白術種子發(fā)芽關鍵技術及其根腐病模型的構建

胡重九，程麗敏，沈志浩，朱波*

(1.杭州茉鋇特生物科技有限公司，浙江 臨安 311300；2.杭州市臨安區(qū)農業(yè)農村局，浙江 臨安 311399；3.浙江中醫(yī)藥大學 藥學院，浙江 杭州 310053)

白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)為菊科蒼術屬植物，根莖入藥，始載于《神農本草經(jīng)》，主風寒濕痹，死肌痙疸[1]。白術是浙江省道地藥材，為“浙八味”之一，作為補脾益氣藥被廣泛使用，有“十方九用”之稱。白術性溫、味甘、苦，有健脾益氣、止汗、安胎、燥濕利水等功效[2]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，白術具有抗衰老、抗菌、利尿、調節(jié)免疫功能等作用[3]，并對肝臟、食管、直腸等消化系統(tǒng)癌癥也有一定程度的療效[4-5]。

根腐病是白術等根莖類藥材大田栽培主要的病害之一，為土傳性病害，通常是多種致病菌復合侵染引起的真菌性病害?，F(xiàn)有研究表明，白術根腐病主要的致病菌有尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、燕麥鐮孢菌(Fusariumorenaceum)、木賊鐮孢菌(Fusariumequiseti)、半裸鐮孢菌(Fusariumincaruatum)以及立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等。作為一種維管束系統(tǒng)的病害，白術根腐病發(fā)病時受害根部首先呈黃褐色，隨時間推移逐漸變黑而干枯。當病害進一步發(fā)展蔓延到根莖部位后，橫切根莖可看見維管束呈點狀褐色病斑，并繼續(xù)向上部莖稈蔓延，隨后根莖部的須狀根逐漸干枯脫落，根莖變軟失去藥用價值，外皮皺縮呈干腐狀，最終導致植株死亡，造成重大經(jīng)濟損失[6]。

白術在實際生產(chǎn)中多采用無性繁殖，但是無性繁殖具有種芽退化、育種障礙等問題，我們以白術種子為試驗材料，探討了不同基質對白術種子發(fā)芽率的影響。針對鮮有對白術根腐病模型構建的報道，本文以腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、半裸鐮刀菌為白術病原菌，考察不同創(chuàng)傷方式(劃傷、刺傷)、菌種類型(單一菌種、混合菌種)、接種方式(灌根、浸根)等對白術根腐病模型的影響，擬探討穩(wěn)定的白術發(fā)芽技術與根腐病模型，為白術優(yōu)良品種選育及根腐病防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白術種子

從浙江磐安的成熟健康白術植株上采集成熟種子，將種子曬干裝袋后在陰涼干燥避光的玻璃干燥器內保存，挑選顆粒飽滿且無發(fā)黑霉變的白術種子，備用。

1.2 種子催芽試驗

選取120枚種子，用純水洗凈，經(jīng)75%乙醇浸泡5 min后，隨機均分為4組，每組30枚。分別放入4個同樣大小的玻璃皿內，分別用泥土、營養(yǎng)土、濾紙、紗布包裹種子，噴適量無菌水保濕，27 ℃條件下暗培養(yǎng)。觀察記錄種子發(fā)芽生長情況，以胚根生長超過2 cm作為萌發(fā)標準，持續(xù)觀察10 d。

1.3 白術幼苗的培養(yǎng)

當白術種子發(fā)芽生根至3～5 cm時，用鑷子將種子淺播在鋪滿營養(yǎng)土的塑料盆穴中，噴灑少量純水，保持基質濕潤。將播種好的白術苗盆穴四周用支架撐起，套以滅菌袋并封口，保持袋內空間，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為27 ℃，光照10 h·d-1，培養(yǎng)7～10 d。

1.4 病原菌孢子懸浮液的制備

從保存試管中挑取3種白術根腐病病原菌(腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、半裸鐮刀菌，分別依次簡稱為FS、FO、FI)，分別接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，26 ℃暗培養(yǎng)至菌絲長滿平板后，在培養(yǎng)基表面滴加無菌水，用刮刀刮下表面菌絲，紗布過濾。顯微鏡下用血細胞計數(shù)板確認孢子濃度，用無菌水稀釋調節(jié)孢子懸浮液濃度為1×107個·mL-1，即得FO、FI、FS病原菌的孢子懸浮液。取3種病原菌的孢子懸浮液適量且等體積混合，加無菌水稀釋調節(jié)同等濃度，得混合菌液。

1.5 創(chuàng)傷處理

選取24株生長良好，長勢一致(株高為4～5 cm)的白術幼苗，隨機均分為2組，每組12株。分別對其進行針刺(用針刺穿根部)與劃傷(用手術刀劃出深約0.2 mm的傷口)處理，栽種于穴盆后，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為27 ℃，光照10 h·d-1，每隔2 d觀察1次，記錄幼苗死亡率，觀察10 d。

1.6 病原菌侵染

選取120株白術幼苗隨機均分為12組，每組10株，進行侵染試驗：分別為浸根處理(4組)，將4組幼苗用手術刀劃傷根莖后，分別在200 mL尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、半裸鐮刀菌以及混合菌的孢子懸浮液中浸泡5 min；灌根處理(4組)，將幼苗劃傷后，分別用5 mL尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、半裸鐮刀菌、混合菌的孢子懸浮液澆灌根部；劃傷對照(2組)，第1組將幼苗手術刀劃傷根莖后，在無菌水中浸泡5 min，第2組將幼苗手術刀劃傷根莖后，用5 mL無菌水澆灌根部；不劃傷對照(2組)，第1組將健康幼苗在無菌水中浸泡5 min，第2組將健康幼苗用5 mL無菌水澆灌根部。以上所有幼苗處理后，均栽種于營養(yǎng)土穴盆，置于生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為27 ℃，光照10 h·d-1，觀察25 d。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 23.0軟件處理。

2 結果與分析

2.1 不同基質對白術種子發(fā)芽率的影響

不同基質顯著影響白術種子發(fā)芽率，其中紗布條件下發(fā)芽率最高，10 d發(fā)芽率可達96.3%，營養(yǎng)土與濾紙發(fā)芽率其次，10 d發(fā)芽率分別為40.0%與33.3%，而白術在泥土中不能發(fā)芽(表1)。可能是因為紗布透氣性好，保濕能力強且比較柔軟，能與種子充分接觸，所以發(fā)芽率明顯提高且發(fā)芽時間短；營養(yǎng)土透氣性較好但是保濕能力不佳，濾紙保濕效果差，濕度不易控制，導致白術發(fā)芽率較低；泥土可能由于透氣性差，易結塊，導致白術種子無法發(fā)芽。因此，紗布保濕培養(yǎng)催芽是白術種子萌芽的最佳方式。

表1 不同基質條件下白術種子發(fā)芽率

2.2 創(chuàng)傷處理對白術幼苗死亡率的影響

單一劃傷與刺傷處理對白術幼苗均有一定影響，針刺處理影響大于劃傷處理，6 d時劃傷與針刺均出現(xiàn)幼苗死亡，劃傷處理的白術幼苗死亡率為8.3%，針刺處理的白術幼苗死亡率為22.2%。結果表明，劃傷較針刺死亡率低，可用于白術根腐病模型構建。

2.3 不同菌液與施用方式對白術幼苗死亡率的影響

不同菌液與施用方式影響白術幼苗死亡率。從施用方式看，F(xiàn)O、FI以及混合菌處理下，灌根處理較浸根處理發(fā)病率高，而腐皮鐮刀菌FS菌液處理下，7 d后浸根處理發(fā)病率高于灌根處理(表2)。從不同菌液處理看，腐皮鐮刀菌FS孢子懸浮液浸根處理下，白術幼苗發(fā)病最快，死亡率最高，7 d死亡率達90%，10 d幼苗全部死亡；混合菌浸根處理白術幼苗發(fā)病最慢，接種25 d，發(fā)病率僅為60%。

表2 不同菌液浸根與灌根處理對白術幼苗死亡率的影響 單位：%

3 討論

植物種子的萌發(fā)受諸多因素影響，不僅與種子的成熟度、含水量、種內抑制物質等內部因素有關，而且與溫度、水分、光照、濕度等外部環(huán)境條件密切相關[7]。目前，已有諸多學者對于植物種子發(fā)芽關鍵技術進行了探討。如蔣菡[8]曾報道紙床和沙床對水稻種子形成幼苗的影響，試驗表明，紙床上的水稻種子發(fā)芽快，沙床發(fā)出的水稻幼苗壯實。杜世超等[9]以黑龍江北部麥區(qū)的主栽品種龍麥35為試驗材料，分別設定3個水平的溫度(15、20、25 ℃)和相對濕度(80%、85%、90%)，分析了不同溫、濕度處理對成熟期小麥的穗發(fā)芽開始時間、穗發(fā)芽率、發(fā)芽勢、整穗水分變化率和千粒重等指標的影響，發(fā)現(xiàn)15 ℃、濕度90%處理可以顯著加快成熟期春小麥的整穗水分變化、促進穗發(fā)芽進程，提高穗發(fā)芽率、發(fā)芽勢。姜黎等[10]以荒漠植物野榆錢菠菜為材料，研究其發(fā)芽和幼苗生長對不同溫度下模擬干旱脅迫的響應，發(fā)現(xiàn)溫度與干旱及其交互作用對野榆錢菠菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽速率、發(fā)芽勢、幼苗根長和芽長均有顯著影響，推斷25 ℃/10 ℃為野榆錢菠菜種子發(fā)芽最適宜的溫度，與芽長相比，根長更適合作為反映野榆錢菠菜耐旱能力的指標。發(fā)芽率是種子質量檢驗的4項必檢項目之一，是指在規(guī)定的條件和時間內，長出的正常幼苗數(shù)占供檢種子數(shù)的百分率[11-12]。本試驗考察了不同基質對白術種子發(fā)芽率的影響，發(fā)現(xiàn)泥土透氣性差，澆水后易板結，不利于白術種子萌發(fā)；營養(yǎng)土和濾紙透氣性較好但保濕能力較弱，影響白術種子發(fā)芽；紗布透氣性好，有一定吸水性能，能確保體系內水分相對均勻并保持濕度，白術種子發(fā)芽率較高，發(fā)芽速率較快。

根腐病作為針對植物維管束系統(tǒng)進行破壞的一種土傳性病害，被認為是白術產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的主要制約因素之一，由于其能在土壤中長期潛伏，且主要為害根莖，嚴重影響白術產(chǎn)量與品質[13-14]。白術根腐病的病原菌能以厚垣孢子的形態(tài)在土壤中過冬并存活較長時間，根腐病的防治較為困難。在室內條件下，建立白術根腐病模型，可為白術根腐病防治研究提供模型平臺。本試驗結果顯示，將白術幼苗劃傷后，用20 mL濃度為1×107個·mL-1的腐皮鐮刀菌孢子懸浮液浸泡根部5 min，取出，用濾紙吸干多余菌液移栽到新的營養(yǎng)土塑料盆穴內，每日補充水分保證營養(yǎng)土濕潤，即可得到白術根腐病模型。

植物病害的生物防治相比農業(yè)綜合防治、化學物理防治，具有高效、綠色、不易復發(fā)等優(yōu)點。將生物防治技術合理有效地應用到中藥材生產(chǎn)領域中，避免了對生態(tài)環(huán)境的污染，減少農藥施用量，保證藥材安全。與傳統(tǒng)的化學農藥相比，微生物農藥是一種生物源農藥。微生物農藥與化學農藥最大不同之處就是前者主要基于生物與生物之間的生存關系來開展病蟲害防治，穩(wěn)定性突出，長期應用微生物農藥，能夠有效避免害蟲產(chǎn)生抗藥性。微生物農藥對環(huán)境污染較小，同時也不會產(chǎn)生任何的農藥殘留。較為常見的微生物農藥為蘇云金芽孢桿菌，此類菌為抗蟲棉花菌類，主要采用人工方式對此類細菌進行提取并轉移到普通棉花上，促使普通棉花分泌出可以消滅害蟲的蛋白質，實現(xiàn)對病蟲害的有效防治[15-17]。在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)對建立的根腐病模型物理條件，如溫度、土壤濕度、pH等進行綜合考量，在此基礎上，開展植物生防菌篩選試驗，為白術根腐病的生物防治提供試驗依據(jù)，也為其他藥用植物土傳性病害防治提供借鑒。