ROS調(diào)控細(xì)胞自噬在UVA致人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡中的作用

劉汝蘭，毛漢瀟，何淵民，譚自敏，熊霞，譚小琦

長波紫外線(ultraviolet A, UVA)是誘發(fā)多形性日光疹、慢性光化性皮炎、皮膚基底細(xì)胞癌等多種皮膚疾病的重要原因[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)UVA照射皮膚后可以引起表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞的一系列復(fù)雜反應(yīng)。有學(xué)者[2-4]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)UVA可以通過上調(diào)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，但具體環(huán)節(jié)及調(diào)控機制尚不完全清楚。細(xì)胞自噬是真核生物細(xì)胞一種保守的自我降解方式，對實現(xiàn)細(xì)胞代謝、更新細(xì)胞成分、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要的意義。細(xì)胞自噬可以抑制細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞存活；也有研究表明細(xì)胞自噬也可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。目前細(xì)胞自噬在UVA誘導(dǎo)人真皮成纖維細(xì)胞凋亡過程中的作用尚不清楚，ROS與自噬之間的相互作用機制也未厘清。因此，本研究擬明確UVA誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡中細(xì)胞自噬及胞內(nèi)ROS的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料 人皮膚成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblasts, HDF)：來自健康男性包皮環(huán)切術(shù)時的包皮組織。主要試劑：胎牛血清購于巴西Bovogen公司；50 μmol/L3-甲基嘌呤(3-MA)、100 nmol/L雷帕霉素(RAPA)購于中國MCE公司；高糖DMEM、GlutaMAX、NEAA、0.25%胰酶購于美國Gibco公司；DMSO 購于中國碧云天生物技術(shù)公司；FITC Annexin V /PI Apoptosis Detection Kit購于美國BD公司；兔抗人p62多克隆抗體及兔抗人LC3多克隆抗體購于美國CST公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取健康男性包皮環(huán)切術(shù)時的包皮，參照文獻[6]分離培養(yǎng)HDF，培養(yǎng)至第3代凍存，根據(jù)實驗進程需求對HDF解凍復(fù)蘇，培養(yǎng)細(xì)胞至第6～8代用于實驗。

1.2.2建立不同劑量UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞的模型 顯微鏡下觀察到人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至重懸細(xì)胞。調(diào)節(jié)重懸液的細(xì)胞密度約為1.5×105個/mL，均勻接種于6孔板中。待細(xì)胞鋪滿板底約80%時，6孔板盡快轉(zhuǎn)移至紫外線模擬器行UVA照射處理，照射結(jié)束后立即返回細(xì)胞培養(yǎng)工作臺，置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。本實驗小組通過前期探索已成功構(gòu)建出UVA誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的適宜模型。設(shè)置階梯性變化不同的UVA照射劑量和照射后繼續(xù)培養(yǎng)時間，通過檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)UVA劑量增加至8 J/cm2時可同時滿足細(xì)胞凋亡率增加且細(xì)胞活性和細(xì)胞狀態(tài)良好。就繼續(xù)培養(yǎng)時間而言，當(dāng)光照后繼續(xù)培養(yǎng)4 h時，細(xì)胞形態(tài)變化最大，4 h后形態(tài)趨于穩(wěn)定不變。故最終確定最佳照射劑量和時間，即細(xì)胞經(jīng)8 J/cm2UVA照射后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，為后續(xù)實驗提供依據(jù)。

1.2.3細(xì)胞生長狀態(tài)檢測 細(xì)胞隨機分為對照組、UVA組、雷帕霉素(RAPA)組和3-甲基嘌呤(3-MA)組。RAPA組和3-MA組分別加入稀釋后的母液100 nmol/L和50 μmmol/L。除對照組外，其余各組以不同試劑預(yù)處理2 h后按UVA造模步驟用紫外線模擬器以8 J/cm2的UVA進行照光處理。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察RAPA組、3-MA組、UVA組和對照組的成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)情況，并拍照做好記錄。

1.2.4細(xì)胞增殖活性檢測 加入MTT和DMSO在全自動酶標(biāo)儀波長490 nm下測定各孔吸光度(OD值)。

1.2.5細(xì)胞凋亡率檢測 加入Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI后在流式細(xì)胞儀上檢測經(jīng)過處理后細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測 細(xì)胞按步驟接種于6孔板中。按實驗?zāi)康暮蛯嶒灧纸M不同，分別予不同條件干預(yù)。干預(yù)后分別檢測p62、LC3蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1UVA照射對人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果顯示：對照組(未予以UVA照射)、4、8、12、16 J/cm2組細(xì)胞凋亡的百分率分別為(5.22±0.4)%、(6.91±0.37)%、(14.43±3.01)%、(27.93±1.35)%和(32.12±1.65)%。除對照組與4 J/cm2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余各組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=106.61，P<0.01)。與對照組相比，當(dāng)照射劑量≥8 J/cm2，隨著UVA劑量的增加，人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖活性顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著增加，見圖1。隨著UVA劑量的增大，胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞碎裂更多，細(xì)胞回縮變圓，突起變短，細(xì)胞排列間隙增大，胞質(zhì)折光性下降；當(dāng)UVA的劑量為8 J/cm2時，細(xì)胞增殖活性>85%且細(xì)胞狀態(tài)良好；當(dāng)UVA的劑量<8 J/cm2，細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化不明顯；40 J/cm2已經(jīng)完全看不清細(xì)胞輪廓。成纖維細(xì)胞經(jīng)8 J/cm2UVA照射后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后的細(xì)胞形態(tài)變化較大；4 h之后，細(xì)胞維持一定形態(tài)，本實驗不同劑量UVA照射后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后觀察相關(guān)指標(biāo)，見圖2。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.The apoptosis of fibroblasts was detected by flow cytometry;The activity of each group of fibroblasts by MTT assay; Comparison of fibroblasts apoptosis rate group圖1 UVA照射對人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 The effect of UVA irradiation on human fibroblasts apoptosis

2.2UVA致人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡中細(xì)胞自噬的作用 采用RAPA、3-MA分別孵育細(xì)胞2 h，進行8 J/cm2UVA照射后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后在倒置相差顯微鏡下觀察到：RAPA組和UVA組細(xì)胞輪廓清晰，RAPA組細(xì)胞排列較UVA組更緊密，呈火焰狀，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，UVA組漂浮細(xì)胞較RAPA組多。3-MA組細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，漂浮細(xì)胞較UVA組多。細(xì)胞活性從高到低的順序依次是對照組、RAPA組、UVA組、3-MA組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.86，P<0.01)。細(xì)胞凋亡率從高到低的順序依次是3-MA組(20.45±2.14)%、UVA組(15.42±0.77)%、RAPA組(8.62±1.12)%、對照組(5.39±0.74)%，各組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=83.356，P<0.01)，見圖3～4。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.The apoptosis of fibroblasts was detected by flow cytometry; The activity of HSF by MTT assay; Comparison of fibroblasts apoptosis rate圖3 UVA致人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡中細(xì)胞自噬的作用Fig.3 The role of autophagy in UVA-induced human fibroblasts apoptosis

Control; UVA; RAPA; 3-MA圖4 改變自噬水平后成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察 (×200)Fig.4 After UVA irradiation, the morphology of fibroblasts in control group,UVA group,RAPA group and 3-MA group (×200)

2.3UVA照射后人皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化 細(xì)胞經(jīng)8 J/cm2UVA照射后分別于1、2、3、4 h用流式細(xì)胞術(shù)檢測胞內(nèi)ROS水平。與未經(jīng)光照組(即0 h組)相比，光照后繼續(xù)培養(yǎng)1 h檢測到的胞內(nèi)ROS水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.152)，2、3、4 h組的胞內(nèi)ROS水平均升高，各組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=54.724，P<0.01)。且細(xì)胞在4 h內(nèi)隨著繼續(xù)孵育時間的延長，ROS水平逐漸升高，見圖5。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.～ The level of ROS in fibroblasts was detected by flow cytometry; Changes of ROS level in fibroblasts at different time points after UVA irradiation圖5 UVA誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化Fig.5 UVA-induced changes of intracellular ROS in fibroblasts

2.4UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞后ROS對細(xì)胞自噬的調(diào)控作用 Western blot檢測對照組、UVA組和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)處理組的LC3和p62的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62在三組中的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=260.976、1 922.181，P<0.01)。與對照組相比，細(xì)胞經(jīng)UVA照射后LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高，p62表達(dá)降低。給予5 mmol/L抗氧化劑NAC預(yù)處理組的胞內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ比值雖較對照組高，但低于UVA處理組，且其p62的表達(dá)雖低于對照組但高于UVA處理組，見圖6。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.The expression of p62 and LC3 in fibroblasts after different treatments;The expression of intracellular LC3Ⅱ/Ⅰ differences after different treatments; The expression of intracellular p62 differences after different treatments圖6 氧化應(yīng)激對人皮膚成纖維細(xì)胞自噬的影響Fig.6 The effect of oxidative stress on human fibroblasts autophagy

3 討論

UVA照射可深達(dá)皮膚真皮層，給位于真皮層的成纖維細(xì)胞造成不同程度的損傷并可誘發(fā)細(xì)胞的自我防御與修復(fù)[7]。細(xì)胞自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)一種關(guān)鍵的自我防御與修復(fù)過程。研究UVA對成纖維細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)對減緩成纖維細(xì)胞的光損傷甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)胞結(jié)局有重要價值。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)不同劑量UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞后，隨著UVA劑量的增加，對人皮膚成纖維細(xì)胞的損傷呈時間依賴性加重，UVA照射成纖維細(xì)胞后4 h的細(xì)胞形態(tài)變化較大，4 h之后，細(xì)胞卻維持一定形態(tài)。既往有研究[8]發(fā)現(xiàn)UVA誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡是通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)和損傷DNA來實現(xiàn)的，此過程主要發(fā)生在紫外線照射后的4 h內(nèi)[2]。Godar[9]將紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制分為立即或延遲，發(fā)現(xiàn)UVA致細(xì)胞凋亡為立即凋亡，UVB引起的是延遲凋亡。本課題在研究UVA致成纖維細(xì)胞凋亡的過程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化明顯的時間也是4 h，選擇UVA處理后的時間和以往研究發(fā)現(xiàn)的UVA致細(xì)胞凋亡時間一致。

細(xì)胞自噬對細(xì)胞存在的“雙面效應(yīng)”[10]。正常情況下細(xì)胞自噬維持在低水平，當(dāng)胞外營養(yǎng)成分變化[11]、缺血缺氧[12]、生長因子濃度變化和胞內(nèi)出現(xiàn)代謝壓力、細(xì)胞器損害和蛋白質(zhì)折疊錯誤等情況時，自噬水平被上調(diào)以完成對錯誤的修正和適應(yīng)環(huán)境的變化。當(dāng)損傷超出細(xì)胞修正范圍時細(xì)胞自噬則對細(xì)胞起到促凋亡作用。在本研究中，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)及凋亡檢測結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)RAPA組細(xì)胞排列較UVA組更緊密，呈火焰狀，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，UVA組漂浮細(xì)胞較RAPA組多。3-MA組細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞折光性降低，漂浮細(xì)胞較UVA組多。UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡率，RAPA組低，UVA組次之，3-MA組最高。由此可見，采用RAPA誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平上調(diào)可抑制UVA致人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬過程與胞內(nèi)氧化應(yīng)激之間關(guān)系十分密切。一方面，氧化應(yīng)激是影響細(xì)胞自噬的重要因素。許多條件比如饑餓處理[13]或者細(xì)胞外營養(yǎng)物質(zhì)(如葡萄糖、谷氨酰胺、丙氨酸和血清等)被剝奪[11]誘導(dǎo)的ROS升高可以上調(diào)細(xì)胞自噬水平[14-15]。另一方面，細(xì)胞自噬通過直接清除體內(nèi)的受損線粒體并恢復(fù)部分抗氧化酶活性，或者通過間接調(diào)控多條抗氧化信號通路來降低胞內(nèi)氧化水平。如Kim等[16]研究發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼可通過上調(diào)細(xì)胞自噬來減少過氧化氫誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞的氧化損害。盡管眾多研究[17-19]證實抗氧化劑的預(yù)處理的確可降低由刺激因子引起的細(xì)胞自噬，細(xì)胞自噬也通過去除氧化損傷分子和受損細(xì)胞器等途徑來降低細(xì)胞毒性[20]，但氧化應(yīng)激與自噬之間的相互作用機制仍需進一步完善。本研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞經(jīng)UVA照射后，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平增加，LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大，p62表達(dá)降低。給予5 mmol/L 抗氧化劑NAC處理成纖維細(xì)胞后，可顯著降低LC3Ⅱ/Ⅰ比值，增加p62的表達(dá)。LC3Ⅱ/Ⅰ的比值變化及p62的表達(dá)情況常用以評估細(xì)胞自噬水平的變化，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上調(diào)可促進細(xì)胞自噬產(chǎn)生。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞可以促進細(xì)胞凋亡，同時UVA照射可以通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的產(chǎn)生，從而發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)。