半枝蓮新克羅烷型二萜對(duì)人OCI-LY1淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響

劉謙，陳敏，徐芳華，喻友愛，劉勇

（1.江西省人民醫(yī)院南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，南昌 330006；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬萍鄉(xiāng)醫(yī)院病理科，萍鄉(xiāng) 337055）

半枝蓮又名韓信草，馬唇形科黃芩屬多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)南方濕地，功效為清熱解毒、化瘀利尿，主治疔瘡腫毒、咽喉腫痛等[1]。據(jù)《中華腫瘤治療大成》載，半枝蓮作為抗腫瘤藥物，主治原發(fā)性肝癌、胃癌等消化道腫瘤、肺癌及子宮頸癌等[2]。同時(shí)，有部分研究將半枝蓮聯(lián)合化療用于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的治療[3]?，F(xiàn)代研究表明，半枝蓮的有效成分中，黃酮、多糖、二萜等具有良好的抗腫瘤活性[4]。近年來(lái)在半枝蓮二萜類化合物中，發(fā)現(xiàn)部分新克羅烷型二萜具有顯著抗腫瘤活性[5-6]。本研究利用彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株OCI-LY1作為研究對(duì)象，探討半枝蓮新型克羅烷二萜J（SJ）對(duì)其增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤OCI-LY1細(xì)胞株（上海通派生物科技有限公司），半枝蓮二萜J（江西省人民醫(yī)院藥劑科），CCK-8（日本同仁化學(xué)，CK04），胎牛血清（Ausbian，VS500T），DMEM（Corning，10-013-CVR），凋 亡 試 劑 盒 （eBioscience，88-8007），PI（Sigma，P4170），RNase A（Fermentas，EN0531），BCR試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0010S），cyclin D3（CST公司，1∶500稀釋）。

1.2 儀器 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Nexcelom Cellometer，Auto 1000），酶標(biāo)儀（Tecan infinite，M2009PR），流式細(xì)胞儀（BD，C6 PLUS），熒光顯微鏡（OLYMPUS，IX71），SDS-PAGE蛋白電泳儀（上海天能，VE-180），蛋白轉(zhuǎn)膜儀（上海天能，VE-186）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤OCI-LY1細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清FBS，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3天傳代。半枝蓮二萜J用DMSO配制成1 mg/mL，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將OCI-LY1細(xì)胞懸液以每孔2×103個(gè)細(xì)胞、每孔100 μL接種于96孔板，待細(xì)胞沉淀后，用不同質(zhì)量濃度的半枝蓮二萜J（10、15、20、30、40、60、80、100 μg/mL）處理細(xì)胞，同時(shí)，設(shè)置DMSO作為對(duì)照組，作用24、48、72小時(shí)；每孔加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)2小時(shí)后，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔吸收光度值（A），計(jì)算各組細(xì)胞活性（%）=實(shí)驗(yàn)組A/正常對(duì)照組A×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)OCI-LY1細(xì)胞凋亡率 將OCI-LY1細(xì)胞懸液以每孔2×105個(gè)細(xì)胞、每孔2 mL接種于6孔板，待細(xì)胞沉淀后，用不同質(zhì)量濃度的半枝蓮二萜J（0、20、40、60 μg/mL）處理細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)；收集細(xì)胞，用Binding buffer洗滌細(xì)胞后，加入4 μL PI染色，重懸細(xì)胞，再加入10 μL Annexin V-APC染色，避光15分鐘后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.6 PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè) 將OCI-LY1細(xì)胞懸液培養(yǎng)于6 cm dish中，用不同質(zhì)量濃度半枝蓮二萜J（0、20、40、60 μg/mL）處理細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)；收集細(xì)胞離心后，經(jīng)4℃D-Hanks洗滌、75%乙醇固定處理后，按PI∶RNase∶D-Hanks=25∶10∶1000配比進(jìn)行細(xì)胞染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析數(shù)據(jù)。

1.7 Western blotting法檢測(cè)cyclin D3蛋白的表達(dá)用不同質(zhì)量濃度半枝蓮二萜J（0、20、40、60 μg/mL）處理細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后收集OCI-LY1細(xì)胞，PBS洗滌兩次，加入RIPA裂解液，冰上裂解10分鐘，轉(zhuǎn)移至EP管中，超聲破碎細(xì)胞（40 w，每次1秒，間隔2秒，共20次）。4℃、12000 g，離心15分鐘，測(cè)定蛋白濃度。每條泳道加蛋白50 μg，進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉PVDF膜1小時(shí)，與一抗cyclin D3室溫孵育2小時(shí)，并用TBST洗膜4次，每次8分鐘；再與二抗室溫孵育1.5小時(shí)，并用TBST洗膜。將PVDF膜置于暗盒，膠片曝光，沖洗膠片，并檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用IBM SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞增殖的影響半枝蓮二萜J可以明顯抑制OCI-LY1細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間和劑量依賴性（圖1），不同質(zhì)量濃度半枝蓮二萜J作用下，細(xì)胞增殖抑制率均高于DMSO對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞增殖的影響

2.2 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞凋亡的影響比較不同質(zhì)量濃度半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞凋亡的影響后發(fā)現(xiàn)，加入20 μg/mL半枝蓮二萜J處理組和不加藥組壞死細(xì)胞之間沒有出現(xiàn)差異（P＞0.05），但早期凋亡和晚期凋亡率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；加入40 μg/mL和60 μg/mL半枝蓮二萜J處理后的細(xì)胞壞死率、早期和晚期凋亡率與不加藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1，圖2。

圖2 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞凋亡的影響

表1 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）

表1 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）

濃度（μg/mL）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）壞死率（%）存活率（%）0 20 40 60 1.90±0.26 3.83±0.25 4.50±0.26 7.03±0.42 1.60±0.17 2.80±0.26 10.77±0.31 28.40±0.79 0.77±0.15 0.77±0.25 3.83±0.75 5.93±0.85 95.70±0.36 92.57±0.42 80.97±0.32 58.63±0.21

2.3 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞周期的影響作用24 h后，比較不同質(zhì)量濃度半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞周期的影響后發(fā)現(xiàn)，與不加藥組相比，加40 μg/mL和60 μg/mL半枝蓮二萜J處理后處于各個(gè)周期的細(xì)胞總數(shù)之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；在加入20 μg/mL半枝蓮二萜J中，只有處于S期的細(xì)胞總數(shù)與之相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），處于G0/G1期和G2/M期的細(xì)胞總數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2，圖3。

圖3 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞周期的影響

表2 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）

表2 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）

質(zhì)量濃度（μg/mL）0 20 40 60細(xì)胞周期分布（%）G0/G1 S G2/M 51.09±0.72 54.44±0.79 73.48±0.87 66.21±0.56 34.61±0.63 33.95±0.49 17.96±1.02 26.54±0.57 14.30±0.24 11.61±0.37 8.56±0.35 7.24±0.44

2.4 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞cyclin D3蛋白表達(dá)的影響 用不同質(zhì)量濃度（0、20、40、60 μg/mL）半枝蓮二萜J處理OCI-LY1細(xì)胞后，在31kDa處檢測(cè)到目標(biāo)條帶，其cyclin D3蛋白表達(dá)均明顯減弱，并呈劑量依賴性，見圖4。

圖4 半枝蓮二萜J對(duì)OCI-LY1細(xì)胞cyclin D3蛋白表達(dá)的影響：半枝蓮二萜J（μg/mL）

3 討論

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，始載于《藥鏡拾遺賦》。其性辛、苦、寒，具有清熱解毒、消腫止痛等功效[7]。在中醫(yī)治療中，常用其單方或復(fù)方治療各種腫瘤[8]。半枝蓮的藥理研究證實(shí)，其提取物在體外和體內(nèi)是肝癌的有效抑制劑[9]。從半枝蓮中分離得到的葉綠素a的衍生物，可以通過抑制P-糖蛋白的表達(dá)，并誘導(dǎo)HepG2的細(xì)胞周期阻滯來(lái)降低耐藥性[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，半枝蓮二萜J能夠抑制OCI-LY1細(xì)胞增殖，且具有時(shí)間和劑量依賴性，并使cyclin D3表達(dá)降低，呈劑量依賴性。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，半枝蓮二萜J以劑量依賴性方式誘導(dǎo)OCI-LY1細(xì)胞凋亡，隨劑量的遞增，其早期凋亡率和晚期凋亡率均增大。但在20 μg/mL半枝蓮二萜J處理組和不加藥組凋亡細(xì)胞之間沒有出現(xiàn)差異，而加入40 μg/mL和60 μg/mL半枝蓮二萜J處理后的細(xì)胞凋亡率與不加藥組之間均出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測(cè)可能是隨著劑量的增加，細(xì)胞凋亡越來(lái)越明顯，進(jìn)一步支持了其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

本研究在細(xì)胞周期方面的結(jié)果顯示，半枝蓮二萜J主要使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，隨劑量濃度的增大，處于G0/G1期的細(xì)胞逐漸增多，在質(zhì)量濃度40 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值。同時(shí)，隨半枝蓮二萜J質(zhì)量濃度的增大，處于S期的細(xì)胞也逐漸減少，在質(zhì)量濃度40 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值。但在S期中，20 μg/mL半枝蓮二萜J處理組相比不加藥組之間的差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)可能由于藥物質(zhì)量濃度小導(dǎo)致差異不明顯。另外，G2/M期細(xì)胞也以劑量依賴的方式逐漸減少，說(shuō)明半枝蓮二萜J對(duì)OCILY1細(xì)胞周期的阻滯作用。

由于細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要作用，細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（Cyclin Dependent Kinases,CDKs）和周期蛋白被廣泛研究[11]。D型細(xì)胞周期蛋白（cyclin D）作為有絲分裂傳感器，直接將生長(zhǎng)因子信號(hào)與G1期進(jìn)展聯(lián)系起來(lái)。同時(shí)，cyclin D的降解與大量人類腫瘤相關(guān)[12]。cyclin D包括3個(gè)亞型：cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3，能促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)加快細(xì)胞周期進(jìn)程。cyclin D3是G1期CDK4/CDK6的調(diào)節(jié)亞基，同時(shí)作為CDK11P58的伙伴，參與G2/M期的調(diào)節(jié)[13]。最近有研究證實(shí)，cyclin D3與CDK1、CDK2和CDK14之間也有一定相關(guān)性[14]。在淋巴造血系統(tǒng)的研究中，cyclin D3被認(rèn)為是與中國(guó)非霍奇金淋巴瘤發(fā)病關(guān)系最密切的D類細(xì)胞周期蛋白，其表達(dá)水平與惡性程度呈明顯正相關(guān)[15]。本研究采用Western blotting法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度半枝蓮二萜J作用OCI-LY1細(xì)胞，cyclin D3在蛋白水平的表達(dá)變化后發(fā)現(xiàn)，半枝蓮二萜J以劑量依賴方式使OCI-LY1細(xì)胞cyclin D3蛋白表達(dá)降低，推測(cè)cyclin D3的表達(dá)下調(diào)可能與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤作為我國(guó)最常見的淋巴造血系統(tǒng)腫瘤，治療方法多以化療為主[16-17]，但對(duì)于部分復(fù)發(fā)難治的患者，療效仍不能讓人滿意。本研究以彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株OCI-LY1細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)半枝蓮二萜J可以通過下調(diào)cyclin D3的表達(dá)從而阻滯腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨著研究的逐漸深入，有望為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的治療帶來(lái)新的可能。