牙齦卟啉單胞菌感染星形膠質(zhì)細胞對食管癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響

張頂彧，郭靜宜，張秀森，劉書培，申劉青，石林林，2,原 翔,2，高社干,2

食管癌(esophageal cancer,EC)發(fā)病率居我國惡性腫瘤的第五位，超過半數(shù)患者在確診時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。雖然EC轉(zhuǎn)移的惡性程度很高[1]，但EC轉(zhuǎn)移細胞在腦的定植是一個非常低效的過程，EC的腦轉(zhuǎn)移非常罕見[2]。大腦微環(huán)境對侵入的細胞有強烈的選擇性壓力，可以消除大多數(shù)越過血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的癌細胞，正是大腦這種獨特的微環(huán)境維持著生理上的動態(tài)平衡，并協(xié)調(diào)著對包括癌癥在內(nèi)的病理失調(diào)的反應(yīng)[3]。

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)已被確定為EC的重要風(fēng)險因素[4]。研究表明，Pg感染可以顯著增強EC細胞的增殖、遷徙及侵襲能力，促進食管癌細胞向遠處轉(zhuǎn)移[5]。并且Pg可以通過誘導(dǎo)EC細胞線粒體自噬，從而維持在EC細胞內(nèi)的定植狀態(tài)[6]。Pg的一過性菌血癥可發(fā)生在刷牙、用牙線和咀嚼等常見活動中，也可在牙科手術(shù)中發(fā)生[7]，導(dǎo)致Pg會向各種組織轉(zhuǎn)移，包括冠狀動脈和食道[4，8]。最新研究表明，Pg可以在腦內(nèi)定植，改變大腦微環(huán)境，誘發(fā)阿爾茲海默癥[9]。

星形膠質(zhì)細胞(astrocytes,As)是腦微環(huán)境的重要組成部分，在維持大腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮許多功能，并在組織修復(fù)過程中發(fā)揮主要作用[10]。研究表明，Pg在大腦中的持續(xù)生長會影響大腦微環(huán)境，并導(dǎo)致特定細胞類型的分子模式發(fā)生改變[11]。而趨化因子C-C配體2(chemokine C-C motif ligand 2,CCL2)是主要由As產(chǎn)生的趨化因子[12]。CCL2的過表達可以加速腫瘤的生長，促進腫瘤的局部轉(zhuǎn)移[13]。

本研究以鼠源星形膠質(zhì)細胞(mouse astrocytes,MAs)和鼠源EC細胞(mouse esophageal carcinoma cells,AKR)為研究對象，通過檢測感染Pg后MAs的CCL2變化，及其對AKR細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，初步探討Pg感染對大腦微環(huán)境及EC腦轉(zhuǎn)移的影響，為預(yù)防和靶向治療腦轉(zhuǎn)移提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

Pg標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33277來源于本實驗室，AKR細胞購自Bluefbio生命科學(xué)公司，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Thermo公司，胰蛋白酶、青鏈霉素混合液購自索萊寶公司，CCK-8試劑購自Thermo公司，DMSO購自Sigma公司，基質(zhì)膠購自Biozellen公司，Transwell小室購自Corning公司，15%及10%PAGE凝膠快速制備試劑盒均購自雅酶公司，PVDF膜購自milipore公司，e-ECL發(fā)光顯影液購自雅酶公司，MCP-1 Monoclonal Antibody (2D8)(CCL2)和C-C趨化因子受體2(C-C chemokine receptor type 2,CCR2)Polyclonal Antibody均購自Thermo公司，CCR2 antagonist 4 hydrochloride購自MCE公司，倒置顯微鏡購自Nikon公司，全自動酶標(biāo)儀、細胞培養(yǎng)箱購自 Thermo 公司，凝膠成像分析儀購自Bio-Rad公司，熒光共聚焦顯微鏡購自ZEISS公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)MAs細胞和AKR細胞均培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細胞生長至80% 融合時傳代或凍存。

1.2.2 Pg培養(yǎng)Pg標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33277，于37 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細菌感染細胞。每次感染細胞前，革蘭氏染色后形態(tài)學(xué)檢測及16S rDNA特異擴增確定Pg 33277無變異、無其它細菌污染。

1.2.3 細胞感染與條件培養(yǎng)基制備MAs細胞生長至80%以上時，吸去原培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，加入胰蛋白酶1 mL，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中消化5 min，加入2 mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基終止消化。將消化后的細胞懸液1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，用1 mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基重懸細胞，細胞計數(shù)，向新培養(yǎng)皿內(nèi)加入(1～10)×106個MAs細胞，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～12 h至細胞完全貼壁。棄去原培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，加入無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)Pg使其OD值達1.0～1.5，將Pg懸液12 000 r·min-1離心10 min后用DMEM重懸。按照預(yù)定的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)值，根據(jù)培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞數(shù)目加入相應(yīng)數(shù)量的Pg，隨后于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。3 d后，收集細胞培養(yǎng)液，4 000 r·min-1離心20 min，使用0.22 μm孔徑的濾器過濾，貯存于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡使用放射免疫裂解緩沖液(Thermo)從細胞中提取蛋白質(zhì)。將感染Pg后的MAs細胞棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，棄去多余水分，加入裂解緩沖液進行蛋白質(zhì)提取。用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(SolarBio)測定蛋白質(zhì)濃度。將30μg蛋白電泳法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用脫脂牛奶封閉后與CCL2(1∶1 000)、CCL2(1∶500)和GAPDH1(1∶2 000)一抗共同孵育。將羊抗兔抗體(1∶2 000稀釋于TBST，Abcam)與羊抗鼠抗體(1∶2 000稀釋于TBST，Abcam)二抗孵育。用e-ECL發(fā)光顯影液檢測信號，用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)采集圖像，用Image Lab軟件(Version 3.0)定量測量相應(yīng)蛋白條帶的密度，并根據(jù)目標(biāo)蛋白條帶密度與內(nèi)參蛋白條帶密度之比計算。

1.2.5 免疫組織熒光將鼠腦石蠟切片放于60 ℃烤箱中烘烤1～2 h，然后迅速放入二甲苯中脫蠟30 min。隨后將組織切片放入梯度酒精中進行梯度水化，取出組織切片后用自來水沖洗3 min，將0.01 mol·L-1檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)倒入容器中，放入微波爐高火5 min，燒開后放入組織切片，低火15～20 min，自然冷卻1 h以上。將組織切片置于保存盒中，PBST沖洗3次，每次3 min。每張切片組織上滴加50 μL過氧化物酶阻斷劑，避光孵育10～15 min。PBST沖洗3次，每次3 min。去除切片上的PBST，每張切片組織上滴加50 μL二抗來源的非免疫血清，室溫封閉10～30 min，傾去勿洗。每張切片上滴加50 μL按適當(dāng)比例稀釋后的CCL2(1∶200)一抗，室溫孵育1～3 h。PBST沖洗5次，每次3 min。去除切片上的PBST，每張切片上滴加50 μL按適當(dāng)比例稀釋后的鼠源熒光二抗，室溫孵育1 h。PBST沖洗5次，每次3 min。棄去切片上的PBST，每張切片上滴加50 μL按適當(dāng)比例稀釋后的GFAP(1∶200)一抗，室溫孵育1～3 h。PBST沖洗5次，每次3 min。甩去切片上的PBST，每張切片上滴加50 μL按適當(dāng)比例稀釋后的鼠源熒光二抗，室溫孵育1 h。PBST沖洗5次，每次3 min。加入防淬滅的DAPI進行核染色，10～30 min，使用熒光共聚焦顯微鏡觀察或封片保存。

1.2.6 免疫細胞熒光在MAs傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到熒光小皿中，接種數(shù)目為每皿1 000個?？蛇x擇感染或不感染Pg。待細胞貼壁后，使用PBS洗滌3次，每次10 min。使用4%甲醛室溫固定1～2 h后，PBS洗滌3次，每次10 min。使用0.2% TritonX-100透化5～10 min后，PBS洗滌3次，每次10 min。使用5%BSA室溫封閉30～60 min。用1%BSA稀釋CCL2(1∶200)一抗，將熒光小皿置于濕盒中，室溫孵育1～4 h。PBS洗滌3次，每次10 min。用1%BSA稀釋鼠源熒光二抗至合適濃度，于濕盒中，室溫避光孵育30～60 min。使用PBS洗滌3次，每次10 min。用1%BSA稀釋GFAP(1∶200)一抗，將熒光小皿置于濕盒中，室溫孵育1～4 h。PBS洗滌3次，每次10 min。用1%BSA稀釋鼠源熒光二抗至合適濃度，于濕盒中室溫避光孵育30～60 min。使用PBS洗滌3次，每次10 min。加入防淬滅的DAPI染色10～30 min后用共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 CCK8細胞增殖實驗取對數(shù)生長期的AKR細胞，調(diào)整細胞密度為2×103個·mL-1，以每孔100 μL的體積接種于 96 孔板。接種24 h后棄去孔內(nèi)原培養(yǎng)基，加入感染Pg的MAs細胞所收取的條件培養(yǎng)基，對照組細胞則加入不感染Pg的MAs細胞所收取的條件培養(yǎng)基，每組設(shè)置 3 個平行孔，并設(shè)置只含條件培養(yǎng)基的空白調(diào)零孔。分別于處理后的0、24、48、72 h，在對應(yīng)時間點的孔中加入 10 μL CCK-8，避光混勻后置于培養(yǎng)箱中孵育 1～4 h，酶標(biāo)儀檢測 450 nm 處的吸光度值。實驗重復(fù) 3 次。

1.2.8 劃痕實驗將AKR細胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng)1×105個細胞，置于培養(yǎng)箱中，直至細胞融合率達70%～80%。用無菌吸管尖端在每孔中刮出一個缺口，并記錄劃痕的位置。每孔加入不同處理的條件培養(yǎng)基(無血清)，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每隔12 h在每孔細胞的同一位置拍攝照片，用ImageJ軟件(Version 1.52)測量不同時間點每孔空白區(qū)域的大小，計算遷移面積。實驗一式三份，每份3個平行樣品。

1.2.9 Transwell侵襲、遷移實驗使用胰蛋白酶消化AKR細胞，加無血清的條件培養(yǎng)基重懸計數(shù)，將100 μL含7.5×104個細胞的懸液接種于不含基質(zhì)膠的Transwell小室上室或含有基質(zhì)膠的小室上室，小室下室均加入含體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基800 μL，置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 24、36 h，取出小室，結(jié)晶紫染色，棉簽擦除小室上層細胞，倒置顯微鏡下觀察，選取5個視野(×100) ，計數(shù)細胞。實驗重復(fù)3次。

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)處理運用GraphPad Prism 9.4.1進行統(tǒng)計學(xué)處理。蛋白印跡實驗、CCK 8細胞增殖實驗、平板克隆形成實驗、劃痕實驗和Trans well侵襲實驗結(jié)果均采用t檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Pg感染與MAs分泌CCL2表達呈正相關(guān)

首先，為了研究MAs細胞是否能夠分泌CCL2，使用免疫熒光來驗證MAs上CCL2的表達。細胞免疫熒光顯示，CCL2(PA5-23037)主要與MAs特異性抗體膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)共定位(圖1A)。免疫組織熒光則在鼠腦組織內(nèi)驗證了上述結(jié)果(圖1B)，證明了MAs細胞可以分泌CCL2。接下來，為了研究Pg對體外培養(yǎng)MAs細胞分泌CCL2是否會產(chǎn)生影響，對感染Pg和未感染Pg的MAs細胞進行蛋白質(zhì)印跡檢測，結(jié)果顯示Pg感染的MAs細胞分泌CCL2的能力增加(圖1C、D)。使用免疫熒光對Pg與MAs分泌CCL2的相關(guān)性進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，感染Pg后的MAs細胞分泌CCL2的熒光強度升高(圖1E、F)。

A：鼠源星形膠質(zhì)細胞CCL2與GFAP免疫熒光共定位;B：C57小鼠腦組織CCL2與GFAP免疫熒光共定位;C：蛋白印跡法檢測Pg感染對MAs細胞CCL2表達的影響；D:蛋白印跡結(jié)果量化圖；E：免疫熒光顯示Pg對MAs細胞CCL2表達的影響；F:免疫熒光結(jié)果量化圖。結(jié)果以顯示。①P<0.01；②P<0.001；③P<0.0001。

2.2 Pg感染MAs后促進AKR細胞的增殖、遷移及侵襲

為了進一步探究Pg感染MAs后腦微環(huán)境改變對腫瘤的影響，使用了條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)法處理AKR細胞。為了避免Pg直接影響AKR細胞，所使用的條件培養(yǎng)基孵育MAs的時間都在48 h以上，且在加入AKR細胞的培養(yǎng)皿之前用濾器過濾(圖2A)。結(jié)果顯示，Pg感染MAs后的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)AKR細胞，AKR細胞的增殖能力增強(圖2B)，且增殖能力與感染MAs的Pg數(shù)量呈正相關(guān)(圖2C)。為了檢測AKR細胞在與Pg感染MAs后的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后，其遷移與侵襲能力的改變，使用劃痕實驗以及Transwell侵襲實驗進行檢測。結(jié)果顯示，在劃痕實驗中，使用感染Pg的MAs條件培養(yǎng)基的AKR細胞比對照組細胞劃痕愈合能力更強(圖2D、E)。Transwell侵襲實驗則顯示，使用感染Pg的MAs條件培養(yǎng)基會使AKR細胞的侵襲能力更強(圖2F、G、H)。上述結(jié)果表明，Pg感染MAs細胞后使AKR細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強。

2.3 Pg通過星形膠質(zhì)細胞的CCL2-CCR2軸促進AKR細胞的增殖、遷移及侵襲

研究表明，CCL2優(yōu)先結(jié)合CCR2[14]。為了進一步研究星形膠質(zhì)促進EC細胞增殖、遷移及侵襲的機制，決定研究在感染Pg的MAs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下的AKR細胞CCR2表達情況。Western印跡結(jié)果顯示，使用感染Pg的MAs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的AKR細胞，其CCR2表達比對照組增強(圖3A、B)。CCR2為趨化因子受體[15]，接下來評估了阻斷CCL2-CCR2軸是否會導(dǎo)致AKR細胞功能的改變。實驗表明，當(dāng)時用CCR2阻斷劑(2 μmol·mL)處理AKR細胞后，使用感染Pg的MAs條件培養(yǎng)基的AKR細胞其增殖(圖3C)、遷移(圖3D、E)及侵襲能力均降低(圖3D、F)。上述結(jié)果表明，Pg感染MAs后促進其分泌CCL2，與AKR細胞上的CCR2受體結(jié)合促進AKR細胞的增殖、遷移及侵襲。

A：條件培養(yǎng)基制備示意圖；B、C：CCK-8實驗檢測AKR細胞的增殖能力；D：劃痕實驗檢測AKR細胞的遷移能力；E：遷移能力量化統(tǒng)計圖；F：Transwell實驗檢測AKR細胞的遷移及侵襲能力；G、H：遷移及侵襲能力量化統(tǒng)計圖。結(jié)果以顯示。①P<0.0001；②P<0.05； ③P<0.01。

A：蛋白印跡法檢測Pg感染MAs細胞的條件培養(yǎng)基對AKR細胞CCR2表達的影響；B：蛋白印跡結(jié)果量化圖；C:CCK-8實驗檢測Pg感染MAs細胞的條件培養(yǎng)基中加入CCR2抑制劑后對AKR細胞增殖能力的影響；D：Transwell實驗檢測Pg感染MAs細胞的條件培養(yǎng)基中加入CCR2抑制劑后對AKR細胞的遷移及侵襲能力的影響;E、F：AKR細胞遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果以顯示。①P<0.05；②P<0.001；③P<0.01。

3 討論

EC是常見的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于EC[16]。EC腦轉(zhuǎn)移缺乏篩選手段，且惡性程度大，中位生存時間往往不超過10個月[17]。Pg感染是誘發(fā)EC的關(guān)鍵因素之一，作為口腔疾病的關(guān)鍵致病菌，其含量異常增加能夠?qū)е驴谇晃⑸鷳B(tài)失衡[19]?？谇晃⑸鷳B(tài)失衡不僅能夠引起口腔局部組織破壞，還能夠通過異常的全身免疫反應(yīng)損傷遠處組織，造成人體多種疾病的形成和進展[20]。同時，Pg已在大腦中被發(fā)現(xiàn)，可通過改變大腦微環(huán)境促進疾病的發(fā)生和發(fā)展[21]。因此，在EC腦轉(zhuǎn)移中，Pg可能是促進EC向腦內(nèi)定植及生長的潛在因素。

腫瘤腦轉(zhuǎn)移的形成與腦部微環(huán)境的影響密切相關(guān)[22]。腦微環(huán)境對腫瘤在腦內(nèi)的定植、生長有著密切關(guān)系，不僅會影響腫瘤的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，還會影響腫瘤細胞的核與胞質(zhì)[23]。腦微環(huán)境包括腫瘤細胞周圍的成纖維細胞、免疫和炎性細胞、膠質(zhì)細胞等，其中就包括星形膠質(zhì)細胞[24]。星形膠質(zhì)細胞是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣泛的一類細胞，參與了血腦屏障的構(gòu)成，也是膠質(zhì)細胞中體積最大的一種[25]。此外，星形膠質(zhì)細胞可以分泌多種影響腫瘤轉(zhuǎn)移的趨化因子，包括CXCL10、CCL2等[26]。

CCL2是CC類趨化因子家族成員[27]。作為在腫瘤微環(huán)境中重要并且研究廣泛的趨化因子之一，CCL2通過自分泌或旁分泌促進腫瘤細胞生長與存活，參與腫瘤免疫耐受調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[28]。多項研究表明在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和肺癌等腫瘤患者組織或血清中發(fā)現(xiàn)CCL2水平升高，且與腫瘤進展分級分期、侵襲轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后密切相關(guān)[14]。星形膠質(zhì)細胞分泌CCL2，而CCL2靶向腫瘤細胞的CCR2受體，促進腫瘤細胞的增殖與侵襲[29]。

在本研究中，通過免疫熒光及WB檢測到Pg感染增強了MAs分泌CCL2的能力，驗證了Pg對MAs的影響。接下來通過獲取Pg感染后MAs的條件培養(yǎng)基，模擬了MAs與AKR細胞共培養(yǎng)的環(huán)境。在該條件培養(yǎng)下，通過CCK8實驗、劃痕實驗和Transwell實驗檢測了AKR細胞的增殖、遷移及侵襲能力，證明了Pg感染后的MAs促進了AKR的增殖、遷移及侵襲，進一步驗證了Pg可以通過影響腦微環(huán)境促進EC腦轉(zhuǎn)移的猜想。最后，通過在條件培養(yǎng)基中加入CCR2抑制劑后觀察AKR細胞的增殖、遷移及侵襲能力的變化，證明了MAs對AKR的促進作用是通過CCL2-CCR2軸來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究初步證實了Pg在腦微環(huán)境中對MAs的調(diào)節(jié)機制。本研究的目的是為構(gòu)建動物模型以及研究Pg感染人源星形膠質(zhì)細胞后對食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)腦轉(zhuǎn)移影響做前期實驗。根據(jù)研究結(jié)果推測，降低Pg在患者腦中的定植和降低星形膠質(zhì)細胞CCL2的表達可能有助于預(yù)防和靶向治療ESCC腦轉(zhuǎn)移，并為其他癌癥腦轉(zhuǎn)移的預(yù)防和靶向治療提供新的思路。