下調(diào)S100A8表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制

趙瑋瑋，王華，鄭艷莉

1 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科，上海 200090；2 南通市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病隱匿，早期癥狀不典型，多數(shù)患者就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，預(yù)后較差，5年生存率不足30%［1-2］。即使經(jīng)手術(shù)和化療病情得到完全緩解，80%患者在治療后兩年內(nèi)仍有復(fù)發(fā)可能［3］。近年來，隨著生物技術(shù)和分子生物學(xué)不斷發(fā)展，分子靶向治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后的又一腫瘤治療手段。S100鈣結(jié)合蛋白A8（S100A8）屬于S100蛋白家族成員之一，最初發(fā)現(xiàn)其與許多炎癥性疾病有關(guān)［4］，近年發(fā)現(xiàn)S100A8在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中亦發(fā)揮重要作用［5］。有研究報(bào)道，卵巢癌患者血清S100A8蛋白表達(dá)顯著升高，并且其表達(dá)升高與病情進(jìn)展密切相關(guān)［6］。MIRICESCU等［7］研究表明，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展與信號通路異常息息相關(guān)，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路激活能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲并抑制其凋亡。2020年5月—2021年5月，本研究探討了下調(diào)S100A8表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV3，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。S100A8-siRNA、NC-siRNA由美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈。SLAN-96P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀、熒光倒置顯微鏡，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，購自南京菲勒儀器有限公司；DYCP-31DN型蛋白電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司。Lipofectamine2000，購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購自上海兢準(zhǔn)基因醫(yī)學(xué)科技有限公司；MTT試劑盒，購自北京華美生科生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞劃痕檢測試劑盒，購自廣州億寧生物技術(shù)有限公司。兔抗人PI3K、Akt單克隆抗體，購自美國Cell Signaling Technology 公司；GAPDH單克隆抗體，購自上海群己生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將低溫冷藏的SKOV3 細(xì)胞置于37 ℃水浴快速解凍，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，棄上清液。然后加入含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待貼壁細(xì)胞90%以上融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3 傳代。取傳3 代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的SKOV3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取傳3 代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的SKOV3 細(xì)胞，以2.5 × 103個(gè)/孔接種于96 孔板，隨機(jī)分為對照組、空轉(zhuǎn)組、S100A8 組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，然后將96 孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h，按Lipo?fectamine2000 說明，S100A8 組轉(zhuǎn)染S100A8-siRNA，空轉(zhuǎn)組轉(zhuǎn)染NC-siRNA，對照組僅加入轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染36 h，收集細(xì)胞。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格。然后將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 60 min、72 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：S100A8 上游引物5′-GCAACGUCAUUGAA?GUCUATT-3′、下游引物5′-UAGACUUCAAUGAC?GUUGCTT-3′，β-actin 上游引物5′-UUCUCCGAAC?GUGUCACGUTT-3′、下游引物5′-ACGUGACAC?GUUCGGAGAATT-3′。按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s、58 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算S100A8 mRNA相對表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞增殖活性檢測 收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5 × 103個(gè)/mL，接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入5 g/L MTT試劑20 μL，避光孵育4 h；終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 溶液200 μL，振蕩混勻，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀于490 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值。以O(shè)D490值作為細(xì)胞增殖活性。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，以1 ×105個(gè)/孔接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰蛋白酶消化，離心棄上清，收集細(xì)胞沉淀。然后用Binding Buffer 200 μL重懸，依次加入Annexin V-FITC 10 μL、PI 10 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，再加入Binding Buffer 300 μL，1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測 收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，以1 × 104個(gè)/孔接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿孔底后，用1 mL無菌加樣槍頭垂直劃一條直線，PBS沖洗，加入無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于劃痕后0、24 h 倒置顯微鏡下拍照并測量劃痕距離，計(jì)算遷移距離。遷移距離=0 h 劃痕距離-24 h 劃痕距離。以遷移距離代表細(xì)胞遷移能力。

1.7 PI3K、Akt 表達(dá)檢測 ①PI3K、Akt mRNA 表達(dá)檢測。收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格。然后將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 60 min、72 ℃ 5 min。以cDNA 為模板，按實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：PI3K 上游引物5′-GACTC?CAAGATGAAGAAGATGTG-3′、下游引物5′-GAG?CATTCGCAGGTVCAAGCC-3′，Akt 上游引物5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′、下游引物5′-CC?GGAAGTCCATCGTCTCCT-3′，β-actin 上游引物5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′、下游引物5′-GT?CACGCACGATTTCCGCT-3′。按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s、58 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集CT 數(shù)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算PI3K、Akt mRNA 相對表達(dá)量。②PI3K、Akt 蛋白表達(dá)檢測。收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加入含PMSF 的RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。然后加入等體積的上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白20 μg，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，分別加入兔抗人PI3K、Akt、GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG二抗，室溫孵育60 min，ECL發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、顯影。全自動凝膠成像儀拍照，Alpha View 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組S100A8 mRNA 表達(dá)比較 對照組、空轉(zhuǎn)組、S100A8 組S100A8 mRNA 相對表達(dá)量分別為1.00 ± 0.00、0.96 ± 0.03、0.54 ± 0.08。S100A8 組S100A8 mRNA 相對表達(dá)量顯著低于對照組和空轉(zhuǎn)組（P均＜0.05），而對照組與空轉(zhuǎn)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 三組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性比較 見表1。

表1 三組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性比較（±s）

表1 三組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性比較（±s）

注：與對照組同時(shí)間比較，*P＜0.05；與空轉(zhuǎn)組同時(shí)間比較，#P＜0.05；與同組培養(yǎng)24 h 比較，△P＜0.05；與同組培養(yǎng)48 h 比較，▲P＜0.05。

組別細(xì)胞增殖活性培養(yǎng)72 h 0.90 ± 0.07 0.80 ± 0.06 0.40 ± 0.05*#△▲對照組空轉(zhuǎn)組S100A8組培養(yǎng)24 h 0.95 ± 0.04 0.87 ± 0.05 0.69 ± 0.05*#培養(yǎng)48 h 0.92 ± 0.06 0.83 ± 0.03 0.53 ± 0.07*#

2.3 三組細(xì)胞凋亡率比較 對照組、空轉(zhuǎn)組、S100A8 組細(xì)胞凋亡率分別為（4.35 ± 1.33）%、（5.70 ± 1.58）%、（21.35 ± 2.56）%。S100A8 組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組和空轉(zhuǎn)組（P均＜0.05），而對照組與空轉(zhuǎn)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 三組細(xì)胞遷移能力比較 對照組、空轉(zhuǎn)組、S100A8 組細(xì)胞劃痕距離分別為（155.40 ± 8.60）、（153.90 ± 9.14）、（82.05 ± 3.68）μm。S100A8 組劃痕距離顯著低于對照組和空轉(zhuǎn)組（P均＜0.05），而對照組與空轉(zhuǎn)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 三組PI3K、Akt表達(dá)比較 見表2。

表2 三組PI3K、Akt蛋白和mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

表2 三組PI3K、Akt蛋白和mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與空轉(zhuǎn)組比較，#P＜0.01。

組別對照組空轉(zhuǎn)組S100A8組PI3K蛋白1.00 ± 0.00 0.96 ± 0.02 0.54 ± 0.05*#mRNA 1.50 ± 0.08 1.44 ± 0.09 0.84 ± 0.05*#mRNA 2.09 ± 0.03 2.00 ± 0.10 0.98 ± 0.08*#Akt蛋白1.00 ± 0.00 0.96 ± 0.04 0.42 ± 0.05*#

3 討論

卵巢癌是女性惡性腫瘤相關(guān)死亡的第五大原因，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不典型，多數(shù)患者就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，預(yù)后較差，5年生存率不足30%［1-2］。即使經(jīng)手術(shù)和化療病情得到完全緩解，80%患者在治療后兩年內(nèi)仍有復(fù)發(fā)可能［3］。近年來，隨著生物技術(shù)和分子生物學(xué)不斷發(fā)展，分子靶向治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后的又一腫瘤治療手段。因此，探索卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找其分子靶標(biāo)，從而篩選合適的靶向治療藥物，對提高中晚期卵巢癌預(yù)后具有重要意義。

S100蛋白家族是一個(gè)鈣結(jié)合蛋白家族，在體內(nèi)能夠與鈣離子相互作用而發(fā)揮多種生物學(xué)作用［8］。S100A8是S100蛋白家族成員之一，具有組織特異性和細(xì)胞特異性，通常在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。最初發(fā)現(xiàn)S100A8與許多炎癥性疾病有關(guān)［4］，近年發(fā)現(xiàn)其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中亦發(fā)揮重要作用［5］。有研究報(bào)道，胰腺癌組織S100A8表達(dá)顯著高于其癌旁正常組織［9］；在宮頸癌細(xì)胞中下調(diào)S100A8表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為［10］。ICHIKAWA 等［11］將MC38細(xì)胞注射入小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，S100A8敲除小鼠較野生型小鼠移植瘤的發(fā)生率明顯降低，轉(zhuǎn)移灶亦明顯減少。以上研究為S100A8在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，S100A8能夠促進(jìn)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖、遷移和基質(zhì)黏附等生物學(xué)行為，其機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)［12］。CORTESI等［13］研究表明，卵巢癌組織S100A8表達(dá)顯著高于正常卵巢組織。本研究采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)S100A8 表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A8 組S100A8 mRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組和空轉(zhuǎn)組，而對照組與空轉(zhuǎn)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果證實(shí)，該技術(shù)能夠使SKOV3細(xì)胞S100A8表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S100A8組細(xì)胞增殖活性和遷移能力均顯著低于對照組和空轉(zhuǎn)組，細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組和空轉(zhuǎn)組，而對照組與空轉(zhuǎn)組細(xì)胞增殖活性、凋亡率和遷移能力比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，下調(diào)S100A8表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

PI3K/Akt信號通路在真核生物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中普遍存在，具有調(diào)控細(xì)胞周期、參與血管生成及促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作用［14］，是目前研究較多的信號通路之一。目前認(rèn)為，PI3K/Akt信號通路異常激活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。有研究在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路異常激活，并且其異常激活能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［15］。在宮頸癌中PI3K/Akt信號通路處于活躍狀態(tài)，并通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移。當(dāng)卵巢癌細(xì)胞大量增殖時(shí)，PI3K/Akt信號被磷酸化，通過介導(dǎo)下游信號通路mTOR活性，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處遷移［16］。因此，卵巢癌細(xì)胞PI3K/Akt信號通路激活能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S100A8組PI3K、Akt蛋白與mRNA相對表達(dá)量均顯著低于對照組和空轉(zhuǎn)組，而對照組與空轉(zhuǎn)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示下調(diào)S100A8表達(dá)能夠抑制PI3K/Akt信號通路激活。

綜上所述，下調(diào)S100A8表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號通路激活有關(guān)。