circRNA_0008259通過抑制miR-423-5p調(diào)控瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)

楊馨悅，熊一峰，張淑蘭，張志彬，彭亞婷

瘢痕疙瘩是一種皮膚纖維化疾病，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞過度增殖以及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成增多[1]。雖然瘢痕疙瘩被歸類為良性皮膚疾病，但經(jīng)常表現(xiàn)出與惡性腫瘤相似的生物學(xué)特征，如過度增殖、抗凋亡和侵襲[2]。盡管其治療方法包括手術(shù)加放療、皮損內(nèi)藥物注射、冷凍等，但這些方法仍具有局限性[3]。目前瘢痕疙瘩特別是大面積瘢痕疙瘩的治療仍具有挑戰(zhàn)性。環(huán)狀RNA(circRNAs)是一類廣泛存在的具有調(diào)控作用的內(nèi)源性RNA，在多種生物過程及人類疾病中發(fā)揮著重要作用[4]。筆者前期研究[5]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)環(huán)狀RNA circRNA_0008259可顯著下調(diào)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloid fibroblasts, KFs)中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，但其具體調(diào)控機(jī)制不明確。為此，本研究將進(jìn)一步探討circRNA_0008259調(diào)控Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 KFs來自原代培養(yǎng)的人皮膚瘢痕疙瘩組織，具體方法見前期發(fā)表的文章[5]。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2、含10%胎牛血清(Gibco)和100 μg/mL青霉素-鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Gibco，Gaithersburg，USA)中培養(yǎng)。質(zhì)粒構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以分離高表達(dá)hsa_circ_0008259的穩(wěn)定KFs，將hsa_circ_0008259 cDNA合成并克隆到CMV載體和慢病毒中(上海吉凱)。根據(jù)說明書，人類KFs感染慢病毒的倍數(shù)為50。所有細(xì)胞在2周后用1 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行篩選。使用實時定量PCR(qRT-PCR)在轉(zhuǎn)染后48 h確認(rèn)過表達(dá)效率。

1.2總RNA提取與qRT-PCR 使用TRIzol試劑(Invitrogen)從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，Madison，USA)和隨機(jī)引物(Promega)合成用于qPCR分析的cDNA。miRNA檢測使用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊)?；虮磉_(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為管家基因GAPDH，miRNA表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為U6。每個樣品在LightCycler 480實時PCR系統(tǒng)(羅氏)上分析一式三份。本研究中使用的miRNA引物購自通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司，引物序列如下：miR-423-5p上游5′-GTGAGGGGCAGAGAGCGA-3′，下游5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；miR-451a上游5′-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTAC-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA GTTGAGCTTACAG-3′；miR-889-3p上游5′-GCGCGT TAATATCGGACAAC-3′，下游5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；miR-200-5p上游5′-GCGCATCTTACTGGGCAGC-3′，下游5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；miR-676-3p上游5′-CGCGCTGTCCTAAGGTTGT-3′，下游5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3RNA高通量測序 使用VAHTSTM總RNA序列(H/M/R)構(gòu)建RNA樣本的cDNA文庫。在RiboBio Co.Ltd.的IIIumina HiSeqTM2500上對cDNA文庫進(jìn)行配對和測序。分析了樣本間的miRNA表達(dá)聚類和差異表達(dá)。根據(jù)差異倍數(shù)(| log2(倍數(shù)變化)|≥2)和顯著性水平(P<0.05)選擇樣本間差異表達(dá)的miRNA。層次聚類分析(| log2(倍數(shù)變化)|≥2)分析不同實驗參數(shù)下差異轉(zhuǎn)錄的miRNA的表達(dá)。在GO和KEGG數(shù)據(jù)庫上對差異表達(dá)的miRNA的親本基因進(jìn)行了顯著的富集分析。

1.4蛋白質(zhì)提取和酶解 樣品從-80 ℃取出，分別加入4倍體積裂解緩沖液(8 mmol/L尿素，1%蛋白酶抑制劑)，超聲裂解。4 ℃，12 000 g離心10 min，去除細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，利用BCA試劑盒(上海碧云天)進(jìn)行蛋白濃度測定。各樣品蛋白取等量進(jìn)行酶解，加入適量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用裂解液將體積調(diào)整至一致。緩慢加入終濃度20% TCA，渦旋混勻，4 ℃ 沉淀2 h。4 500 g，離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的丙酮洗滌沉淀2～3次。晾干沉淀后加入終濃度200 mmol/L的TEAB，超聲打散沉淀，以1∶50的比例(蛋白酶：蛋白，m/m)加入胰蛋白酶，酶解過夜。

1.5TMT/iTRAQ標(biāo)記 胰蛋白酶消化后，肽通過Stratx C18 SPE柱(Phenomenex)脫鹽并真空干燥。肽在0.5 mol/L TEAB中重組，并根據(jù)TMT試劑盒/iTRAQ試劑盒說明書進(jìn)行處理，將一單位TMT/iTRAQ試劑解凍并在乙腈中重新組合。然后，將肽混合物在室溫下培養(yǎng)2 h，并通過真空離心匯集、脫鹽和干燥。

1.6生物信息學(xué)分析

1.6.1GO富集分析 費歇爾精確雙端檢驗方法(Fisher′s exact test)被用于檢驗差異表達(dá)的蛋白/miRNAs，以鑒定到的蛋白//miRNAs為背景，Gene Ontology(GO)富集檢驗P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6.2通路富集分析 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫被用于通路的富集分析。費歇爾精確雙端檢驗方法被用于檢驗差異表達(dá)蛋白/miRNAs在以鑒定到的蛋白/miRNAs為背景，通路富集檢驗P<0.05被認(rèn)為是顯著的。最后根據(jù)KEGG網(wǎng)站通路層級分類方法將這些通路進(jìn)行分類。

1.6.3基于蛋白功能富集的聚類分析 基于不同分組的差異表達(dá)蛋白/miRNA功能富集的聚類分析用于研究其在特定功能(GO，KEGG通路)上存在的潛在聯(lián)系和差異。首先收集所用蛋白/miRNA分組富集到的功能分類信息和對應(yīng)的富集P值，然后篩選出至少在一個蛋白/miRNA分組中為顯著富集(P<0.05)的功能分類。

1.6.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 將不同比較組中篩選得到的差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)庫編號或蛋白序列，通過與STRING(v.10.5)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫比對后，按照confidence score >0.7 (high confidence)提取得到差異蛋白互作關(guān)系。然后通過R package “networkD3”工具對差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化展示。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測 通過PCR分別擴(kuò)增出可與miR-423-5p結(jié)合的circRNA_0008259序列以及包含miR-423-5p靶區(qū)的CTSD基因的3′UTR序列，將獲得的序列分別插入pmirGLO質(zhì)粒(日本Promega公司)以獲得pmirGLO-circ-WT雙熒光素酶載體以及CTSD-3′UTR-WT雙熒光素酶報告載體。并分別構(gòu)建pmirGLO-cir突變型載體(pmirGLO-cir-Mut)和CTSD-3′UTR的突變型載體(CTSD-3′UTR-Mut)。將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板中，以達(dá)到約70%的融合。將miR-423-5p類似物和CTSD-3′UTR-WT(pmirGLO-circ-WT)載體或者CTSD-3′UTR-Mut(pmirGLO-cir-Mut)載體共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因分析試劑盒(BioVision，Milpitas，CA，USA)在光度計上測定螢火蟲和腎素?zé)晒馑孛富钚浴?/p>

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 對于本研究中進(jìn)行的實驗，至少進(jìn)行了3次獨立的實驗。通過Student′t檢驗分析實驗組之間的統(tǒng)計學(xué)顯著性，并確定P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1瘢痕疙瘩成纖維中受circRNA_0008259調(diào)控的miRNAs circRNA_0008259過表達(dá)組與對照組相比，共有48個差異表達(dá)的miRNAs, 其中上調(diào)的20個，下調(diào)的28個(圖1，倍數(shù)≥2，P<0.05)。GO聚類分析顯示差異表達(dá)的miRNA參與多種生物過程，包括胞漿功能、Ⅰ型膠原蛋白等。KEGG通路分析表明，這些差異表達(dá)的miRNAs參與一些生物通路，包括代謝通路、癌癥相關(guān)通路等(圖2)。

Note:The heatmap of hierarchical grouping shows the miRNA expression profile;the red shows up-regulated miRNAs and the blue shows the down-regulated miRNAs.圖1 circRNA_0008259過表達(dá)與對照組之間差異表達(dá)miRNAs的表達(dá)譜Fig.1 circRNA expression profile of differentially expressed miRNAs between circ0008259-overexpression group (circ0008259-OV) and control group (NC)

Note:*P<0.05, **P<0.01. The top 20 GO enrichmentterms,the parental genes of differentially expressed miRNAs were analysed by GO assessment (|Fold Change| ≥ 2, P< 0.05); qRT-PCR was used to detect the expression level of 6 candidates miRNAs; The top 20 KEGG pathways enrichment terms,KEGG pathways assessment was conducted on the parental genes of differentially expressed miRNAs (|Fold Change| ≥ 2, P < 0.05); Double luciferase reporter assays (DLR), miR-423-5p (miR-423-5p mimics), miR control (miR-423-5p control)圖2 circRNA_0008259過表達(dá)與對照組之間差異表達(dá)miRNAs的生物信息學(xué)分析及qRT-PCR驗證Fig.2 Bioinformatic analyses and qRT-PCR verification of differentially expressed miRNAs between circ0008259-overexpression group (circ0008259-OV) and control group (NC)

2.2對受 circRNA_0008259調(diào)控的下游miRNAs 進(jìn)行驗證 5種miRNA的表達(dá)水平在circRNA_0008259過表達(dá)組中都是下調(diào)的，其中miR-423-5p在過表達(dá)的circRNA_0008259中下調(diào)10.05倍(t=7.70，P<0.01)，miR-889-3p下調(diào)12.93倍(t=7.93，P<0.01), miR-451a下調(diào)1.94倍(t=3.01，P<0.05), miR-200-5p下調(diào)1.85倍(t=3.08，P<0.05), miR-676-3p下調(diào)2.45倍(t=6.22，P<0.01)，見圖2b。鑒于miR-423-5p在circRNA_0008259過表達(dá)后下調(diào)非常顯著，且其在KFs中的含量最豐富。與對照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-423-5p類似物(mimics)和pmirGLO-circ-WT的細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(t=6.07，P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染miR-423-5p類似物和pmirGLO-circ-Mut的細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.38，P>0.05)，見圖2d。

2.3KFs中受circRNA_0008259 調(diào)控的蛋白 總共鑒定出6 571個蛋白質(zhì)，在circRNA_0008259過表達(dá)后，其中倍數(shù)≥1.2倍差異的有103種蛋白，倍數(shù)≥1.3倍差異的有40種蛋白(P<0.05)。在這40種差異表達(dá)的蛋白中，6種表達(dá)下調(diào)，其中包括Ⅰ型膠原蛋白(COL1A1)，34種表達(dá)上調(diào)(圖3a)。

The heatmap shows the protein expression profile of differentially expressed proteins,the red shows up-regulated proteins and the green shows the down-regulated proteins; The differentially expressed proteins were classified into 38 classes by the PANTHER classification system; The KEGG pathways enrichment terms (|Fold Change| ≥ 1.2, P<0.05); The PPI (protein-protein interaction) network圖3 circRNA_0008259過表達(dá)與對照組之間差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.3 Bioinformatic analyses of differentially expressed proteins between circ0008259-overexpression group (circ-OV) and control group (NC)

2.4circRNA_0008259調(diào)控蛋白的生物信息學(xué)分析與驗證 103種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)按照PANTHER分類，被分為38種蛋白質(zhì)類別，其中前5類為核糖體蛋白(9種蛋白質(zhì))、支架/接頭蛋白(4種蛋白質(zhì))、非受體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(3種蛋白質(zhì))、非運動肌動蛋白結(jié)合蛋白(3種蛋白質(zhì))和伴侶蛋白(3種蛋白質(zhì))，見圖3b。此外，KEGG途徑分析顯示，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與一些基本的生物途徑，包括蛋白的消化和吸收、核糖體以及癌癥相關(guān)通路等(圖3c)。103個差異表達(dá)蛋白中有38個參與了STRINTG數(shù)據(jù)庫中的PPI網(wǎng)絡(luò)，在功能上與代謝通路和核糖體有關(guān)(圖3d)，提示許多受circRNA_0008259調(diào)控的蛋白質(zhì)傾向于相互作用并共同發(fā)揮其功能。與對照組相比，在circRNA_0008259過表達(dá)組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的有6種(CTSD、PFN1、PRDX5、COL1A1、SLC1A5和SRI)，見表1。

表1 PRM法驗證circRNA_0008259過表達(dá)組(circ-OV)與對照組(NC)之間的差異表達(dá)蛋白Tab.1 Validation of differentially expressed proteins between circ0008259-overexpression group (circ-OV) and control group (NC) using PRM method

2.5預(yù)測并驗證miR-423-5p的下游靶基因 經(jīng)iTRAQ和PRM驗證的6種蛋白中，CTSD(Cathepsin D，組織蛋白酶D)具有能與miR-423-5p結(jié)合的位點(圖4a)。與對照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-423-5p類似物和CTSD-3′UTR-WT的細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(t=3.90，P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-423-5p和CTSD-3′UTR-Mut的細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.08，P>0.05)，見圖4b。這些結(jié)果表明，miR-423-5p可直接靶向結(jié)合CTSD基因的3′UTR端。

Note:*P<0.05. The binding sites of miR-423-5p with its target gene was predicted by targetscan software; Double luciferase reporter assays (DLR)，miR-423-5p (miR-423-5p mimics), miR Control (miR-423-5p control圖4 miR-423-5p下游耙基因的生物信息學(xué)預(yù)測及DLR驗證Fig.4 The target gene of miR-423-5p was predicted by bioinformatic method and verified by DLR

3 討論

circRNA被認(rèn)為可通過“海綿吸附”miRNA，從而抑制miRNA的功能以起到調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能的作用[6]。本研究首先采用RNA測序的方法篩選出受circRNA_0008259調(diào)控的miRNAs，然后通過qRT-PCR驗證，證實miR-423-5p在circRNA_0008259過表達(dá)后明顯下調(diào)，且含量豐富，故其最可能受circRNA_0008259調(diào)控，并通過DLR證實circRNA_0008259與miR-423-5p的結(jié)合。接著，采用基于TMT/iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選出受hsa_circ_0004872調(diào)控的蛋白，并使用PRM法進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果與iTRAQ一致，說明檢測結(jié)果的可靠性。最后結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果及生物信息學(xué)軟件預(yù)測CTSD可能為miR-423-5p的下游靶點，并通過DLR證實。以上研究結(jié)果提示過表達(dá)hsa_circ_0004872可能通過抑制miR-423-5p，從而上調(diào)CTSD，最終下調(diào)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)。

有研究報道m(xù)iR-423-5p在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。例如：研究[7]證實miR-423-5p通過抑制ING-4在膠質(zhì)瘤組織中作為癌基因發(fā)揮作用，并提示其對膠質(zhì)瘤具有治療潛力?？谇击[狀細(xì)胞癌術(shù)后唾液樣本中觀察到miR-423-5p表達(dá)顯著降低，提示其可能的癌癥特異性來源，miR-423-5p特別有希望用于口腔鱗狀細(xì)胞癌高危人群的篩查/隨訪，并有助于術(shù)前預(yù)后評估[8]。還有研究[9]發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的外泌體miR-423-5p通過TGF-β信號通路靶向GREM2，促進(jìn)前列腺癌的化療抵抗。筆者前期研究已經(jīng)證實hsa_circ_0004872可調(diào)控KFs細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，且本研究發(fā)現(xiàn)miR-423-5p在hsa_circ_0004872過表達(dá)后顯著下調(diào)，故提示其可能對KFs的調(diào)控起作用。

瘢痕疙瘩被認(rèn)為是一種具有腫瘤傾向的疾病[10]。雖然瘢痕疙瘩由于缺乏自發(fā)發(fā)生和轉(zhuǎn)移而未被常規(guī)歸類為真正的腫瘤，但經(jīng)常表現(xiàn)出各種癌癥樣特征，如不受控制的增殖、浸潤周圍組織以及缺乏自發(fā)消退的能力[11]。這種特征與瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞增生以及產(chǎn)生過多的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白有關(guān)[10]。目前的研究[12-13]已經(jīng)證實Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白增多是瘢痕疙瘩形成的重要環(huán)節(jié)，瘢痕疙瘩組織中大量Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白沉積。瘢痕疙瘩切除后立即注射曲安奈德(治療瘢痕疙瘩的一線藥物)可誘導(dǎo)Ⅰ型膠原蛋白基因表達(dá)下調(diào)。瘢痕疙瘩基質(zhì)中最初過度產(chǎn)生的Ⅲ型膠原被Ⅰ型膠原取代，導(dǎo)致后期Ⅰ型與Ⅲ型膠原的比例高達(dá)17∶1[14]。另外研究[15]還發(fā)現(xiàn)，miRNAs等非編碼RNA參與了瘢痕疙瘩Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的調(diào)控。

本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)hsa_circ_0004872后Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平下調(diào)(1.21倍)，而Ⅲ型膠原蛋白水平輕微下調(diào)(<1.2倍，結(jié)果未展示)。結(jié)合miRNA測序及PCR驗證結(jié)果，筆者推測在KFs中，過表達(dá)circRNA_0008259可能通過海綿吸附作用抑制miR-423-5p，進(jìn)而上調(diào)下游的靶基因，最終調(diào)控Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)。采用生物信息學(xué)預(yù)測及結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)方法，推測CTSD是miR-423-5p的下游靶基因，并通過DLR證實了miR-423-5p能與CTSD結(jié)合。

CTSD是一種天冬氨酸蛋白酶，存在于典型的酸液泡室(即內(nèi)體和溶酶體)[16]。CATD通常會導(dǎo)致溶酶體中的蛋白質(zhì)在酸性pH下降解，并在內(nèi)質(zhì)體中形成成熟的活性肽。組織蛋白酶D可以內(nèi)切割天然牛Ⅰ型膠原的鋁鏈，能溶解完整結(jié)締組織纖維中的膠原蛋白。此外，有研究[16-17]報道CTSD在腫瘤轉(zhuǎn)移、神經(jīng)退行性疾病等中也有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)CTSD與乳腺癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。還有研究[17]觀察到反義寡核苷酸和shRNA分別抑制MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中的組織蛋白酶D，能減少其通過基質(zhì)凝膠的侵襲。CTSD在腫瘤中發(fā)揮作用的機(jī)制，包括降解膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)以允許腫瘤細(xì)胞的侵襲[18]。

本研究探討了hsa_circ_0004872影響KFs中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的分子機(jī)制。筆者推測過表達(dá)hsa_circ_0004872通過與miR-423-5p結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)CTSD，最終抑制瘢痕疙瘩Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，為瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制和治療提供線索和手段。然而，后續(xù)還需進(jìn)一步采用挽救實驗等細(xì)胞功能實驗、hsa_circ_0004872與miR-423-5p細(xì)胞內(nèi)共定位、動物實驗等方法進(jìn)一步證實hsa_circ_0004872調(diào)控瘢痕疙瘩Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的機(jī)制。