核酸適配體W3介導(dǎo)靶向乳腺癌的量子點(diǎn)成像

王 群，李 鑫，馬 俊，李婉明

中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 分子細(xì)胞生物學(xué)教研室, 遼寧 沈陽(yáng) 110122

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。目前乳腺癌的診斷主要依賴影像檢查技術(shù)，常用的乳腺癌影像檢查方法包括B超、乳腺X線攝影、核磁共振成像(magnetic reson-ance imaging，MRI)、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission computed tomography，PET-CT)等[2]。然而，這些檢查方法都有一定的局限性，例如靈敏度低、空間分辨率較低、診斷時(shí)間較長(zhǎng)。因此，發(fā)展能夠靈敏準(zhǔn)確進(jìn)行腫瘤早期診斷的新技術(shù)，特別是能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞水平的原位實(shí)時(shí)成像，對(duì)實(shí)現(xiàn)腫瘤的及時(shí)有效檢測(cè)、提高治療效果具有十分重要的意義。

核酸適配體(aptamer)是一段短的單鏈寡核苷酸片段，經(jīng)過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選(system evolution of ligands by exponential enrich-ment，SELEX)得到，通過折疊成多種特定的三維空間立體結(jié)構(gòu)與靶分子特異性結(jié)合，靶分子范圍十分廣泛，包括金屬離子、生長(zhǎng)因子、抗體、蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸，甚至細(xì)菌、細(xì)胞等[3]。量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)是一種物理形狀近似球形的新型熒光納米晶體，直徑一般小于10 nm，具有優(yōu)越的物理化學(xué)性質(zhì)，例如體積小、熒光壽命較長(zhǎng)、抗光漂白能力強(qiáng)、寬的激發(fā)譜和窄的發(fā)射譜、較好的光源穩(wěn)定性[4]。這些特性使得量子點(diǎn)成為體內(nèi)癌細(xì)胞診斷、生物成像、腫瘤細(xì)胞靶分子標(biāo)記以及基因表達(dá)過程示蹤的強(qiáng)有力工具[5-6]。

前期研究顯示核酸適配體W3能夠特異性識(shí)別多種轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞，并且具有高親和能力[7]。基于W3的靶向功能與量子點(diǎn)優(yōu)越的特性，本研究將W3與量子點(diǎn)偶聯(lián)制備量子點(diǎn)探針，用于乳腺癌細(xì)胞的靶向成像，并通過對(duì)臨床患者組織標(biāo)本的成像分析探討其在臨床應(yīng)用上的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源：60例乳腺癌組織芯片(上海芯超科技有限公司)(表1)。

1.1.2 細(xì)胞及試劑：人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和人胚腎細(xì)胞系HEK293(上海中科院細(xì)胞庫(kù))；鏈霉親和素標(biāo)記的量子點(diǎn)QD605(quantum dots-streptavidin，QD-SA)(武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone公司)；牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)(Biosharp公司)；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚 (4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI)(Tiangen公司)；核酸適配體W3序列和原文庫(kù)(Library，W3篩選時(shí)的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù))序列(上海生工生物公司)(表2)。

表1 乳腺癌組織芯片Table 1 Breast cancer tissue chip

表2 實(shí)驗(yàn)所用DNA序列Table 2 DNA sequences used in experiments

*N refers to a random sequence.

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)核酸適配體W3與細(xì)胞的特異性結(jié)合：合成5’端6-羧基熒光素(6-carboxy-fluorescein, FAM)標(biāo)記的核酸適配體W3和Library。分別取對(duì)數(shù)增殖期人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和人胚腎細(xì)胞系HEK293，用無(wú)酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液；1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入FAM-W3或FAM-Library(終濃度為250 nmol/L)，分別與細(xì)胞4 ℃孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清；PBS洗滌兩次，加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)每組細(xì)胞的FAM熒光信號(hào)。熒光信號(hào)越強(qiáng)，表示結(jié)合能力越強(qiáng)。

1.2.2 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)量子點(diǎn)偶聯(lián)的適配體W3(aptamer W3-quantum dots， W3-QDs)對(duì)不同細(xì)胞系的結(jié)合情況：合成5’端生物素(biotin)標(biāo)記的核酸適配體W3和Library。取對(duì)數(shù)增殖期人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和人胚腎細(xì)胞系HEK293，無(wú)酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液。1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入Biotin-W3或Biotin-Library(終濃度為250 nmol/L)，分別與細(xì)胞4 ℃孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入QD-SA室溫孵育20 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清；PBS洗滌2次，加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)每組細(xì)胞的QD熒光信號(hào)。利用FlowJo軟件計(jì)算每組的熒光信號(hào)值，并與FAM-W3組比較熒光信號(hào)值大小，值越大，信號(hào)越強(qiáng)，說明靈敏度越高。

1.2.3 W3-QDs探針對(duì)乳腺癌組織的靶向成像：組織芯片60 ℃烤片4 h，100%二甲苯脫臘2次×15 min；100%乙醇2次×10 min，95%、90%、85%、75%和50%乙醇各5 min；PBS清洗3次×5 min；切片置于0.01 mol/L檸檬酸鈉修復(fù)液中高壓修復(fù)100 s，自然冷卻至室溫；PBS洗3次×5 min；加入封閉液(洗滌緩沖液+1% BSA+10% FBS)4 ℃孵育60 min；加入Biotin-W3 4 ℃過夜孵育；PBS洗3次×5 min，加入QD-SA室溫孵育20 min；PBS洗3次×5 min，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察芯片組織上的紅色QD熒光信號(hào)并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 核酸適配體W3的結(jié)合特性

與Library相比，核酸適配體W3與MDA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-468細(xì)胞的熒光結(jié)合峰發(fā)生了明顯的右移，說明核酸適配體W3與這兩種細(xì)胞均有不同程度的結(jié)合，而與MCF-7細(xì)胞和HEK293細(xì)胞的熒光結(jié)合峰幾乎沒有發(fā)生移動(dòng)，即沒有發(fā)生結(jié)合(圖1)。

2.2 W3-QDs與乳腺癌細(xì)胞的特異性結(jié)合

W3-QDs與乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468孵育后的熒光強(qiáng)度明顯高于FAM-W3(P<0.05)(圖2)，而對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和人胚腎細(xì)胞系HEK293仍然沒有明顯的熒光信號(hào)。與FAM-W3相比，W3-QD具有更高的靈敏度。

圖1 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)核酸適配體W3與不同細(xì)胞系的結(jié)合Fig 1 Flow cytometry detection of the binding of aptamer W3 to various cell lines

*P<0.05 compared with FAM-W3 group圖2 W3-QDs與FAM-W3對(duì)細(xì)胞結(jié)合熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fig 2 Statistical analysis based on fluorescence intensity of

2.3 W3-QDs對(duì)乳腺癌組織的結(jié)合特性

組織芯片上的4例健康人乳腺組織、5例乳腺癌癌旁組織和2例乳腺良性腫瘤均沒有觀察到明顯的QD特異性紅色熒光，而其余乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶上均可以觀察到不同熒光信號(hào)強(qiáng)度的QD紅色熒光，且紅色熒光主要分布在細(xì)胞膜表面。此外，乳腺癌轉(zhuǎn)移灶組織上的熒光信號(hào)明顯高于原發(fā)灶組織上的熒光信號(hào)(圖3)。

2.4 W3-QDs的熒光強(qiáng)度與患者臨床特征的關(guān)系

根據(jù)乳腺癌組織上QD紅色熒光信號(hào)強(qiáng)度，將其分為4個(gè)等級(jí)(圖4)。0期～2B期的乳腺癌組織上觀察到的熒光信號(hào)較弱甚至沒有，陽(yáng)性率為52.9%(9/17)，其中9例的陽(yáng)性中7例是弱陽(yáng)性(1+)，2例是中等陽(yáng)性(2+)。而惡性程度較高的3A～4期的乳腺癌組織中呈現(xiàn)100%(10/10)的陽(yáng)性率，其中4例為弱陽(yáng)性(1+)，4例為中等陽(yáng)性(2+)，2例為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)(表3)。11例轉(zhuǎn)移灶組織中只有2例沒有觀察到熒光信號(hào)，陽(yáng)性率可達(dá)81.8%(9/11)(表4)。

2.5 W3-QDs對(duì)乳腺癌患者淋巴結(jié)的結(jié)合特性

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一種常見的乳腺癌惡化病理指標(biāo)。陰性淋巴結(jié)組織上幾乎沒有觀察到明顯的QD紅色熒光，而陽(yáng)性淋巴結(jié)組織上可以觀察到強(qiáng)烈的QD紅色熒光(圖5)，具體乳腺癌淋巴結(jié)組織熒光信號(hào)強(qiáng)度見(表5)，陽(yáng)性淋巴結(jié)組織上的陽(yáng)性率可達(dá)83.3%(5/6)。

3 討論

與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)影像方法CT、 PET和MRI等進(jìn)行診斷相比，分子影像技術(shù)由于采用對(duì)疾病相關(guān)標(biāo)志物具有特異性識(shí)別能力的靶向分子探針進(jìn)行成像，可以滿足重大疾病如腫瘤的早期診斷和準(zhǔn)確分型。

圖3 W3-QDs對(duì)臨床乳腺癌組織的結(jié)合特性Fig 3 Binding properties of W3-QDs to clinical breast cancer tissue (×400)

圖4 W3-QDs在乳腺癌組織上不同熒光程度的分級(jí)Fig 4 Different degrees of fluorescence of W3-QDs on breast cancer tissue (×400)

表3 乳腺癌原發(fā)灶組織上的熒光信號(hào)強(qiáng)度Table 3 Intensity of fluorescence signaling on primary breast cancer tissue

表4 乳腺癌轉(zhuǎn)移灶組織上的熒光信號(hào)強(qiáng)度

表5 乳腺癌淋巴結(jié)組織熒光信號(hào)強(qiáng)度

圖5 W3-QDs對(duì)乳腺癌患者淋巴結(jié)的結(jié)合特性Fig 5 Binding specificity of W3-QDs to lymph nodes in breast cancer patients (×400)

目前單克隆抗體是臨床常用的組織免疫熒光染色探針，但是抗體制備復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力、分子質(zhì)量大、具有免疫原性等缺點(diǎn)，限制了其適用范圍[8]。核酸適配體作為“化學(xué)抗體”，在臨床組織標(biāo)本的診斷方面具有極為廣闊的應(yīng)用前景[9]。有研究表明[10]，在對(duì)淋巴組織進(jìn)行成像分析時(shí)，靶向CD30的核酸適配體比抗體具有更高的靈敏度和特異性。本研究利用前期Cell-SELEX篩選獲得的核酸適配體W3對(duì)臨床乳腺癌組織進(jìn)行靶向成像分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核酸適配體W3具有良好的腫瘤特異性，有可能成為乳腺癌診斷的分子探針。進(jìn)一步對(duì)腫瘤組織標(biāo)本的熒光信號(hào)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與腫瘤惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)，表現(xiàn)為惡性程度高的或者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，熒光信號(hào)更強(qiáng)，這提示核酸適配體W3可以作為惡性乳腺癌的靶向成像分子探針。

近年來(lái)，具有特殊物理化學(xué)性質(zhì)的功能性納米材料如金納米[11]、磁性顆粒[12]，由于其獨(dú)特的信號(hào)發(fā)生和增強(qiáng)效應(yīng)，能夠幫助提高腫瘤診斷的靈敏度和穩(wěn)定性。其中，由于具有優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，QD已成為新型的熒光探針，被廣泛用于生物化學(xué)傳感與生物醫(yī)學(xué)成像等領(lǐng)域[13]，特別是在腫瘤成像應(yīng)用研究中，多種熒光QD已被用作腫瘤標(biāo)志物識(shí)別探針，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞及體內(nèi)腫瘤的特異性檢測(cè)以及靶向成像[14]。前期研究[4]采用基于量子點(diǎn)的免疫組織化學(xué)(quantum dots based immunohistochemistry，QD-IHC)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與常規(guī)IHC相比，QD-IHC顯示出更高的檢出率和靈敏度。此外，QD-IHC的操作更簡(jiǎn)單、結(jié)果分析更客觀和優(yōu)越的可重復(fù)性使其成為臨床實(shí)踐中更有吸引力的替代方案。本研究中，基于核酸適配體易于功能性修飾的特性，偶聯(lián)QD形成量子點(diǎn)分子探針(W3-QDs)，結(jié)果顯示，W3-QDs對(duì)腫瘤細(xì)胞的成像效果明顯強(qiáng)于熒光基團(tuán)探針(FAM-W3)，具有更強(qiáng)的熒光信號(hào)，說明利用W3-QDs進(jìn)行靶向成像時(shí)具有更高的靈敏度。當(dāng)W3-QDs對(duì)乳腺癌組織進(jìn)行成像分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，W3-QDs靶向不同時(shí)期的乳腺癌組織時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度分級(jí)明顯，還可以區(qū)分乳腺癌患者的陽(yáng)性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)。

綜上所述，以核酸適配體W3偶聯(lián)量子點(diǎn)制備量子點(diǎn)探針W3-QDs，實(shí)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系和臨床乳腺癌組織的靶向成像，有可能為乳腺癌的早期診斷提供新的分子工具。