板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV-JXA1株體外增殖的影響

蘇 科，李倩楠，樊俊洋，劉 健，朱世豪，郝瀟雅，楊明凡,2,3，張紅英,2,3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450046；2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450046；3.鄭州市中獸藥創(chuàng)制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450046)

板藍(lán)根多糖(Radixisatidispolysaccharide，IPRS)是從板藍(lán)根中提取的多糖，約占板藍(lán)根質(zhì)量的12%，是板藍(lán)根中主要的活性成分之一。IPRS是天然的免疫調(diào)節(jié)劑，具有低毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)[1]。IPRS中的蛋白多糖具有抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[2-3]。IPRS能夠提高雛雞包括法氏囊在內(nèi)的多種免疫器官指數(shù)，并能夠促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖，提高雛雞血清中的抗體水平[4-5]。據(jù)報(bào)道，IPRS通過(guò)腹腔注射能夠提高小鼠的先天性免疫和特異性免疫[6]。胡元亮等[7]研究證實(shí)，80～600 mg/L 的板藍(lán)根多糖能夠顯著抑制新城疫病毒的感染。IPRS對(duì)于豬細(xì)小病毒[8]和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)[9]也有很好的阻斷作用。李曉等[10]研究結(jié)果顯示，IPRS促進(jìn)了雞的免疫器官指數(shù)，增加了CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的占比，對(duì)雞傳染性支氣管炎具有較好的治療效果。

豬繁殖與呼吸障礙綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRSV引起的、嚴(yán)重危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的疾病。僅美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)每年因該病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到6億美元[11]。當(dāng)前，預(yù)防該病的主流措施是弱毒疫苗或滅活疫苗接種，但由于滅活苗免疫效果不佳，弱毒苗則存在極大散毒風(fēng)險(xiǎn)，且PRRSV具有抗體依賴(lài)增強(qiáng)作用[12-13]，因此研發(fā)抗PRRSV藥物對(duì)防制該病有深遠(yuǎn)意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外廣泛開(kāi)展了中藥抗PRRSV的試驗(yàn)研究[14]。據(jù)報(bào)道，體外具有顯著抗PRRSV作用的中藥很多，本實(shí)驗(yàn)室將體外抗PRRSV效果顯著的苦參堿、甘草酸用于動(dòng)物試驗(yàn)，卻發(fā)現(xiàn)體內(nèi)試驗(yàn)無(wú)效[15-17]。其原因是多方面的，動(dòng)物機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，體外試驗(yàn)則僅限細(xì)胞、病毒和藥物之間的作用，且體外試驗(yàn)多用MA-104和MARC-145細(xì)胞，這2株細(xì)胞來(lái)源于猴腎，與PRRSV自然宿主存在較大種屬差異，體外試驗(yàn)未考慮藥物對(duì)PRRSV致炎作用及免疫抑制的影響。因此，抗PRRSV藥物篩選迫切需要從2個(gè)方面研究：一是藥物對(duì)病毒的影響，二是藥物對(duì)宿主免疫功能的影響。

本項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，IPRS在體外具有抗PRRSV的作用，并對(duì)免疫細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)采用成功轉(zhuǎn)染CD163受體的永生化豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21/CD163作為靶細(xì)胞，篩選出IPRS最佳質(zhì)量濃度及其最佳作用方式，確定 IPRS抑制PRRSV復(fù)制的主要環(huán)節(jié)，并驗(yàn)證了TLR4在IPRS的抗PRRSV增殖過(guò)程中的作用,以期為后續(xù)探究IPRS的抗PRRSV致炎作用和對(duì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及藥物3D4/21/CD163細(xì)胞，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；PRRSV-JXA1株(TCID50為10-5.25)，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)田克恭老師惠贈(zèng)；IPRS(94.37%)由本實(shí)驗(yàn)室提取、保存。

1.2 主要試劑反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Vazyme公司；熒光定量mix酶購(gòu)自Vazyme公司；TPRRSV-N抗體購(gòu)自Bioss公司；PITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自鼎國(guó)昌盛有限公司；預(yù)染Marker購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司；TLR4 Antibody購(gòu)自美國(guó) Novus 公司；Anti-β-actin、Anti-β-actin Rabbit購(gòu)自上海 Abway 抗體公司；TAK-242購(gòu)自MCE中國(guó)。

1.3 主要儀器熒光定量PCR儀(CFX96 Tou)，BIO-RAD公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡(XSP-BM21AY)，上海光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；蛋白電泳儀(PowerPac Basic)、蛋白電泳槽(Mini PROTEAN?Tetra Cell)、半干轉(zhuǎn)膜儀(Trans-Blot Turbo System)，BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.4 IPRS最大安全質(zhì)量濃度的確定將細(xì)胞以3×105/mL濃度均勻鋪于96孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%。IRPS組是用維持液將IRPS從2 g/L 倍比稀釋為0.500 00，0.250 00，0.125 00，0.062 50，0.031 25 g/L 5個(gè)質(zhì)量濃度梯度分別作用于細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組。將每個(gè)梯度的IRPS組、細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用CCK8法測(cè)D495 nm值。

1.5 IPRS抑制PRRSV-JXA1增殖的最佳作用方式和質(zhì)量濃度

1.5.1IPRS對(duì)PRRSV-JXA1的預(yù)防作用 將3D4/21/CD163細(xì)胞以3×105/mL的濃度均勻鋪于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，棄去生長(zhǎng)液，PBS洗2次。IRPS組是用維持液將IRPS倍比稀釋為0.062 500，0.031 250，0.015 625 g/L等3個(gè)梯度作用于細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組。每個(gè)梯度的IRPS組和病毒對(duì)照組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)4 h后，棄上清，PBS洗2次，加入100 TCID50的病毒液，37℃孵育2 h，棄上清，PBS洗2次，加入維持液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定IRPS組和病毒對(duì)照組的PRRSV載量。

1.5.2IPRS對(duì)PRRSV-JXA1的直接殺滅作用 將3D4/21/CD163細(xì)胞以3×105/mL的濃度均勻鋪于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，棄去生長(zhǎng)液，PBS洗2次。IRPS組是用100 TCID50的病毒液將 IPRS倍比稀釋為0.062 500，0.031 250，0.015 625 g/L等3個(gè)梯度作用于細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組。每個(gè)梯度的IRPS組和病毒對(duì)照組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37℃孵育2 h，棄上清，PBS洗2次，加入維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定IRPS組和病毒對(duì)照組的PRRSV載量。

1.5.3IPRS對(duì)PRRSV-JXA1的治療作用 將3D4/21/CD163細(xì)胞以3×105/mL的濃度均勻鋪于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，棄去生長(zhǎng)液，PBS洗2次，病毒液以100 TCID50的濃度接種于24孔板，孵育2 h。棄去病毒液，PBS洗2次，IRPS組是用維持液將IRPS倍比稀釋為0.062 500，0.031 250，0.015 625 g/L等3個(gè)梯度作用于被感染的細(xì)胞，病毒對(duì)照組不用藥物處理，每個(gè)梯度的IRPS組和病毒對(duì)照組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定PRRSV載量。

1.6 IPRS對(duì)PRRSV-JXA1復(fù)制環(huán)節(jié)的影響

1.6.1IPRS對(duì)PRRSV-JXA1吸附環(huán)節(jié)的影響 將3D4/21/CD163細(xì)胞以3×105/mL的濃度均勻鋪于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，4℃預(yù)冷0.5 h。IRPS組是用100 TCID50濃度的病毒稀釋液將藥物倍比稀釋為0.062 500，0.031 250，0.015 625 g/L等3個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。棄去上清，PBS洗2次，每孔加入500 μL，4℃吸附2 h后棄上清，PBS洗2次，每孔加入500 μL維持液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定PRRSV載量。

1.6.2IPRS對(duì)PRRSV-JXA1侵入環(huán)節(jié)的影響 將3D4/21/CD163細(xì)胞以3×105/mL的濃度均勻鋪于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，棄去生長(zhǎng)液，PBS洗2次，加入100 TCID50的病毒液，4℃吸附2 h，棄去病毒液每孔加入500 μL維持液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱，分別在轉(zhuǎn)入后0，1，2 h加入最佳質(zhì)量濃度的 IPRS，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定PRRSV載量。

1.6.3IPRS對(duì)PRRSV-JXA1胞內(nèi)增殖的影響 將3D4/21/CD163細(xì)胞以3×105/mL的濃度均勻鋪于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，棄去生長(zhǎng)液，PBS洗2次，加入100 TCID50的病毒液，細(xì)胞對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，4℃吸附2 h。棄去病毒液，在細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組加入維持液，給藥組加入維持液稀釋的最佳質(zhì)量濃度的 IPRS。轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定PRRSV載量。

1.7 IPRS對(duì)PRRSV-JXA1的確證

1.7.1熒光定量PCR檢測(cè) IPRS對(duì)PRRSV-JXA1的拷貝數(shù)影響 將3D4/21/CD163 細(xì)胞以 3×105/mL 鋪于24孔細(xì)胞板中，長(zhǎng)至80%～90%棄去生長(zhǎng)液，設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組和給藥組。給藥組加入維持液稀釋的最佳質(zhì)量濃度的IPRS，其他2組加入維持液，培養(yǎng)4 h后，置于4℃預(yù)冷30 min，棄上清液4℃PBS洗2次。細(xì)胞對(duì)照組、給藥組、病毒對(duì)照組，分別加入4℃的無(wú)血清培養(yǎng)液、100 TCID50病毒液稀釋的最佳質(zhì)量濃度藥物、100 TCID50的病毒液，轉(zhuǎn)入4℃吸附 2 h 后棄上清液PBS洗2次，加入維持液，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36，48，72 h。通過(guò)測(cè)定病毒載量的變化，來(lái)檢測(cè)IPRS體外抗PRRSV作用。

1.7.2間接免疫熒光檢測(cè)該藥對(duì)PRRSV-JXA1的作用 細(xì)胞處理同1.7.1，按照參考文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)藥物對(duì)PRRSV的作用。

1.8 IPRS抑制PRRSV-JXA1增殖過(guò)程中對(duì)TLR4蛋白翻譯水平的影響具體方法參考文獻(xiàn)[18]。

1.9 TLR4在IPRS抑制PRRSV-JXA1增殖過(guò)程的作用

1.9.1TAK-242最大安全濃度的測(cè)定 將TAK-242倍比稀釋為80.000 00，40.000 00，20.000 00，10.000 00，5.000 00，2.500 00，1.250 00，0.625 00，0.312 50，0.156 25 μmol/L等10個(gè)梯度，待96孔板的細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，加入各濃度的TAK-242，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用CCK8法測(cè)D495 nm值。

1.9.2TAK-242對(duì)TLR4抑制功能的驗(yàn)證 TAK-242處理組是將TAK-242稀釋為80，40，20 μmol/L及1.9 nmol/L作用于細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組和LPS組。TAK-242處理組均使用1 mg/L LPS刺激，通過(guò)檢測(cè)TLR4下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-ΚB(p65)的蛋白翻譯水平來(lái)評(píng)價(jià)TAK-242對(duì)TLR4的抑制功能，具體方法參考文獻(xiàn)[18]。

1.9.3IRPS在TLR4被阻斷時(shí)對(duì)PRRSV-JXA1增殖影響 3D4/21/CD163細(xì)胞在24孔板中長(zhǎng)至80%～90%，設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、TLR4/NF-ΚB途徑被阻斷條件下的病毒對(duì)照組、IRPS組、TLR4/NF-ΚB途徑被阻斷條件下的IRPS組。IRPS組細(xì)胞處理同1.7.1；TAK-242組為T(mén)AK-242提前與細(xì)胞孵育4 h后，PBS洗3次接毒；TAK-242+IRPS組是將多糖與藥物混合后使藥物和TAK-242均為最佳作用濃度與細(xì)胞孵育4 h，后續(xù)處理同給藥組。使用熒光定量PCR檢測(cè)病毒載量。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析用Prism 8.0、Adobe Photoshop和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 IRPS對(duì)3D4/21/CD163細(xì)胞最大安全質(zhì)量濃度的測(cè)定IRPS在3D4/21/CD163細(xì)胞上的最大安全質(zhì)量濃度為0.062 50 g/L(表1)。

表1 IRPS在3D4/21/CD163細(xì)胞上的最大安全質(zhì)量濃度

2.2 IRPS抑制PRRSV-JXA1增殖的最佳作用方式和質(zhì)量濃度IRPS對(duì)PRRSV的預(yù)防作用和直接殺滅作用效果極顯著(P<0.0001)，最佳質(zhì)量濃度為0.015 625 g/L，病毒載量分別減少了91.34%和84.36%(圖1，表2)。

表2 不同質(zhì)量濃度IRPS預(yù)防、治療和直接殺滅作用下PRRSV-JXA1載量的變化

A.IRPS對(duì)PRRSV-JXA1的預(yù)防作用；B.IRPS對(duì)PRRSV-JXA1的治療作用；C.IRPS對(duì)PRRSV-JXA1的直接殺滅作用。***表示P<0.001，****表示P<0.000 1。下同

2.3 IRPS對(duì)PRRSV-JXA1復(fù)制環(huán)節(jié)的抑制IRPS抗PRRSV-JXA1吸附環(huán)節(jié)作用效果最佳(P<0.000 1)，質(zhì)量濃度為0.015 625 g/L時(shí)病毒載量減少了88.83%(圖2,表3)。

表3 IRPS作用于PRRSV的吸附、侵入和胞內(nèi)增殖環(huán)節(jié)對(duì)病毒載量的影響

A.IRPS對(duì)PRRSV-JXA1吸附內(nèi)化環(huán)節(jié)的抑制作用；B.IRPS對(duì)PRRSV-JXA1侵入環(huán)節(jié)的抑制作用；C.IRPS對(duì)PRRSV-JXA1胞內(nèi)增殖的抑制作用

2.4 熒光定量PCR方法檢測(cè) PRRSV 拷貝數(shù)給藥48 h IRPS抗病毒效果最佳，使病毒載量下降了94.97%(P<0.000 1)；給藥36,72 h減少了60.83%和53.10%病毒載量；給藥組載量小于病毒對(duì)照組(圖3，表4)。

A，B，C.分別為以IRPS以最佳給藥方式、最佳給藥質(zhì)量濃度、最佳作用環(huán)節(jié)共同作用于細(xì)胞分別孵育36，48，72 h后的病毒拷貝數(shù)；D.不同培養(yǎng)時(shí)間病毒對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組和給藥組的病毒拷貝

表4 IRPS以最佳給藥方式、最佳給藥質(zhì)量濃度、最佳作用環(huán)節(jié)共同作用于細(xì)胞分別孵育36,48,72 h后的病毒載量降幅

2.5 間接免疫熒光檢測(cè)IRPS對(duì)PRRSV的作用由圖4可見(jiàn)，染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色，染色均勻，著色效果很好。相對(duì)于病毒對(duì)照組，給藥組和細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞核圓潤(rùn)，核與核之間的黏連較少。圖4C有明顯的綠色熒光，圖4B僅見(jiàn)少量熒光，證實(shí)IRPS有很好地抑制強(qiáng)毒株P(guān)RRSV-JXA1在3D4/21/CD163細(xì)胞增殖的作用。

A.細(xì)胞對(duì)照組;B.給藥組;C.病毒對(duì)照組。DAPI.各組細(xì)胞核染色結(jié)果;PRRSV-N.各組免疫熒光結(jié)果;Merge.熒光融合結(jié)果

2.6 IRPS抑制PRRSV-JXA1增殖過(guò)程中對(duì)TLR4蛋白翻譯水平的影響6 h給藥組TLR4蛋白翻譯水平較細(xì)胞對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)；12 h病毒對(duì)照組和給藥組TLR4蛋白翻譯水平較細(xì)胞對(duì)照組顯著下調(diào)(P<0.000 1)，IRPS組相對(duì)于病毒對(duì)照組TLR4蛋白翻譯水平顯著上調(diào)(P<0.000 1)；24,30 h 病毒對(duì)照組顯著下調(diào)了TLR4蛋白翻譯水平(P<0.000 1)，IRPS組減弱了這種下調(diào)(P<0.000 1)使TLR4蛋白翻譯水平與細(xì)胞對(duì)照組無(wú)顯著性差異；48 h給藥組TLR4蛋白表達(dá)水平相對(duì)于細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組顯著下調(diào)(P<0.000 1)(圖5，6)。

T.IPRS處理組；C.細(xì)胞對(duì)照組；V.病毒對(duì)照組。不同數(shù)字代表不同時(shí)間點(diǎn)(h)

*表示P<0.05，****表示P<0.000 1

2.7 TLR4在IRPS抑制PRRSV-JXA1增殖過(guò)程的功能

2.7.1TAK-242最大安全濃度的測(cè)定及TAK-242抑制TLR4/NF-ΚB途徑的檢測(cè) 所選TAK-242的濃度對(duì)3D4/21細(xì)胞未出現(xiàn)細(xì)胞毒性，反而促進(jìn)了細(xì)胞增殖(圖7)。TAK-242濃度為20.000 00，40.000 00，80.000 00 μmol/L能顯著抑制TLR4下游分子NF-ΚB(P65)蛋白翻譯水平(P<0.000 1)，40.000 00 μmol/L的TAK-242相對(duì)于20.000 00 μmol/LTAK-242抑制效果更佳(P<0.01)，相對(duì)于80.000 00 μmol/LTAK-242細(xì)胞毒性更小(圖7，8，9)。

圖7 不同濃度的TAK-242對(duì)細(xì)胞活性的抑制率

-.未添加LPS或TAK-242；+.添加LPS或TAK-242；圖下方數(shù)字代表所添加的TAK-242濃度

LPS.LPS陽(yáng)性對(duì)照；TAK-242.TLR4抑制劑處理組。*表示P<0.05，**表示P<0.01，****表示P<0.000 1

2.7.2IRPS在TLR4/NF-ΚB途徑被阻斷時(shí)對(duì)PRRSV-JXA1增殖的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，IRPS組仍保持了對(duì)PRRSV 90%以上的抑制率，與病毒對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.000 1)；TLR4抑制劑組PRRSV載量與病毒對(duì)照組相比顯著升高(P<0.001)；在TLR4/NF-ΚB途徑被阻斷條件下的IRPS組與病毒對(duì)照組相比病毒載量顯著增加(P<0.000 1)(圖10)。

Cell.細(xì)胞對(duì)照；T+I+V.TLR4/NF-ΚB途徑被阻斷條件下的IRPS組；T+V.TLR4/NF-ΚB途徑被阻斷條件下的病毒對(duì)照組；I+V.IRPS組；V.病毒對(duì)照。***表示P<0.001，****表示P<0.000 1

3 討論

3.1 IRPS抑制PRRSV增殖的吸附環(huán)節(jié)IRPS能夠與多種受體作用，因此一般認(rèn)為其抗病毒作用機(jī)理是多途徑的[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，3種給藥方式藥物作用的時(shí)間先后有很大差異，IRPS對(duì)PRRSV的預(yù)防作用效果最顯著(P<0.000 1)。IRPS提前4 h作用細(xì)胞，可能與細(xì)胞表面的一些受體作用，激活了細(xì)胞的先天性免疫，此時(shí)PRRSV對(duì)細(xì)胞的感染率大大降低。PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，通過(guò)表面特異性受體以胞吞的形式進(jìn)入細(xì)胞[19]，在這之前需要吸附并融合于細(xì)胞膜表面。PRRSV編碼多種蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白GP2 b可能涉及病毒和宿主細(xì)胞的融合及內(nèi)吞作用[20]。PAM細(xì)胞表面存在多種受體有助于PRRSV吸附、膜融合和內(nèi)化作用，這些受體的功能有交叉性。硫酸乙酰肝素參與PRRSV的吸附環(huán)節(jié)[21]。唾液酸黏附素參與PRRSV的吸附和內(nèi)吞作用[22]。CD163介導(dǎo)PRRSV的內(nèi)吞和脫殼[23]。因此，IRPS能夠顯著抑制PRRSV的吸附環(huán)節(jié)(P<0.000 1)，可能存在2個(gè)方面的原因：一是IRPS能夠破壞或改變PRRSV GP2 b的結(jié)構(gòu)；二是IRPS與PRRSV競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合硫酸乙酰肝素或唾液酸黏附素，這有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 PRRSV感染對(duì)TLR4表達(dá)的影響TLR4是經(jīng)典的抗細(xì)菌天然免疫模式識(shí)別受體,主要識(shí)別革蘭陰性菌的脂多糖或類(lèi)脂A，也可識(shí)別部分病毒的包膜蛋白，通過(guò)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和共刺激分子而誘發(fā)天然免疫反應(yīng)[24]。研究發(fā)現(xiàn)，新冠病毒冠狀蛋白可以直接結(jié)合并激活模式識(shí)別受體TLR4，并上調(diào)相關(guān)炎癥因子(如IL-1B和IL-6)，這種天然免疫反應(yīng)的結(jié)果是造成患者體內(nèi)的細(xì)胞因子風(fēng)暴和病毒無(wú)法有效被清除[25]，其感染結(jié)果和PRRSV感染相似。宋爽[26]研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV通過(guò)TLR4/MyD88信號(hào)通路誘導(dǎo)IL-lβ、IL-6和IL-8的產(chǎn)生，但這3種細(xì)胞因子對(duì)PRRSV的增殖均無(wú)明顯影響。本試驗(yàn)中，在PRRSV感染后6，24 h，3D4/21/CD163細(xì)胞TLR4的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)差異，這與參考文獻(xiàn)[27]的研究結(jié)果一致，但在PRRSV感染后12，30，36 h TLR4的表達(dá)顯著下降，說(shuō)明PRRSV的增殖可以抑制TLR4的表達(dá)。

3.3 TLR4/NF-ΚB信號(hào)通路是IRPS抗PRRSV增殖的關(guān)鍵通路目前，主要的植物多糖受體包括補(bǔ)體受體3、TLRs、清道夫受體、Dectin-1以及甘露糖受體等。據(jù)報(bào)道，脹果甘草多糖通過(guò)TLR4/MyD88/NF-ΚB途徑激活巨噬細(xì)胞的免疫功能[28]。周雪[18]發(fā)現(xiàn)，TLR4能夠與錦燈籠果實(shí)多糖結(jié)合。本試驗(yàn)中，IRPS組相對(duì)于病毒對(duì)照組在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)促進(jìn)了TLR4的蛋白翻譯水平(P<0.001)，本研究推測(cè)IRPS抑制PRRSV增殖可能是通過(guò)TLR4途徑，試驗(yàn)結(jié)果也證明了這個(gè)推測(cè)。TLR4是唯一一個(gè)MyD88和TRIF信號(hào)通路兼依賴(lài)的TLRs，NF-ΚB是MyD88下游的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)TLR4下游的NF-ΚB信號(hào)通路被阻斷時(shí)，PRRSV的拷貝數(shù)顯著增加(P<0.001)，這說(shuō)明TLR4的NF-ΚB途徑確實(shí)在機(jī)體抗PRRSV過(guò)程中起關(guān)鍵作用；當(dāng)TLR4信號(hào)通路未受到抑制時(shí)IRPS有較好的抗PRRSV作用(P<0.000 1)，而在TLR4/NF-ΚB途徑被阻斷時(shí)IRPS不能抑制PRRSV的體外增殖，這說(shuō)明TLR4/NF-ΚB信號(hào)通路同樣是IRPS體外抗PRRSV增殖的關(guān)鍵通路，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)基于多個(gè)實(shí)驗(yàn)室及本課題組前期對(duì)IRPS體外抗PRRSV作用[9,29]以及通過(guò)促進(jìn)DC細(xì)胞的增殖、分化和成熟[30]等研究工作，探討板藍(lán)根多糖在3D4/21/CD163細(xì)胞上的抗PRRSV作用，證明了TLR4/NF-ΚB途徑是機(jī)體抗PRRSV的關(guān)鍵，并在IRPS抑制PRRSV增殖過(guò)程中不可或缺。3D4/21是永生化的豬肺泡巨噬細(xì)胞，因此相較于Marc-145或MA-104，在3D4/21/CD163細(xì)胞上研究中藥抗PRRSV作用可能更具現(xiàn)實(shí)意義。