施肥方式對(duì)設(shè)施番茄產(chǎn)量及土壤細(xì)菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)的影響

劉曉梅，蘇文英，紀(jì)偉，梁長(zhǎng)東，任立凱

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

近年來(lái)，由于設(shè)施蔬菜栽培有較高的經(jīng)濟(jì)效益，其栽培面積一直呈上升趨勢(shì)，已成為農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要途徑，在我國(guó)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)化調(diào)整中占據(jù)重要位置。截至2014年，江蘇省設(shè)施蔬菜為主的設(shè)施農(nóng)業(yè)面積達(dá)到75.7萬(wàn)hm2，占耕地面積比重達(dá)16.5%[1]，其中，蘇北設(shè)施蔬菜以產(chǎn)值高的茄果類蔬菜為主，其面積占江蘇65%以上[2]。然而，由于肥料使用過(guò)多、連作與重茬等不合理的種植方式，導(dǎo)致土壤鹽漬化、酸化等問(wèn)題突出，土壤結(jié)構(gòu)被破壞，養(yǎng)分含量失衡，微生物群落結(jié)構(gòu)改變，蔬菜品質(zhì)與產(chǎn)量逐年下降[3]。因此，逐步優(yōu)化施肥方式成為今后設(shè)施蔬菜可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。

土壤微生物作為土壤生態(tài)鏈中的關(guān)鍵組成部分，直接參與土壤結(jié)構(gòu)的形成，推動(dòng)著土壤養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)，在維持土壤生態(tài)功能中扮演著重要角色[4]，其中細(xì)菌在土壤微生物數(shù)量中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，決定著土壤微生物總量的分布，影響著有機(jī)物的分解和轉(zhuǎn)化[5]。設(shè)施蔬菜種植過(guò)程中土壤微生物多樣性、群落組成和結(jié)構(gòu)的變化可以作為土壤受損程度和質(zhì)量變化的重要預(yù)警指標(biāo)，了解土壤微生物及功能群的變化對(duì)揭示設(shè)施蔬菜栽培條件引起的土壤質(zhì)量退化微生物學(xué)機(jī)制及保持設(shè)施土壤可持續(xù)性具有重要意義。

目前，有關(guān)設(shè)施番茄土壤微生物的研究主要圍繞種植模式(套種、輪作)[6-9]、養(yǎng)分吸收[10-11]、管理模式[12]等方面。關(guān)于不同施肥方式對(duì)設(shè)施番茄土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的研究還相對(duì)較少。本研究以不施肥為對(duì)照(CK)，分析了化肥(T1)、中藥渣有機(jī)肥配施化肥(T2)、復(fù)合微生物肥料配施化肥(T3)、生物有機(jī)肥配施化肥(T4)4種施肥方式對(duì)設(shè)施番茄產(chǎn)量的影響，并利用Illumina MiSeq平臺(tái)，對(duì)這4種施肥方式下土壤進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序分析。探討不同施肥方式對(duì)土壤中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化情況，闡明不同施肥方式對(duì)設(shè)施番茄土壤細(xì)菌群落及各類群間的關(guān)系，為本地區(qū)設(shè)施番茄合理施肥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)在江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院東辛試驗(yàn)基地塑料大棚中進(jìn)行。供試土壤基本理化性狀為：pH 7.9，有機(jī)質(zhì)含量19.98 g·kg-1，全氮 1.9 g·kg-1，全磷1.8 g·kg-1，全鉀14.3 g·kg-1。供試作物番茄為粉果，由淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。供試肥料為15%金正大復(fù)合肥(N 15%、P2O515%、K2O 15%)；中藥渣有機(jī)肥含有機(jī)質(zhì)≥45%，N 1.78%、P2O50.92%、K2O 2.63%，由江蘇好徠斯肥業(yè)有限公司提供；25%復(fù)合微生物肥料(N 10%、P2O57%、K2O 8%)含枯草芽孢桿菌0.2億·g-1，有機(jī)質(zhì)≥6%，由江蘇肥之星生物科技有限公司提供；生物有機(jī)肥含巨大芽孢桿菌、固氮類芽孢桿菌、膠凍樣類芽孢桿菌共0.2億·g-1，有機(jī)質(zhì)40%，由揚(yáng)州森大肥業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，T1：每667 m2復(fù)合肥160 kg，T2：每667 m2復(fù)合肥50 kg+中藥渣有機(jī)肥1 000 kg，T3：每667 m2復(fù)合微生物肥料250 kg；T4：每667 m2生物有機(jī)肥1 200 kg；CK：不施肥處理組。每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)，共16個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積為12.6 m2，每個(gè)小區(qū)種植三壟，每壟2行，每行8棵(行間距35 cm，株距30 cm)，完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。開花坐果后每?jī)芍茏贩?次，每667 m2追施復(fù)合肥10 kg,共7次，每667 m2中微量元素肥(順欣N 15%、P2O515%、K2O 30%、TE)10 kg 共7次。

1.3 土壤樣品采集與分析

土壤樣品采集時(shí)間為2019年7月19日，用環(huán)刀取各處理耕層(0～20 cm)土壤樣品，每小區(qū)多點(diǎn)混合采樣，去除植物根系和石塊裝入無(wú)菌袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冰箱保存用于土壤微生物DNA提取。

1.4 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定

于采收期測(cè)定每個(gè)小區(qū)番茄植株產(chǎn)量，并計(jì)算產(chǎn)量。土壤細(xì)菌群落分析由上海派森諾生物科技股份有限公司(上海)完成，采用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)細(xì)菌群落DNA片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測(cè)序。

1.5 計(jì)算和統(tǒng)計(jì)方法

采用QIIME進(jìn)行土壤細(xì)菌群落相關(guān)指標(biāo)分析；采用Excel 2012軟件制圖；采用SAS 9.0對(duì)番茄產(chǎn)量及土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行顯著性分析；采用 Qiime 軟件計(jì)算Bray-Curtis距離，使用R軟件繪制主坐標(biāo)分析圖，進(jìn)行多樣本比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄產(chǎn)量

從表1可以看出T2、T3、T4處理組番茄產(chǎn)量顯著高于T1和CK處理組，三者之間無(wú)顯著差異。相較于CK處理組，T1、T2、T3、T4分別增產(chǎn)12.1%、35.3%、39.1%、41.5%，其中T4處理組的番茄產(chǎn)量最高，每667 m2為4 628 kg。

表1 不同處理番茄產(chǎn)量

2.2 土壤細(xì)菌群落OTU聚類分析

基于16S rRNA的高通量測(cè)序，共獲得有效序列1 811 453，其中T1處理組樣品平均有效序列數(shù)為113 814，T2處理組樣品平均有效序列數(shù)為126 531，T3處理組樣品平均有效序列數(shù)為136 999，T4處理組樣品平均有效序列數(shù)為120 436。CK處理組樣品平均有效序列數(shù)為106 038，對(duì)每組樣品隨機(jī)抽取91 276條序列進(jìn)行抽平，在0.95相似水平下進(jìn)行聚類，得到每組樣本OTU數(shù)。T1土壤中細(xì)菌群落OTU數(shù)量是10 379，T2土壤中細(xì)菌群落OTU數(shù)量是10 146，T3土壤中細(xì)菌群落OTU數(shù)量是8 811，T4土壤中細(xì)菌群落OTU數(shù)量是10 644，CK土壤中細(xì)菌群落OTU數(shù)量是9 417。各處理共同的 OTU數(shù)為2 055，特有的OTU數(shù)相對(duì)較多，分別為4 636、3 729、3 270、4 509、3 712，占各處理土壤細(xì)菌群落OTU數(shù)量的44.7%、36.8%、37.1%、42.4%、39.4%。

2.3 土壤細(xì)菌Alpha多樣性分析

土壤樣品的Alpha 多樣性結(jié)果見表2。5個(gè)土壤樣本覆蓋率均達(dá)到99.4%以上，說(shuō)明測(cè)序深度較高，基本能覆蓋樣品中所有物種，能夠真實(shí)反映土壤細(xì)菌群落組成。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性主要是由代表OTUs統(tǒng)計(jì)的物種數(shù)、表征菌群豐度的Chao1指數(shù)、進(jìn)化多樣性以及反映菌群多樣性的香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)來(lái)表示。從表2可以看出，T2處理組土壤Chao1指數(shù)、物種數(shù)、進(jìn)化多樣性顯著高于CK處理組；T4處理組的物種數(shù)、進(jìn)化多樣性指數(shù)也顯著高于CK處理組，T1、T3處理組與CK無(wú)顯著差異。

表2 不同處理下土壤細(xì)菌菌群豐度、多樣性指標(biāo)

2.4 土壤細(xì)菌群落的Beta多樣性分析

基于Bray-Curtis距離對(duì)不同施肥處理下土壤成分進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，結(jié)果顯示第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率分別為29.2%和19.3%(圖1)。主坐標(biāo)分析二維圖中不同樣本的距離越近，不同樣本中物質(zhì)組成多樣性越相似。樣本T3、T2和CK距離相近，說(shuō)明兩個(gè)樣本間的物種組成多樣性較為相似。T4、T1與CK的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明T4、T1與CK樣本的細(xì)菌群落多樣性差異較大。

2.5 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

在門水平上，不同施肥方式下土壤樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌從高到低依次為變形菌門Proteobactreia、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、擬桿菌門Bacteroidetes、綠彎菌門Chloroflexi、厚壁菌門Firmicutes(圖2)。與CK相比，各施肥處理中變形菌門相對(duì)豐度均升高；T2、T3、T4處理組中放線菌門的相對(duì)豐度升高；T2、T3處理組中的酸桿菌門、芽單胞菌門的相對(duì)豐度升高；僅T1處理組中厚壁菌門的相對(duì)豐度升高。僅T2處理組中綠彎菌門的相對(duì)豐度升高；T1、T4處理組中擬桿菌門的相對(duì)豐度升高。

圖1 不同施肥處理下土壤細(xì)菌群落的PCoA分析

圖2 門水平上細(xì)菌相對(duì)豐度

在屬水平上，不同施肥方式下土壤樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬基本相似分別為蒼白桿菌屬Ochrobactrum、MND1、Vibrionimonas、芽單胞菌屬Gemmatimonas、RB41、Gaiella、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas、Subgroup10、Iamia(圖3)。與CK相比，各施肥處理中Vibrionimonas、鏈霉菌屬Streptomyces、水沉積物桿菌屬Ilumatobacter的相對(duì)豐度均升高，Gaiella的相對(duì)豐度均降低；T2、T3、T4處理組中Subgroup 10、Haliangium的相對(duì)豐度升高；T1、T3、T4處理組中蒼白桿菌屬、Pelomonas的相對(duì)豐度升高；T2、T3中RB41、芽單胞菌屬、消化螺菌屬Nitrospira、MND1的相對(duì)豐度升高；T2、T4中Iamia、類諾卡氏菌屬Nocardioides、交替赤桿菌屬Altererythrobacter的相對(duì)豐度升高；僅T1中乳酸菌屬Lactobacillus、LachnospiraceaeNK4A136 group、勞爾氏菌屬Ralstonia的相對(duì)豐度升高；僅T3中溶桿菌屬Lysobacter、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas的相對(duì)豐度升高。

圖3 屬水平上細(xì)菌相對(duì)豐度

3 小結(jié)與討論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受植物、微生物與土壤理化環(huán)境互作的影響[13]。本研究分析了不同施肥方式對(duì)設(shè)施番茄產(chǎn)量及土壤細(xì)菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)的影響。從土壤樣品的Alpha多樣性分析結(jié)果可以看出，中藥渣有機(jī)肥、生物有機(jī)肥配施化肥土壤細(xì)菌豐度顯著高于不施肥處理組，與孫家駿等[14]研究結(jié)果相似。這是因?yàn)?，適量施用有機(jī)肥能夠顯著提高土壤中有機(jī)質(zhì)、氮磷鉀等養(yǎng)分含量，有利于微生物繁殖，一定程度上提高了土壤微生物的多樣性，改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[15]。然而，施用化肥以及復(fù)合微生物肥料配施化肥土壤細(xì)菌豐度和多樣性與不施肥處理無(wú)顯著差異，這與蔡杰等[16]的研究一致，其研究發(fā)現(xiàn)，未施肥區(qū)與常規(guī)化肥施肥區(qū)土壤微生物多樣性相似。

大量研究表明，不同施肥方式能夠影響土壤微生物類群的相對(duì)豐度[16-18]。在本研究中，不同施肥方式下土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門基本相似，分別為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門，這與之前的研究結(jié)果相似[19-20]，但各處理中優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度具有一定差異，這說(shuō)明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性受植物種類、土壤類型等因素的影響[16]。各施肥處理土壤中變形菌門相對(duì)豐度均升高，中藥渣有機(jī)肥、復(fù)合微生物肥料、生物有機(jī)肥配施化肥處理組土壤中放線菌門的相對(duì)豐度升高，與王慶等[21]、姜蓉等[22]、靳曉拓等[23]的研究結(jié)果一致。放線菌是一類具有重要生物活性的功能性微生物，它在各種生態(tài)環(huán)境中廣泛存在，能產(chǎn)生種類繁雜和富含生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，還能產(chǎn)生各類酶、有機(jī)酸等，有助于分解有機(jī)物和礦物質(zhì)[24];同時(shí)它具有良好的抗菌活性和耐鹽堿作用[25-26]。中藥渣有機(jī)肥、復(fù)合微生物肥料、生物有機(jī)肥配施化肥通過(guò)提高土壤有益微生物的多樣性，改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，維持土壤微生物穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)番茄生長(zhǎng)，從而增加番茄的產(chǎn)量。本研究中，相較于不施肥處理組，中藥渣有機(jī)肥、復(fù)合微生物肥料、生物有機(jī)肥配施化肥均能顯著提高番茄產(chǎn)量。

基于土壤細(xì)菌群落的 PCoA，發(fā)現(xiàn)不同施肥方式下土壤微生物群落分成兩大類，T3、T2和CK距離相近，說(shuō)明兩個(gè)樣本間的物種構(gòu)成較為相似。T4、T1與其他樣本的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明T4、T1樣本的細(xì)菌群落構(gòu)成與其他樣本差異較大。這說(shuō)明，生物有機(jī)肥配施化肥不僅顯著增加土壤微生物的豐度，還改變了微生物的群落結(jié)構(gòu)；中藥渣有機(jī)肥僅顯著提高了土壤微生物的豐度，其微生物群落結(jié)構(gòu)并無(wú)太大的變化；施用化肥僅改變了土壤微生物群落構(gòu)成，微生物的豐度、多樣性并無(wú)太大變化，這與之前桑文等[27]的研究結(jié)果不同。

綜上所述，不同施肥方式不僅可以影響設(shè)施番茄土壤細(xì)菌的多樣性與相對(duì)豐度，也能在一定程度上改變土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。本研究中，生物有機(jī)肥配施化肥對(duì)設(shè)施番茄的施用效果最好，不僅可以提高番茄產(chǎn)量，還能夠豐富土壤細(xì)菌多樣性，改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，起到改良土壤的作用。