二甲雙胍抑制腰椎間盤退變模型兔椎間盤組織的細(xì)胞凋亡

董軍立，蔡少康，嚴(yán) 蕾，蔡 毅

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 疼痛科, 湖北 武漢 430014

壓力誘導(dǎo)或缺血缺氧，引起的細(xì)胞自噬降低，在腰椎間盤退變中發(fā)揮重要作用。另外，自噬激活還可抑制炎性反應(yīng)，提高細(xì)胞應(yīng)對外界刺激的能力[1]。促炎因子——腫瘤壞死因子-α(TNF-α)會減弱自噬，導(dǎo)致有害代謝產(chǎn)物聚集，而加重細(xì)胞凋亡，但參與自噬小體形成的關(guān)鍵蛋白-自噬相關(guān)蛋白7(Atg7)基因缺失，卻可促進(jìn)TNF-α反應(yīng)活化。因此，探究組織中自噬與炎性變化，對闡明髓核組織及軟骨細(xì)胞死亡、椎間盤退化產(chǎn)生的分子機(jī)制有重要作用。近來有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍(metformin)可能在改善腰椎間盤退變性疾病髓核組織細(xì)胞炎性反應(yīng)、自噬等病變發(fā)展調(diào)控中，有潛在價值[2]。本研究建立兔腰椎間盤退變性疾病模型，對此進(jìn)行研究驗證。以期為二甲雙胍在腰椎間盤退變性疾病領(lǐng)域的應(yīng)用治療，提供可靠資料。

1 材料與方法

1.1實驗材料

SPF級雄性新西蘭大白兔50只，6月齡，體質(zhì)量(2.0±0.5)kg[華中科技大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2021-0009]，本研究實驗于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行，許可證號：SYXK(鄂)2018-0104，倫理批號：2021-021102。

二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司)；自噬抑制劑-3MA(北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司)；HE染色液(北京伊塔生物科技有限公司)；TUNEL染色液(無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；山羊抗兔Atg7、LC3Ⅱ、Beclin1、溶酶體相關(guān)膜蛋白2(LAMP2)、TNF-α、IL-1β和凋亡相關(guān)蛋白caspase-8等多克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔的分組及處理：將兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組(參照文獻(xiàn)[3-4]用髓核穿刺抽吸法暴露椎間盤(L2-L6)，破壞椎間盤建立椎間盤退變模型)、二甲雙胍組(160 mg/kg二甲雙胍灌胃)、自噬抑制劑組(自噬抑制劑-3MA注射計量5 mmol/L,0.5 mL/只)、二甲雙胍+自噬抑制劑組，每組10只，術(shù)后12周行磁共振成像(magnetic resonance imag-ing,MRI)檢測。

1.2.2 MRI檢查評估椎間盤退變程度：參照[5]方法對腰椎行MRI檢查，用Pfirrmann分級法對椎間盤退變程度進(jìn)行評分，總分以4分計，評分越高示椎間盤退變程度越嚴(yán)重。

1.2.3 透射電鏡觀察椎間盤組織自噬體形成：取椎間盤組織，切成1 cm×1 cm×1 cm組織塊兒，送于電鏡室處理后，拍照，以觀察自噬體形成情況。剩余組織用4%多聚甲醛固定24 h，乙二胺四乙酸(0.5 mol/L)脫鈣20 d后，制成厚為4 μm的連續(xù)石蠟切片備用。

1.2.4 HE及TUNEL染色觀察椎間盤組織結(jié)構(gòu)病變及細(xì)胞凋亡狀況：取相同部位椎間盤組織石蠟切片，脫蠟、水化、抗原滅活及修復(fù)處理后，進(jìn)行HE及TUNEL染色處理(按說明書進(jìn)行)后，于光鏡下觀察拍照。TUNEL染色切片在400倍光鏡下，隨機(jī)取5個視野，計算單位面積內(nèi)陽性染色(紅棕色)的平均吸光度值。

1.2.5 免疫組化法檢測Atg7陽性表達(dá)：椎間盤組織石蠟切片，脫蠟、透化、抗原修復(fù)后，遞加1∶100的山羊抗兔Atg7一抗抗體孵育24 h，滴加IgG驢抗山羊二抗抗體孵育25 min，DAB顯色，光鏡下觀察拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析400倍鏡下單位面積內(nèi)陽性染色的平均吸光度值。

1.2.6 Western blot檢測椎間盤組織自噬、炎性因子、凋亡蛋白質(zhì)表達(dá)：剩余5只大白兔麻醉處死后，取椎間盤組織，加入液氮研磨，提取胞質(zhì)蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白濃度，取80 μg蛋白質(zhì)行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，滴加1∶400的山羊抗兔LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2、TNF-α、IL-1β、caspase-8一抗及1∶800的內(nèi)參β-actin抗體4 ℃孵育過夜，滴加驢抗山羊IgG二抗(1∶800)孵育55 min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，Image-J軟件分析條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對兔椎間盤退變程度的影響

MRI檢查顯示椎間盤信號越高，Pfirrmann分級評分越低，預(yù)示退變程度較低。與假手術(shù)組相比，模型組椎間盤為低信號，Pfirrmann分級評分升高(P<0.05)；二甲雙胍組椎間盤退變程度Pfirrmann分級評分降低(P<0.05)；自噬抑制劑組兔椎間盤退變程度Pfirrmann分級評分進(jìn)一步升高(P<0.05)。與二甲雙胍組相比，二甲雙胍+自噬抑制劑組椎間盤退變程度Pfirrmann分級評分升高(P<0.05)(圖1,表1)。

2.2 二甲雙胍對兔椎間盤組織病理變化的影響

模型組較假手術(shù)組兔腰椎間隙變窄，纖維環(huán)排列紊亂且有裂痕，髓核細(xì)胞數(shù)量及胞外間質(zhì)減少，終板下層增生軟骨陷窩較多。二甲雙胍組兔腰椎間隙增寬，纖維環(huán)排列逐漸整齊，髓核細(xì)胞數(shù)目及胞外基質(zhì)增多，終板下層軟骨增生減輕。自噬抑制劑組兔腰椎間隙變窄、髓核細(xì)胞數(shù)目及纖維環(huán)減少、終版軟骨增生等退變病理現(xiàn)象進(jìn)一步加重。二甲雙胍+自噬抑制劑組兔上述病理損傷較二甲雙胍組嚴(yán)重，但較模型組減輕(圖2)。

圖1 MRI檢查Fig 1 MRI examination

表1 兔椎間盤退變程度Pfirrmann分級評分比較

2.3 二甲雙胍對兔椎間盤組織細(xì)胞自噬的影響

透射電鏡觀察可見，假手術(shù)組兔椎間盤組織細(xì)胞中自噬小體及自噬溶酶體較多，模型組兔僅有少量的自噬小體及自噬溶酶體形成。二甲雙胍組兔自噬小體及自噬溶酶體形成有所增加。自噬抑制劑組兔幾乎未見自噬小體及自噬溶酶體形成。二甲雙胍+自噬抑制劑組兔自噬小體及自噬溶酶體形成較二甲栓胍組較少(圖3)。

免疫組化染色可見自噬關(guān)鍵蛋白-Atg7在假手術(shù)組兔椎間盤組織細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性(紅棕色)表達(dá)。與假手術(shù)組相比，模型組兔椎間盤組織細(xì)胞中Atg7陽性表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組相比，二甲雙胍組兔椎間盤組織細(xì)胞中Atg7陽性表達(dá)升高(P<0.05)；自噬抑制劑組兔椎間盤組織細(xì)胞中Atg7陽性表達(dá)較模型組進(jìn)一步降低(P<0.05)。與二甲雙胍組相比，二甲雙胍+自噬抑制劑組椎間盤組織細(xì)胞Atg7陽性表達(dá)降低(P<0.05)(圖4，表2)。

圖2 椎間盤組織HE染色Fig 2 HE staining of intervertebral disc tissue(×40)

The arrows indicated autophagosomes and autolysosomes圖3 椎間盤組織的透射電鏡觀察Fig 3 Transmission electron microscope observation of intervertebral disc tissue (×12 000)

Western blot檢測顯示，模型組兔椎間盤組織細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅱ、Beclin1及LAMP2蛋白表達(dá)較假手術(shù)組降低(P<0.05)。與模型組相比，二甲雙胍組兔椎間盤組織LC3Ⅱ、Beclin1及LAMP2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；自噬抑制劑組兔椎間盤組織LC3Ⅱ、Beclin1及LAMP2蛋白表達(dá)較模型組進(jìn)一步降低(P<0.05)。與二甲雙胍組相比，二甲雙胍+自噬抑制劑組兔椎間盤組織LC3Ⅱ、Beclin1及LAMP2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖5，表2)。

圖4 椎間盤組織Atg7免疫組化染色Fig 4 Intervertebral disc tissue Atg7 immunohistochemical staining (×40)

表2 兔椎間盤組織Atg7陽性表達(dá)及LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2蛋白表達(dá)比較

A.sham; B.model; C.metformin; D.autophagy inhibitor; E.metformin+autophagy inhibitor圖5 椎間盤組織LC3Ⅱ、Beclin1及LAMP2蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig 5 Western blot of LC3Ⅱ, Beclin1 and LAMP2 protein expression in intervertebral disc tissue

2.4 二甲雙胍對兔椎間盤組織細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)蛋白質(zhì)的影響

模型組兔椎間盤組織紅棕色染色加深，凋亡細(xì)胞率較假手術(shù)組升高(P<0.05)。二甲雙胍組兔椎間盤組織紅棕色染色變淺，凋亡細(xì)胞率較模型組降低(P<0.05)；自噬抑制劑組凋亡細(xì)胞率較模型組進(jìn)一步升高(P<0.05)。與二甲雙胍組相比，二甲雙胍+自噬抑制劑組凋亡細(xì)胞率升高(P<0.05)(圖6，表3)。

模型組兔椎間盤組織細(xì)胞中凋亡蛋白caspase-8、促炎蛋白TNF-α及IL-1β表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組相比， 二甲雙胍組兔椎間盤組織caspase-8、TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；自噬抑制劑組兔椎間盤組織caspase-8、TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)較模型組進(jìn)一步升高(P<0.05)。與二甲雙胍組相比，二甲雙胍+自噬抑制劑組兔椎間盤組織caspase-8、TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(圖7，表3)。

圖6 椎間盤組織TUNEL染色Fig 6 TUNEL staining of intervertebral disc tissue(×40)

3 討論

椎間盤是人體最大的無血管組織，靠兩側(cè)終板組織彌散的毛細(xì)血管來提供少量營養(yǎng)。椎間盤退變過程中，兩側(cè)終板軟骨發(fā)生鈣化后，毛細(xì)血管彌散作用減弱， 椎間盤組織髓核細(xì)胞的營養(yǎng)供給將更為受限。故大量研究認(rèn)為，自噬持續(xù)激活能保證正常椎間盤細(xì)胞在低血供時，維持正常的能量供應(yīng)，并清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物、降解受損及失去功能的蛋白質(zhì)以維持細(xì)胞活力及正常功能[6]。本研究提示椎間盤退變過程中出現(xiàn)自噬減少現(xiàn)象，這與報道的發(fā)現(xiàn)椎間盤退變患者髓核組織自噬對髓核細(xì)胞及組織的保護(hù)作用降低，是導(dǎo)致髓核組織細(xì)胞凋亡退化的機(jī)理相一致[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，激活自噬，可減少受損大分子物質(zhì)蓄積，并抑制自噬蛋白Beclin-1與抗凋亡蛋白Bcl2結(jié)合來促進(jìn)細(xì)胞生存，減輕椎間盤退變[8]。二甲雙胍可通過啟動肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)/5’-單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase, AMPK)活性，抑制自噬抑制蛋白-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin,mTOR)表達(dá)，來啟動自噬，改善細(xì)胞代謝水平[9]。本研究提示二甲雙胍可能通過促進(jìn)自噬，來緩解椎間盤退變。

A.sham; B.model; C.metformin; D.autophagy inhibitor; E.metformin+autophagy inhibitor圖7 免疫印跡檢測椎間盤組織caspase-8、TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)Fig 7 Western blot showed protein expression of caspase-8, TNF-α and IL-1β in interver- tebral disc tissue

表3 兔椎間盤組織細(xì)胞凋亡率、凋亡及炎性蛋白表達(dá)比較

文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，自噬不僅能靶向隔離、降解pro-IL-1β，來抑制炎性小體激活，還能通過清除凋亡的細(xì)胞，防止代謝產(chǎn)物的過度蓄積，而弱化炎性反應(yīng)[10]。Atg7為自噬的核心蛋白，其能與III類磷脂酰肌3-激酶效應(yīng)器(Ptd Ins3P)效應(yīng)蛋白相結(jié)合而形成泛素化類復(fù)合物，來介導(dǎo)自噬泡形成。TNF-α可破壞基質(zhì)金屬蛋白酶、水通道蛋白酶、聚糖蛋白、Ⅱ型膠原蛋白等，來引起髓核組織細(xì)胞皺縮、干癟、凋亡及功能丟失[11]。敲除Atg7抑制自噬的情況下，可誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)升高，用TNF-α誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)的同時，會出現(xiàn)Atg7及LC3Ⅱ蛋白表達(dá)降低[12]，提示Atg7與TNF-α之間可能存在相互作用，來調(diào)控炎性反應(yīng)-自噬-凋亡的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，自噬受抑制，其減弱炎性反應(yīng)能力降低，可能是參與椎間盤退變發(fā)生的潛在機(jī)制。二甲雙胍在促進(jìn)Atg7及LC3Ⅱ表達(dá)，激活自噬，降低椎間盤組織細(xì)胞凋亡，緩解椎間盤退變過程中，還降低TNF-α、IL-1β等炎性因子表達(dá)，提示二甲雙胍可緩解椎間退變，且其緩解作用可能與促進(jìn)自噬、抑制凋亡，減弱炎性反應(yīng)有關(guān)。二甲雙胍與自噬抑制劑-3MA聯(lián)合應(yīng)用時，二甲雙胍的激活自噬、抑制凋亡、減弱炎性反應(yīng)等作用可被自噬抑制劑-3MA明顯減弱。

綜上所述，二甲雙胍可能通過促進(jìn)自噬激活，減弱炎性反應(yīng)，來抑制椎間盤組織細(xì)胞凋亡，改善椎間盤退變。這可能為二甲雙胍治療椎間盤退變提供新的治療策略，但椎間盤退變過程中，引起自噬保護(hù)性活性降低的基因調(diào)控機(jī)制還不甚清楚，這需要后續(xù)繼續(xù)深入探究。