.05)，BSA/BV顯著升高(P<0.05)；與骨關(guān)節(jié)炎組相比，尼美舒利組、丹酚酸B高及低劑量組踝骨BV/TV顯著升高(P<0.05)，BSA/BV顯著降低(P<0.05)；與丹酚酸B高劑量組相比，丹酚酸B低劑量組、丹酚酸B+HIF-1激活組踝骨BV/TV顯著降低(P<0.05)，BSA/BV顯著升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with sham; # P<0.05 compared with osteoarthritis; △ P<0.05 compared with salvianolic acid B high dose(40 mg/kg)圖1 各組大鼠踝骨BV/TV和BSA/BV水平比較Fig 1 Comparison of BV/TV and BSA/BV levels in the ankle bone of rats in each group

2.2 丹酚酸B對骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎性反應的影響

與假手術(shù)組相比，骨關(guān)節(jié)炎組血清IL-6、TNF-α含量和iNOS活性顯著升高(P<0.05)；與骨關(guān)節(jié)炎組相比，尼美舒利組、丹酚酸B高和低劑量組血清IL-6、TNF-α含量及iNOS活性顯著降低(P<0.05)；與丹酚酸B高劑量組相比，丹酚酸B低劑量組、丹酚酸B+HIF-1激活組血清IL-6、TNF-α含量及iNOS活性顯著升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 丹酚酸B對骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨病理學變化的影響

假手術(shù)組軟骨組織表面平整，無明顯突起，組織全染至番紅色，組織中膠原纖維數(shù)量充足，組織間僅有少量縫隙；骨關(guān)節(jié)炎組軟骨組織表面出現(xiàn)多條裂痕，表層細胞數(shù)量減少，幾乎全部失染，組織中出現(xiàn)大量縫隙，膠原纖維數(shù)量急劇減少；尼美舒利組、丹酚酸B高及低劑量組軟骨組織表面逐漸恢復平整，失染明顯減少，組織間無明顯縫隙，膠原纖維逐漸增多；丹酚酸B+HIF-1激活組軟骨組織表面仍有裂痕，幾乎完全失染，細胞間隙擴大，膠原纖維數(shù)量仍然較少(圖3)。

*P<0.05 compared with sham; # P<0.05 compared with osteoarthritis; △ P<0.05 compared with salvianolic acid B high dose(40 mg/kg)圖2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量及iNOS活性比較Fig 2 Comparison of IL-6, TNF-α contents and iNOS activity in serum of rats in each group

圖3 軟骨組織番紅固綠染色及Masson染色Fig 3 Safranin O-fast green staining and Masson staining of rat cartilage tissues (×200)

2.4 丹酚酸B對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨HIF-1、VEGF、MMP-13及cleaved caspase-3蛋白表達的影響

與假手術(shù)組相比，骨關(guān)節(jié)炎組軟骨HIF-1、VEGF、MMP-13、cleaved caspase-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與骨關(guān)節(jié)炎組相比，尼美舒利組、丹酚酸B高及低劑量組軟骨HIF-1、VEGF、MMP-13、cleaved caspase-3蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與丹酚酸B高劑量組相比，丹酚酸B低劑量組及丹酚酸B+HIF-1激活組軟骨HIF-1、VEGF、MMP-13及cleaved caspase-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)(圖4，5)。

A.sham; B.osteoarthritis; C.nimesulide; D.salvian-olic acid B(40 mg/kg); E.salvianolic acid B(10 mg/kg); F.salvianolic acid B+HIF-1 activation圖4 軟骨組織HIF-1、VEGF、MMP-13及cleavedcaspase-3蛋白表達量Fig 4 Expression levels of HIF-1, VEGF, MMP-13, and cleaved caspase-3 in cartilage tissues

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理復雜但最終都會引發(fā)炎性反應，伴隨疼痛反應的同時對骨質(zhì)量產(chǎn)生影響，嚴重影響中老人正常生活[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠踝骨BV/TV降低，BSA/BV升高，這是骨關(guān)節(jié)變形和骨基質(zhì)損傷的重要標志；同時大鼠血清IL-6、TNF-α含量及iNOS活性顯著升高，表明炎性反應加劇，與骨關(guān)節(jié)炎病征一致，證明模型構(gòu)建成功。

丹酚酸B可通過調(diào)控凋亡，抑制炎性反應，從而減輕心血管疾病危害[9]。以丹酚酸B為主要成分的治療性藥物復方丹參注射液可顯著減輕炎性因子的表達水平[10]。本研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可通過調(diào)控炎性反應，緩解骨變形，改善骨基質(zhì)損傷，從而減輕骨關(guān)節(jié)炎病情。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可以通過緩解軟骨組織損傷，促進膠原合成，加速組織恢復，從而改善病情。但具體的作用機理有待進一步探索。

有文獻指出，MMP-13可特異性調(diào)控軟骨裂解，加速軟骨組織細胞凋亡，從而破壞軟骨組織正常發(fā)揮功能[11]。MMP-13在關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中特異性地高表達，破壞軟骨組織，進一步加劇關(guān)節(jié)炎，其高表達受多種炎性因子表達量的影響，共同參與調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可通過抑制MMP-13的表達，緩解軟骨組織損傷，減緩細胞凋亡。同時有文獻指出，HIF-1和VEGF在關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織高表達，HIF-1和VEGF的高表達可進一步加劇類風濕關(guān)節(jié)炎病情，以丹酚酸B為主要成分的丹參可通過抑制HIF-1和VEGF的表達，對腦缺血再灌注損傷等多種疾病產(chǎn)生影響[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B很可能通過調(diào)控HIF-1、VEGF發(fā)揮作用。本實驗在丹酚酸B作用的同時激活HIF-1蛋白表達，發(fā)現(xiàn)大鼠HIF-1、VEGF蛋白表達升高，同時軟骨組織損傷和炎性反應加重，進一步驗證相關(guān)推測。

*P<0.05 compared with sham group; # P<0.05 compared with osteoarthritis group; △ P<0.05 compared with salvianolic acid B(40 mg/kg) high dose

Fig 5 Comparison of HIF-1, VEGF, MMP-13 and cleaved caspase-3 protein expression levelsin cartilage tissues of rats in each group

綜上所述，丹酚酸B可通過調(diào)控HIF-1/VEGF通路，抑制HIF-1、VEGF表達，進而抑制MMP-13、cleaved caspase-3蛋白表達，減輕細胞凋亡和炎性反應，緩解軟骨組織損傷，加速膠原生成，從而緩解骨關(guān)節(jié)炎。丹酚酸B藥效廣泛，是否還通過其他作用途徑參與調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎，還有待進一步實驗加以說明。