miR-203a-3p抑制人肝癌細(xì)胞系增殖

黃驛勝，葉啟文，王競(jìng)楓

寧德市閩東醫(yī)院 1.普通外科； 2.心血管內(nèi)科，福建 寧德 352000

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上常見(jiàn)的癌之一，亞洲和非洲的發(fā)病率最高[1]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、遷移、存活和化療敏感性中發(fā)揮重要作用[2]。MRNAs在癌診斷及預(yù)后中的潛在應(yīng)用前景仍很樂(lè)觀，但其價(jià)值仍有待確定，其促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生的潛在機(jī)制尚不完全清楚。MiRNA是HCC發(fā)展和進(jìn)展的關(guān)鍵參與者和調(diào)節(jié)因子，在HCC中miRNAs的關(guān)鍵調(diào)控過(guò)程包括增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、血管生成、耐藥和自噬[3]。既往研究證實(shí)miR-203a-3p在許多腫瘤中表達(dá)水平低，它可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，并通過(guò)調(diào)控靶基因參與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[4]。本研究采用慢病毒感染模型實(shí)現(xiàn)HepG2細(xì)胞中miR-203a-3p的過(guò)表達(dá)，分析miR-203a-3p對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、克隆和遷移的影響，以及對(duì)HCC細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，為miR-203a-3p在HCC中的功能研究及其在細(xì)胞癌變中的相關(guān)機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑：人肝癌細(xì)胞系(HepG2、Huh7、SMMC-7721、Bel-7402)和正常人肝細(xì)胞系(LO2)(中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 mol/mL鏈霉素、Trizol試劑和第一鏈cDNA合成試劑盒(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；FFPE RNA 純化試劑盒(Norgen Biotek公司)；RNAiso小RNA提取試劑[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]；SYBR select master mix試劑盒(Hoffmann-La Roche有限責(zé)任公司)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)ELISA試劑盒(R&D Systems公司)；全蛋白提取試劑盒、BCA(2,2-Biquinoline-4,4-dicarboxylic acid二鈉鹽)蛋白質(zhì)含量試劑盒和電化學(xué)發(fā)光 (electrochemiluminescence, ECL)檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；抗TGF-β1和抗GAPDH單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；抗TGFβR1單克隆抗體[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)細(xì)胞增殖試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物公司)；人源TGF-β1重組蛋白(亞諾法生技股份有限公司)；引物(是生工生物技術(shù)有限公司)；miR-203a-3p慢病毒載體(上海漢恒生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 組織標(biāo)本：HCC組織標(biāo)本取自2017年12月至2019年6月，寧德市閩東醫(yī)院病理科石蠟包埋塊，HCC及鄰近非腫瘤標(biāo)本30例。所有標(biāo)本均經(jīng)免疫組織化學(xué)驗(yàn)證，并按原發(fā)灶(tumor，T)，淋巴結(jié)(node，N)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(metastasis，M)分期進(jìn)行特征分析。本研究經(jīng)寧德市閩東醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)20170111)，肝癌臨床標(biāo)本石蠟塊的使用告知患者，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：所有的細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，將細(xì)胞分為：HepG2細(xì)胞對(duì)照組(Ctrl)、慢病毒空質(zhì)粒組(NC)，慢病毒miR-203a-3p過(guò)表達(dá)組(OP)，TGF-β1處理組(TGF-β1)，TGF-β1聯(lián)合miR-203a-3p過(guò)表達(dá)處理組(OP+TGF-β1)。

1.2.2 慢病毒感染與穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選：取出-80 ℃保存的病毒，放在冰上慢慢融化。病毒準(zhǔn)備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出已貼壁的細(xì)胞，各孔更換新鮮完全培養(yǎng)基后，向各組細(xì)胞中加入計(jì)算好的病毒液，HepG2細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection， MOI)值為30。搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。棄去含病毒液的培養(yǎng)基上清，更換為完全培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。以嘌呤霉素(6 μg/mL)完成篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)miR-203a-3p的細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 TGF-β1干預(yù)細(xì)胞模型：從培養(yǎng)箱中拿出已貼壁的細(xì)胞，更換新鮮完全培養(yǎng)基后，向各組細(xì)胞中加入含有TGF-β1(終濃度為10 mg/L，濃度的選擇參考文獻(xiàn)[5])的新鮮完全培養(yǎng)基，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。每隔24 h棄去培養(yǎng)基，更換含TGF-β1的完全培養(yǎng)基，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)miR-203a-3p及mRNA的表達(dá)：按照Norgen FFPE RNA提取試劑盒提取石蠟組織中的總RNA，按照RNAiso小RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)，提取細(xì)胞的小RNA。通過(guò)莖環(huán)引物對(duì)miR-203a-3p進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，引物序列為:5′-CTCAACT GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTAGTG GT-3′。以U6(內(nèi)參基因)的反轉(zhuǎn)錄作為下游引物。使用反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)對(duì)分離的小RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。miR-203a-3p檢測(cè)引物上游序列為5′-ACACTCCA GCTGGCGTGAAATGTTTAGG-3′，下游序列為常規(guī)序列5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。U6檢測(cè)引物上游序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

使用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，使用第一鏈cDNA合成試劑盒完成mRNA的反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR使用SYBR select master mix試劑盒進(jìn)行。針對(duì)目的基因的引物(表1)。RT-qPCR在平行實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)樣本檢測(cè)3次，GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)TGF-β1蛋白的表達(dá)：用全細(xì)胞裂解法提取總蛋白質(zhì)。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。每個(gè)分組的總蛋白用12%的SDS-PAGE分離膠完成垂直電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，清洗后采用鼠抗人TGF-β1(1∶2 000)、鼠抗人GAPDH(1∶5 000)單克隆抗體進(jìn)行孵育，羊抗鼠二抗(1∶5 000)單克隆抗體進(jìn)行孵育，以ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行可視化發(fā)光成像。最后，使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)完成成像和吸光度值分析。

1.2.6 ELISA檢測(cè)TGF-β1的分泌情況：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，2 000 r/min離心5 min，取200 μL上清，以TGF-β1 ELISA 試劑盒，按照按說(shuō)明書(shū)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從而定量測(cè)定TGF-β1含量水平。

1.2.7 MTT法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖：用MTT細(xì)胞增殖試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞的增殖率以A450 nm的數(shù)值進(jìn)行相互比較。

1.2.8 平板集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成：各組細(xì)胞接種到6孔板中，400個(gè)細(xì)胞/孔。將平板置于細(xì)胞培養(yǎng)接種器中培養(yǎng)1周至集落形成。用迪夫快速染色液固定細(xì)胞。最后對(duì)集落數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。集落形成率(%)=(細(xì)胞集落數(shù)/每孔細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：各組細(xì)胞在對(duì)數(shù)增殖期轉(zhuǎn)移到12孔培養(yǎng)板。12 h后將細(xì)胞貼壁，用200 μL移液管尖在培養(yǎng)孔中線(xiàn)進(jìn)行劃痕處理。分別于12 h和48 h用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行成像。觀察兩側(cè)細(xì)胞的增殖和遷移情況，以劃痕寬度作為檢測(cè)值，評(píng)估偏移率。

1.2.10 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔以1×106個(gè)貼壁。然后每孔加入3 mL培養(yǎng)液，待底部區(qū)域細(xì)胞增殖達(dá)到90%匯合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用凋亡檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)在流式細(xì)胞儀中完成實(shí)驗(yàn)。

1.2.11 表達(dá)譜芯片檢測(cè)差異mRNA的表達(dá)： 人源表達(dá)譜芯片檢測(cè)由上?？党缮锛夹g(shù)有限公司完成，合計(jì)6份樣本，包括3份HepG2細(xì)胞及和3份miR-203a-3p過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞。使用NanoDrop ND-1000對(duì)每個(gè)樣本的總RNA進(jìn)行定量，Arraystar Flash RNA標(biāo)記協(xié)議(Arraystar)擴(kuò)增每個(gè)樣本的總RNA并轉(zhuǎn)錄成熒光cRNA。將標(biāo)記的cRNA雜交到安捷倫人基因組表達(dá)譜芯片陣列(4×44K)上。洗片，用芯片掃描儀GenePix 4000B對(duì)陣列進(jìn)行掃描，Agilent Feature Extraction軟件(version 11.0)對(duì)獲取的陣列圖像進(jìn)行分析。采用R軟件limma軟件包進(jìn)行分位數(shù)歸一化和后續(xù)數(shù)據(jù)處理。通過(guò)火山圖過(guò)濾，篩選出兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的mRNA。通過(guò)Fold Change filtering識(shí)別兩個(gè)樣本間差異表達(dá)的mRNA。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-203a-3p在細(xì)胞和臨床標(biāo)本中的表達(dá)

miR-203a-3p在HCC中的表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.001)(圖1A)。miR-203a-3p在TNM期HCC患者中的表達(dá)水平明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期(P<0.001)(圖1B)。miR-203a-3p在HepG2細(xì)胞中表達(dá)水平最低 (圖1C)，選擇HepG2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。HepG2細(xì)胞感染miR-203a-3p慢病毒顆粒后，miR-203a-3p的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.001)(圖1D)。

2.2 miR-203a-3p對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響

相比于對(duì)照組， OP組細(xì)胞在24、48、72和96 h時(shí)增殖均降低(P<0.05)(圖2A)；OP組細(xì)胞的遷移能力降低(P<0.05)(圖2B)；OP組集落形成能力降低(P<0.001)(圖2C)；OP組細(xì)胞凋亡顯著增加 (P<0.05)(圖2D)。

2.3 miR-203a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞中TGF-β1及其TGFβR1表達(dá)的影響

相比于對(duì)照組，CD27等12個(gè)基因表達(dá)升高(P<0.05)，MMP7等7個(gè)基因表達(dá)降低(P<0.05) (圖3A)，關(guān)注一對(duì)配體TGF-β1及其受體TGFβR1基因的表達(dá)；相比于Ctrl組，OP組TGF-β1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體1(transforming growth factor beta receptor 1，TGFβR1)mRNA表達(dá)升高(P<0.05)(圖3B)；OP組TGF-β1在細(xì)胞培養(yǎng)上清中含量明顯降低(P<0.05)(圖3C)；OP組TGF-β1表達(dá)降低(P<0.05)，而TGFβR1表達(dá)升高(P<0.05) (圖3D,E)。

2.4 TGF-β1聯(lián)合miR-203a-3p對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和遷移的影響

相比于OP組， OP+TGF-β1組在48、 72和96 h時(shí)細(xì)胞增殖能力上升(P<0.05)(圖4A)；OP+TGF-β1組48 h細(xì)胞遷移能力上升(P<0.05)(圖4B,C)。

A.expression of miR-203a-3p in 30 patients with HCC was significantly lower than that in 30 cases of adjacent tissues; B.expression of miR-203a-3p was negatively correlated with histological grade; C.expression of miR-203a-3p was in expression in HCC cells (LO2, HepG2, Huh7, SMMC-7721 and Bel-7402); D.RT-qPCR verified miR-203a-3p over-expression; *P<0.05 compared with tumor, grade and Ctrl group

A.HepG2 cell proliferation test; B.HepG2 cell scratch test; C.HepG2 cell colony formation test; D.HepG2 cell apoptosis test; *P<0.05 compared with Ctrl group

3 討論

研究表明，miR-203在HCC中表達(dá)下調(diào)，高表達(dá)miR-203是HCC手術(shù)后預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[6]。在本研究中，收集臨床HCC的癌及癌旁的成對(duì)標(biāo)本，分析miR-203a-3p在癌及癌旁腫瘤中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示miR-203a-3p在HCC中低表達(dá)，且與HCC的進(jìn)展和分期呈負(fù)相關(guān)，這與報(bào)道的結(jié)果一致。然而miR-203 的表達(dá)也被描述為在幾種癌中上調(diào)，例如結(jié)腸癌[7]和胰腺癌[8]。miR-203 在癌發(fā)展中的這些相互矛盾的結(jié)果可能是由于 miRNA表達(dá)的特定特征，其根據(jù)癌類(lèi)型而變化。

miR-203在多個(gè)癌中發(fā)揮抑制功能。研究顯示miR-203的模擬物可以抑制食道癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[9]。miR-203可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移[10]，其過(guò)表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡[11]。miR-203 還可抑制乳腺癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲[12]。在HCC中，已有研究表明miR-203 在體外抑制 HCC 細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖[13]。本文以miR-203a-3p過(guò)表達(dá)HepG2細(xì)胞作為研究模型，證實(shí)miR-203a-3p降低增殖能力和遷移能力，促進(jìn)凋亡效應(yīng)和削弱集落形成能力，這與報(bào)道一致，充分證實(shí) miR-203a-3p在HCC中發(fā)揮類(lèi)似抑癌基因的功能。

一般來(lái)說(shuō)，miR-203在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，并對(duì)信號(hào)分子發(fā)生反應(yīng)，從而發(fā)揮影響癌細(xì)胞表現(xiàn)變化的功能。本研究通過(guò)表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)通路相關(guān)的TGF-β1及其TGFβR1基因表達(dá)差異較大。TGF-β1是腫瘤微環(huán)境(tumor microenviron-ment，TME)內(nèi)多種細(xì)胞產(chǎn)生的，負(fù)責(zé)調(diào)控腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞活性。免疫組化檢測(cè)顯示，TGF-β1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于腹膜肝組織， TGF-β1mRNA表達(dá)的表達(dá)水平亦明顯低于腹膜肝組織[14]。有趣的是，本文發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞外培養(yǎng)上清中TGF-β1蛋白含量降低這說(shuō)明miR-203a-3p可以降低HepG2細(xì)胞中TGF-β1蛋白的表達(dá)。TGFBR1是TGF-β1的受體膜基因，TGF-β1驅(qū)動(dòng)細(xì)胞后，TGFBR1介導(dǎo)SMAD2/3復(fù)合物磷酸化，影響下游通路。TGFBR1表達(dá)的增加可能是細(xì)胞的代償作用，因?yàn)門(mén)GF-β1蛋白在細(xì)胞外的刺激減弱，細(xì)胞的代償作用增加了TGF-β信號(hào)通路的能力。TGF-β信號(hào)通路在肝癌中又發(fā)揮著促癌機(jī)制[15]。本研究采用TGF-β1重組蛋白進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的外在刺激，使得miR-203a-3p過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞部分恢復(fù)了細(xì)胞增殖和遷移能力。

A.heat map, red-labeled was over-expressed, green-labeled was down-regulated; B.RT-qPCR verified the expression of TGF-β1 and TGFβR1 mRNA; C.ELISA to detect TGF-β1 protein content in cell culture supernatant; D, E.Western blot to detect TGF-β1 and TGFβR1 protein expression level in cells; *P<0.05 compared with ctrl group

綜上所述，miR-203a-3p在HCC中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-203a-3p可降低HepG2細(xì)胞增殖、集落形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-203a-3p可以降低TGF-β1基因的表達(dá)水平，但是生物信息預(yù)測(cè)顯示miR-203a-3p與TGF-β1 mRNA之間無(wú)靶向相關(guān)性，說(shuō)明其抑制表達(dá)是間接作用?？傊?，miR-203a-3p是否通過(guò)TGF-β途徑發(fā)揮抑癌功能的作用機(jī)制還要進(jìn)一步探索。

A.cell proliferation curve; B.cell migration histogram; C.cell scratch; # P<0.05 compared with OP group圖4 TGF-β1聯(lián)合miR-203a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和遷移的影響