荷斯坦牛血漿催乳素濃度遺傳參數(shù)估計(jì)及其與PRL、PRLR和TRH基因關(guān)聯(lián)分析

高 清 胡麗蓉 張海亮 張 帆 楊 圳 林逍然 徐 青 郭 剛 劉巧香 王雅春*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖(家畜)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 2.北京交通大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044； 3.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100029； 4.北京生物種業(yè)創(chuàng)新聯(lián)合體，北京 101206)

催乳素(Prolactin， PRL)，又稱促乳素或泌乳素，是一種單鏈多肽類激素，因最早被發(fā)現(xiàn)與乳腺發(fā)育、乳汁分泌密切相關(guān)而得名[1]。PRL與生物機(jī)體的300多種生物化學(xué)反應(yīng)有關(guān)，包括促進(jìn)乳腺發(fā)育和成熟、維持泌乳、促進(jìn)性腺發(fā)育、參與調(diào)控性腺功能、調(diào)控生殖生理狀態(tài)、促進(jìn)體細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、維持水鹽平衡、維持內(nèi)分泌和新陳代謝及調(diào)控行為等，被稱為“萬(wàn)能激素”[2-4]。

PRL對(duì)奶牛乳腺發(fā)育和泌乳發(fā)揮著重要作用，促進(jìn)乳腺導(dǎo)管及腺細(xì)胞的增殖分裂與發(fā)育成熟，調(diào)控泌乳的啟動(dòng)與維持，調(diào)節(jié)乳汁中蛋白質(zhì)、乳糖和脂肪的生成[5]。一定濃度的PRL可以顯著增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖率，對(duì)細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子、L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、活化蛋白、酪蛋白等的表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)乳脂和乳蛋白的合成有顯著促進(jìn)作用[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，奶牛的胎次、日糧組成、季節(jié)、環(huán)境溫濕度和擠奶刺激等都會(huì)對(duì)血漿PRL濃度產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，血漿PRL濃度在8月、11月和1月之間差異極顯著，在熱應(yīng)激狀態(tài)下顯著升高[9]；二胎和三胎奶牛的血漿PRL濃度顯著高于四胎奶牛[10]；擠奶前的泌乳刺激對(duì)催乳素釋放有促進(jìn)作用[1]。此外，Lupoli等[11]還比較了哺乳奶牛與機(jī)器擠奶奶牛的PRL水平差異，哺乳奶牛的PRL濃度顯著高于機(jī)器擠奶的奶牛。日糧配方也是影響血漿催乳素水平的重要因素，在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)與賴氨酸占日糧的含量與催乳素濃度呈正相關(guān)關(guān)系[12]。

編碼催乳素的基因PRL已經(jīng)被證實(shí)存在于所有的脊椎動(dòng)物中，牛的PRL基因全長(zhǎng)9 388 bp，位于第23號(hào)染色體上，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子[13]。細(xì)胞需要通過(guò)表面的催乳素受體(Prolactin receptor， PRLR)結(jié)合催乳素來(lái)接收信號(hào)，故催乳素受體對(duì)動(dòng)物繁殖和泌乳等各種生理功能也會(huì)產(chǎn)生較大影響。在哺乳動(dòng)物中，催乳素受體至少存在兩種形態(tài)，長(zhǎng)型受體可以通過(guò)JAK2/STAT5 途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性，短型受體則不具備該功能，但短型受體可以與長(zhǎng)型受體結(jié)合形成異二聚體來(lái)抑制長(zhǎng)型受體的活性，從而對(duì)基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。牛的PRLR基因位于第20號(hào)染色體，包含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子[14]。促甲狀腺激素釋放激素(Thyrotropin releasing hormone， TRH)主要作用于垂體，其受體分布于垂體促甲狀腺激素細(xì)胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在PRL分泌細(xì)胞上也有分布，參與調(diào)控促甲狀腺激素和PRL的釋放[15]。研究表明，泌乳奶牛注射一定劑量TRH后，其血清中的PRL濃度會(huì)顯著升高[16]；在體外培養(yǎng)的牛腦垂體前葉細(xì)胞中添加TRH，細(xì)胞中PRL的合成顯著增加[17]。由于催乳素具有豐富的生物學(xué)功能，已有研究對(duì)PRL和PRLR基因和奶牛重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與產(chǎn)奶量、乳脂和乳蛋白等顯著相關(guān)的位點(diǎn)[18-21]。然而，關(guān)于PRL、PRLR和TRH基因多態(tài)性與奶牛PRL濃度的關(guān)系尚未見報(bào)道。

因此，本研究對(duì)北京地區(qū)某規(guī)?；翀?chǎng)的泌乳期荷斯坦牛進(jìn)行血漿PRL濃度測(cè)定，通過(guò)影響因素方差分析、遺傳分析和候選基因關(guān)聯(lián)分析等方法，揭示了不同環(huán)境條件和生理階段下奶牛PRL濃度及其變化規(guī)律，估計(jì)了奶牛血漿PRL濃度的遺傳參數(shù)，并分析了PRL、PRLR和TRH基因與奶牛PRL濃度之間的關(guān)系。本研究為探索牛血漿PRL濃度的遺傳基礎(chǔ)和開發(fā)育種新性狀做出了有益嘗試，為篩選具有重要功能分子標(biāo)記提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體

本研究試驗(yàn)群體來(lái)自北京市某規(guī)?；翀?chǎng)，該牧場(chǎng)飼養(yǎng)的奶牛品種為荷斯坦牛。本研究在7個(gè)不同時(shí)期對(duì)試驗(yàn)牛群進(jìn)行了血液樣品采集，分別為2014年夏季(178頭)、2014年秋季(120頭)、2014年冬季(126頭)、2017年春季(194頭)、2017年夏季(284頭)、2017年秋季(116頭)、2017年冬季(151頭)。試驗(yàn)牛的基本信息(出生日期、產(chǎn)犢時(shí)間、胎次和妊娠狀況等)和日產(chǎn)奶量記錄由牧場(chǎng)提供，系譜數(shù)據(jù)由北京奶牛中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1血樣采集及血漿PRL濃度測(cè)定

采集血樣時(shí)，使用一次性采血針和抗凝采血管采集泌乳期荷斯坦牛尾根靜脈血 20 mL，其中，10 mL血樣3 000 r/min離心15 min，使血漿與血細(xì)胞分離，取上層血漿裝入經(jīng)過(guò)高壓滅菌的1.5 mL離心管中，冷凍保存于-40 ℃，用于測(cè)定PRL濃度。血漿PRL濃度由北京金?？朴缟锟萍加邢薰?北京)測(cè)定，測(cè)定方法為酶聯(lián)免疫法。另外10 mL抗凝血樣用于提取DNA。

1.2.2公牛DNA提取與DNA混池構(gòu)建

選擇70 頭無(wú)親緣關(guān)系或親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的中國(guó)荷斯坦公牛，采用高鹽法提取公牛凍精DNA，經(jīng)DanoDrop2000測(cè)定濃度后，隨機(jī)分為 3 組(20、20和30 頭)，依照凍精基因組DNA的濃度等量混合成3個(gè)池 DNA，于4 ℃保存?zhèn)溆?，種公牛凍精來(lái)源于北京奶牛中心。

1.2.3基因多態(tài)篩查

下載PRL基因(ENSBTAG00000015274)和PRLR基因(ENSBTAG00000025035)外顯子及上下游各2 000 bp 調(diào)控區(qū)，TRH基因(ENSBTAG00000005306)全序列及上下游各2 000 bp調(diào)控區(qū)序列，采用NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)引物。PRL、PRLR和TRH基因分別設(shè)計(jì)了6對(duì)、13對(duì)和9對(duì)引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以混池DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用PCR Mix為金牌Mix(北京擎科生物科技有限公司)，PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含1 μL DNA樣、22 μL PCR Mix及上下游引物各1 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增成功后，將剩余的PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。通過(guò)Chromas 2.4.3軟件查看測(cè)序峰圖及DNAMAN7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，以此判定基因多態(tài)性。

1.2.4母牛DNA提取與基因分型

使用DNA試劑盒(DP318，天根生化科技(北京)有限公司)提取母牛血液DNA，檢測(cè)濃度后調(diào)整至50 ng/μL備用。從篩查到的基因多態(tài)位點(diǎn)中挑選出位于編碼區(qū)域或功能區(qū)域的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)基因分型引物，采用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR基因分型技術(shù)(KASP)對(duì)400頭母牛進(jìn)行分型，由中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)整理

本研究于2014和2017年的不同季節(jié)測(cè)定了北京某規(guī)?；翀?chǎng)472頭荷斯坦泌乳母牛共1 169條的血漿催乳素濃度數(shù)據(jù)，剔除奶?；拘畔⑷笔?shù)據(jù)和各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)法對(duì)應(yīng)的個(gè)體，共保留468頭牛的1 150條數(shù)據(jù)用于催乳素濃度的影響因素分析、遺傳參數(shù)估計(jì)及關(guān)聯(lián)分析。

本研究中，按照血樣采集的年份和季節(jié)(3～5月為春季，6～8月為夏季，9～11月為秋季，12～1月為冬季)，將采樣季節(jié)劃分為7個(gè)水平，分別為2014年夏季、2014年秋季、2014年冬季、2017年春季、2017年夏季、2017年秋季和2017年冬季；將胎次劃分為3個(gè)水平，分別為1胎、2胎和3胎及以上；將泌乳階段劃分為4個(gè)階段，分別為1～100 d(階段Ⅰ，泌乳前期)、101～200 d(階段Ⅱ，泌乳中期)、201～305 d(階段Ⅲ，泌乳后期)、306 d及以后(階段Ⅳ，泌乳末期)；將擠奶狀態(tài)劃分3個(gè)水平，分別為擠奶前、擠奶后和未知。

本研究中，根據(jù)有表型個(gè)體的牛號(hào)，利用北京地區(qū)荷斯坦牛群體的大系譜追溯用于血漿PRL濃度性狀遺傳分析的小系譜，最終本研究所用的系譜文件中包含公牛699頭和母牛2 531頭。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1血漿PRL濃度影響因素分析

使用SAS 9.2軟件的MIXED過(guò)程，對(duì)可能影響血漿PRL濃度的非遺傳因素進(jìn)行方差分析，采用 Bonferronit檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，考慮的因素如模型1所示：

Yijklm=μ+TIMEi+LACTj+STAGEk+ADl+idijklm+eijklm

(1)

式中：Yijklm為血漿催乳素濃度，mIU/L；μ為總體均值；TIMEi為采樣季節(jié)效應(yīng)(i=1～7)；LACTj為胎次效應(yīng)(j=1，2，3)；STAGEk為泌乳階段效應(yīng)(k=1～4)；ADl為擠奶前后效應(yīng)(l=1，2，3)；idijklm是個(gè)體隨機(jī)效應(yīng)，eijklm為隨機(jī)殘差。

1.4.2血漿PRL濃度遺傳分析

基于DMU軟件的DMUAI程序，采用單性狀重復(fù)力模型估計(jì)血漿催乳素濃度的方差組分和遺傳力，保留1.4.1中顯著的非遺傳因素加入模型2，模型中包含的效應(yīng)如下：

Yijkm=TIMEi+LACTj+STAGEk+peijkm+aijkm+eijkm

(2)

1.4.3血漿PRL濃度與基因PRL、PRLR和TRH關(guān)聯(lián)分析

使用SAS 9.2 軟件的MIXED過(guò)程，對(duì)血漿PRL濃度與基因PRL、PRLR和TRH的多態(tài)位點(diǎn)或單倍型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，保留1.4.1中顯著的非遺傳因素加入模型3，采用 Bonferronit檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，模型中包含的效應(yīng)如下：

Yijklm=μ+TIMEi+LACTj+STAGEk+SNPl+idijklm+eijkm

(3)

式中：Yijklm表示血漿催乳素濃度(mIU/L)；TIMEi、LACTj、STAGEk表示的效應(yīng)同模型1；SNPl是基因型效應(yīng)或單倍型組合效應(yīng)；idijklm是個(gè)體隨機(jī)效應(yīng)，eijkm為隨機(jī)殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1 非遺傳因素對(duì)血漿PRL濃度的影響

血漿PRL濃度的描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。本研究中，血漿催乳素濃度最大為371.28 mIU/L，最小為112.9 mIU/L，平均濃度為224.29 mIU/L，變異系數(shù)為20.9%。

表1 泌乳期荷斯坦牛血漿催乳素濃度描述性統(tǒng)計(jì)Table 1 Descriptive statistics of plasma prolactin concentration in lactating Holstein cattle

采用模型1分析了采樣季節(jié)、胎次、擠奶前后和泌乳階段對(duì)奶牛血漿PRL濃度的影響，分析結(jié)果表明，采樣季節(jié)和泌乳階段對(duì)血漿中PRL濃度有極顯著影響(P<0.01)，胎次對(duì)血漿PRL濃度有顯著影響(P<0.05)，而擠奶前后對(duì)血漿PRL濃度無(wú)顯著影響(P>0.05)，各效應(yīng)不同水平最小二乘均值估計(jì)值及多重比較結(jié)果如表2所示。奶牛血漿PRL濃度隨胎次升高而升高，3胎及以上奶牛的PRL濃度顯著高于1胎，2個(gè)水平間相差11.1 mIU/L。在各個(gè)季節(jié)之間，奶牛PRL濃度表現(xiàn)出顯著差異；2014年內(nèi)，夏季的血漿PRL濃度最高，較冬季的PRL濃度高了85.67 mIU/L；2017年內(nèi)，奶牛在春季的PRL濃度最高，夏季次之，2個(gè)季節(jié)均處于較高水平，秋季濃度最低，較春季低了64.23 mIU/L。隨泌乳階段逐漸升高，奶牛血漿PRL濃度也逐漸升高；其中，階段Ⅰ(1～100 d)的PRL濃度顯著低于階段Ⅳ(泌乳天數(shù)在306 d及以后)，兩階段的血漿PRL濃度相差12.67 mIU/L。但在本研究中，奶牛在擠奶之前和擠奶之后的血漿PRL濃度無(wú)顯著差異。

表2 非遺傳因素對(duì)荷斯坦牛血漿催乳素濃度的影響Table 2 Effects of non-genetic Factors on plasma prolactin concentration of Holstein

2.2 血漿催乳素濃度遺傳力估計(jì)

利用單性狀重復(fù)力動(dòng)物模型估計(jì)了血漿PRL濃度的遺傳參數(shù)，血漿PRL濃度的方差組分和遺傳參數(shù)如表3所示。由表3可知，荷斯坦牛血漿PRL濃度是一個(gè)低遺傳力性狀，其遺傳力估計(jì)值為0.02±0.04，重復(fù)力估計(jì)值為0.06。

2.3 基因PRL、PRLR和TRH多態(tài)位點(diǎn)與血漿PRL濃度的關(guān)聯(lián)分析

本研究共對(duì)15個(gè)SNP進(jìn)行了母牛群體的分型，其中PRL基因4個(gè)，PRLR基因3個(gè)，TRH基因8個(gè)，各基因中SNP的rs號(hào)見表4。采用模型3分別對(duì)每個(gè)SNP與奶牛血漿PRL濃度進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，每個(gè)SNP僅保留基因型頻率高于0.03的基因型。結(jié)果顯示，TRH基因的位點(diǎn)rs109144892、rs108991567、rs109468305及rs109330999與血漿催乳素濃度極顯著相關(guān)(P<0.01)，TRH基因的rs137596325位點(diǎn)與血漿催乳素濃度顯著相關(guān)(P<0.05)，其余10個(gè)SNP與血漿催乳素濃度無(wú)顯著相關(guān)，各SNP不同基因型的血漿PRL濃度最小二乘均值估計(jì)值及多重比較結(jié)果如表4所示。

表3 荷斯坦牛血漿催乳素濃度方差組分及遺傳參數(shù)Table 3 Genetic parameters and variance components of plasma prolactin concentration in Holstein

基因PRL中，位點(diǎn)rs108970792為TT基因型的血漿PRL濃度較同位點(diǎn)其他基因型更低，但差異未達(dá)到顯著水平?；騎RH中， rs109144892位點(diǎn)為TT基因型個(gè)體的血漿PRL濃度極顯著高于CT，高出7.02 mIU/L； rs108991567位點(diǎn)為CC基因型個(gè)體的血漿PRL濃度極顯著高于TC，高6.91 mIU/L；rs109468305位點(diǎn)為TT基因型的血漿PRL濃度極顯著高于CT，高7.04 mIU/L；rs109330999位點(diǎn)為AA基因型個(gè)體的血漿PRL濃度極顯著高于TA，高6.95 mIU/L；rs137596325位點(diǎn)為AA基因型個(gè)體的血漿PRL濃度顯著高于A-，高9.27 mIU/L；rs135342429位點(diǎn)為AA基因型個(gè)體的血漿PRL濃度較GG高5.22 mIU/L，但差異未達(dá)到顯著水平。

表4 基因PRL、PRLR和TRH多態(tài)位點(diǎn)與血漿催乳素濃度的關(guān)聯(lián)分析Table 4 Association analysis of PRL, PRLR, and TRH polymorphic loci with plasma prolactin concentration

表4(續(xù))

2.4 基因PRL、PRLR和TRH單倍型與血漿PRL濃度的關(guān)聯(lián)分析

使用Haploview 4.2軟件，采用系譜推斷法分別對(duì)基因PRL、PRLR和TRH的SNP進(jìn)行連鎖不平衡分析(圖1)。本研究中，在基因PRL上確定了一個(gè)單倍型塊，命名為PRL Block，由rs108970792、rs384170723、rs110684599和rs110586822組成；在基因PRLR上確定了1個(gè)單倍型塊PRLR Block，由rs134638792和rs110971500組成；在基因TRH上確定了TRH Block1和TRH Block2 2個(gè)單倍型塊，TRH Block1由 rs137596325和rs381314916組成，TRH Block2由rs109144892、rs42602973、rs108991567、rs109468305和rs109330999組成。各單倍型塊中，單倍型的基因型及其頻率如表5所示。

圖1 PRL、PRLR和TRH基因的SNP連鎖不平衡分析Fig.1 SNP linkage disequilibrium analysis of PRL, PRLR, and TRH genes

表5 基因PRL、PRLR和TRH單倍型的基因型及其頻率Table 5 Genotype and frequency of haplotypes in gene PRL, PRLR and TRH

針對(duì)每個(gè)單倍型塊，僅保留數(shù)據(jù)量大于50的單倍型組合用于關(guān)聯(lián)分析，采用模型3對(duì)基因PRL、PRLR和TRH的4個(gè)單倍型塊進(jìn)行了與血漿PRL濃度的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，單倍型塊PRL Block與血漿PRL濃度無(wú)顯著相關(guān)，單倍型塊PRLR Block與血漿PRL濃度具有顯著關(guān)聯(lián)的趨勢(shì)(P=0.08)；單倍型塊TRH Block1和TRH Block2均與血漿PRL濃度顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，各單倍型塊中不同單倍型組合的血漿PRL濃度的最小二乘均值及多重比較結(jié)果如表6所示。

基因PRLR中，單倍型H2H2的血漿PRL濃度最高，為251.97 mIU/L，較單倍型H2H3(241.87 mIU/L)高10.10 mIU/L?；騎RH的單倍型塊TRH Block1中，H2H2的血漿PRL濃度最高，為251.28 mIU/L，較H1H2(241.66 mIU/L)和H1H3(241.13 mIU/L)分別高9.6和10.15 mIU/L；TRH Block2中，單倍型組合H2H2的血漿PRL濃度顯著高于組合H1H2，高10.04 mIU/L。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，采樣季節(jié)對(duì)奶牛血漿PRL濃度有極顯著影響，在春季、夏季時(shí)奶牛血漿PRL濃度比秋冬季節(jié)更高，奶牛為抵抗春末和夏季的熱應(yīng)激增加了催乳素的分泌。在胡麗蓉等[9]的研究中，在熱應(yīng)激狀態(tài)、非應(yīng)激狀態(tài)和冷應(yīng)激狀態(tài)下，奶牛血漿PRL水平有極顯著差異，且熱應(yīng)激狀態(tài)下血漿PRL濃度顯著高于其他狀態(tài)，這與本研究結(jié)果一致。本研究中，胎次和泌乳階段對(duì)血漿PRL濃度有顯著或極顯著水平的影響，并隨胎次和泌乳階段的推移而逐漸升高。在韓英東等[10]的研究中，泌乳階段對(duì)PRL無(wú)顯著影響，胎次對(duì)泌乳牛血液PRL含量有顯著的影響，但該研究2胎和3胎奶牛的血液PRL含量顯著高于4胎奶牛，與本研究結(jié)果相反。值得注意的是，該研究采用放射免疫法測(cè)定了血液中PRL含量，且該研究的數(shù)據(jù)量小于本研究。

表6 基因PRL、PRLR和TRH單倍型塊與奶牛血漿催乳素濃度的關(guān)聯(lián)分析Table 6 Association analysis of PRL, PRLR and TRH haploblock with plasma prolactin concentration

本研究群體中，共發(fā)現(xiàn)了PRL基因的rs108970792、rs384170723、rs110684599和rs110586822等4個(gè)SNP。通過(guò)基因分型和關(guān)聯(lián)分析，上述4個(gè)SNP與血漿PRL濃度均無(wú)顯著相關(guān)。其中，rs384170723、rs110684599和rs110586822均位于PRL基因的上游區(qū)域，因此本研究推測(cè)這3個(gè)SNP對(duì)PRL基因的表達(dá)無(wú)明顯調(diào)控作用。位點(diǎn)rs108970792位于外顯子5，為同義突變，不改變氨基酸序列。本研究群體中，位點(diǎn)rs108970792的TT基因型的基因型頻率僅為0.04，且該基因型個(gè)體的血漿PRL濃度比其他2種基因型更低。隨著對(duì)同義突變的認(rèn)識(shí)逐漸深入，發(fā)現(xiàn)同義突變會(huì)影響除了蛋白質(zhì)序列外的很多生物學(xué)過(guò)程，比如轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別，mRNA的剪接、折疊和降解，以及蛋白質(zhì)翻譯的起始、效率和準(zhǔn)確性等[22-24]。最新研究表明[25]，在釀酒酵母中，至少75%的同義突變會(huì)顯著損害其適應(yīng)度。同義突變導(dǎo)致生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力下降可能也是rs108970792位點(diǎn)TT基因型個(gè)體在本研究群體中極少的原因。

在PRLR基因上，本研究群體中共發(fā)現(xiàn)rs135164815、rs134638792和rs110971500等3個(gè)SNP。上述3個(gè)位點(diǎn)與血漿PRL濃度均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。其中，rs135164815位點(diǎn)位于PRLR基因的第5外顯子，為錯(cuò)義突變，會(huì)引起第18個(gè)氨基酸由絲氨酸變成天冬酰胺，本研究群體中僅有1頭奶牛該位點(diǎn)為AG基因型。在芬蘭愛(ài)爾夏牛群體中，該SNP位點(diǎn)會(huì)顯著影響奶牛的產(chǎn)奶量、乳蛋白產(chǎn)量和乳脂產(chǎn)量[26]；此外，基因PRLR的變異與牛胚胎存活率、種公牛繁殖力顯著相關(guān)[27-28]。考慮到催乳素在奶牛繁殖和泌乳中扮演的重要作用，我們猜測(cè)rs135164815位點(diǎn)突變可能會(huì)影響催乳素的分泌或信號(hào)傳導(dǎo)，一方面影響奶牛產(chǎn)奶性能導(dǎo)致奶牛被人為淘汰，另一方面影響奶牛繁殖，造成突變個(gè)體適應(yīng)能力降低。位點(diǎn)rs110971500位于PRLR第10外顯子，為同義突變，本研究群體中該位點(diǎn)AA基因型的基因型頻率僅為0.03。本研究還發(fā)現(xiàn)，由同義突變位點(diǎn)rs134638792和內(nèi)含子突變位點(diǎn)rs110971500組成的單倍型塊PRLR Block與血漿PRL濃度存在一定關(guān)聯(lián)性，單倍型組合H2H2的血漿PRL濃度較H2H3高10.10 mIU/L，H2H2組合為位點(diǎn)rs108970792的CC基因型，H2H3組合則是該位點(diǎn)的CA基因型，說(shuō)明rs108970792突變與催乳素的分泌有一定關(guān)系。

在TRH基因上，本研究共發(fā)現(xiàn)rs135342429、rs137596325、rs381314916、rs109144892、rs42602973、rs108991567、rs109468305和rs109330999等8個(gè)SNP。位點(diǎn)rs137596325與血漿PRL濃度顯著相關(guān)，且AA基因型個(gè)體的PRL濃度最高。rs381314916位點(diǎn)位于TRH基因外顯子2上的5’UTR，與血漿PRL濃度無(wú)顯著相關(guān)，本研究群體中該位點(diǎn)的CC基因型的基因型頻率僅為0.04。連鎖不平衡分析中，rs137596325和rs381314916位點(diǎn)共同組成了TRH Block1，并與血漿PRL濃度顯著相關(guān)，單倍型組合H2H2個(gè)體的PRL濃度最高，H1H1次之，H2H2和H1H1組合中均包含位點(diǎn)rs137596325的AA基因型。TRH基因的位點(diǎn)rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999與血漿PRL濃度極顯著相關(guān)，其PRL濃度最高的基因型分別為TT、CC、TT和AA，上述4個(gè)位點(diǎn)與 rs42602973共同組成了單倍型塊TRH Block2，TRH Block2與血漿PRL濃度顯著相關(guān)，單倍型H2H2個(gè)體的血漿PRL濃度最高，H2H3次之；而H2H2、H2H3正是位點(diǎn)rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999血漿PRL濃度最高的基因型與位點(diǎn)rs42602973上2個(gè)高頻基因型的組合，單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析和單倍型組合關(guān)聯(lián)分析相互佐證。有研究表明，促甲狀腺激素釋放激素對(duì)催乳素的分泌起著重要調(diào)控作用[15]，泌乳牛注射TRH的活體試驗(yàn)[16]和體外培養(yǎng)的細(xì)胞試驗(yàn)[17]也證明了該結(jié)論。上述各位點(diǎn)中，rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999位于TRH基因上游，rs137596325位點(diǎn)位于TRH基因下游，已有研究表明[29-30]，基因上下游的序列可能存在與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的調(diào)控元件，具有增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄活性的作用。由此可以推斷，基因TRH中位點(diǎn)rs137596325、rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999的突變可能通過(guò)影響TRH的分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)奶牛催乳素的分泌。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，泌乳期荷斯坦牛的血漿催乳素(PRL)濃度是一個(gè)低遺傳力性狀，受采樣季節(jié)、胎次和泌乳階段的顯著影響。基因PRL和PRLR中未發(fā)現(xiàn)與血漿PRL濃度顯著相關(guān)的SNP；TRH基因的位點(diǎn)rs109144892、rs108991567、rs109468305、rs109330999和rs137596325與血漿PRL濃度顯著相關(guān)。單倍型關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，基因PRLR上的單倍型塊與血漿PRL濃度有一定關(guān)聯(lián)性，基因TRH上的2個(gè)單倍型塊與奶牛血漿PRL濃度顯著相關(guān)。本研究通過(guò)系統(tǒng)的遺傳學(xué)分析獲得了荷斯坦牛血漿PRL濃度的群體特征和遺傳參數(shù)，探究了與血漿PRL濃度分泌相關(guān)基因的多態(tài)性及其與血漿PRL濃度的關(guān)聯(lián)情況，為研究奶牛血漿PRL濃度的遺傳基礎(chǔ)提供參考。