大鼠急性腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的MRI評估＊

李淑健 程敬亮 張 勇 張贊霞

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院磁共振科(河南 鄭州 450000)

針對腦卒中的早期溶栓治療可以恢復(fù)缺血區(qū)血供，減輕腦損傷，改善預(yù)后，但是同時引起的腦缺血再灌注損傷也對治療方案的選擇帶來困擾。臨床研究[1]發(fā)現(xiàn)，5%～6%的溶栓治療病人會出現(xiàn)伴有占位效應(yīng)的嚴(yán)重出血，使腦卒中病人的死亡率增加11倍，而出血轉(zhuǎn)化(hemorrhagic transformation，HT)的發(fā)生與血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)開放導(dǎo)致的腦組織繼發(fā)性損傷有關(guān)。動態(tài)增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging,DCE-MRI)可以無創(chuàng)、定量監(jiān)測活體BBB通透性，較傳統(tǒng)技術(shù)有了很大的進(jìn)步[2-3]。該技術(shù)利用藥代動力學(xué)模型擬合對比劑透過破壞的BBB進(jìn)入腦實質(zhì)的過程，通過容積轉(zhuǎn)運常數(shù)(Ktrans)實現(xiàn)了對BBB通透性改變的定量分析。

以往研究主要通過常規(guī)增強(qiáng)半定量判斷腦卒中后BBB是否破壞[4]，應(yīng)用DCE-MRI技術(shù)定量評估腦卒中后BBB變化規(guī)律的研究較少，且在腦卒中急性期的監(jiān)測時間點有限。本研究利用DCE-MRI探究大鼠急性腦缺血再灌注后BBB通透性的變化情況，通過與組織學(xué)“金標(biāo)準(zhǔn)”伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)染色對照分析，評價Ktrans定量測定在大鼠腦缺血再灌注后BBB破壞中的檢測價值。

1 資料與方法

1.1 動物分組隨機(jī)選取體重250～300 g健康雄性SD大鼠60只，平均體重(270.3±7.5)g。所有實驗動物由河南省動物實驗中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為實驗組和假手術(shù)組，實驗組分為拔栓前缺血2h(再灌注0h)、再灌注1h、3h、6h、24h，共5組，每組10只，假手術(shù)組10只。

1.2 腦缺血模型制備采用改良的Zea-Longa線栓法[5]建立大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。實驗組大鼠出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓或肌力減低，右側(cè)Homer征陽性以及MRI彌散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging,DWI)上右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)出現(xiàn)彌散受限視為MCAO模型制作成功，線栓退出后行PWI檢查出現(xiàn)右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)血供恢復(fù)視為MCAO模型再灌注成功。假手術(shù)組操作過程除線栓插入深度約5mm，其余步驟與實驗組相同，以保證線栓位于頸內(nèi)動脈顱內(nèi)的以遠(yuǎn)處。MCAO模型制作成功后，根據(jù)Garcia JH建立的神經(jīng)功能評分法對大鼠相應(yīng)時間點神經(jīng)功能進(jìn)行評分，最高18分，代表功能正常；最低3分，代表嚴(yán)重的功能損傷(見表1)。

表1 大鼠MCAO模型神經(jīng)功能評分

1.3 MRI檢查與圖像分析使用3.0 T GE 750超導(dǎo)MRI檢查儀和大鼠專用4通道表面線圈行MRI掃描。實驗組和假手術(shù)組大鼠分別行冠狀位T1WI、T2WI、DWI、DCE-MRI、灌注加強(qiáng)成像(perfusion weighted imaging,PWI)和延遲增強(qiáng)T1WI檢查。掃描參數(shù)如下：快速自旋回波(fast spin echo,FSE)序列T1WI：TR=1813ms，TE=24ms，層厚=1.8 mm，層間距=0.2mm，F(xiàn)OV=50mm×50mm，矩陣=192×192，激勵次數(shù)(number of excitation，NEX)=2；快速自旋回波(fast spin echo,FSE)序列T2WI：TR=3547ms，TE=85ms，F(xiàn)OV、層厚、層間距、激勵次數(shù)、矩陣同TIWI；自旋回波-平面回波(SE-EPI)序列DWI：TR=3340ms，TE=110ms，矩陣=96×96，F(xiàn)OV、層厚、層間距、激勵次數(shù)同TIWI，b=0、800s/mm2；DCE-MRI：采用GE LAVA序列，TR=8.8ms，TE=2.4ms，F(xiàn)OV=80 mm×80mm，矩陣=126×126，NEX=1.00，翻轉(zhuǎn)角=12°，層厚、層間距同TIWI，動態(tài)增強(qiáng)掃描前采用3°、6°、9°、12°、15°共5個翻轉(zhuǎn)角行T1-Mapping掃描。DCE-MRI共包括60次重復(fù)采集，單次采集時間7 s，總時間為420 s；PWI：TR=600 ms，TE=21ms，翻轉(zhuǎn)角=90°，F(xiàn)OV、層厚、層間距同T1WI；為了定量測量腦血流灌注和微血管通透性，需兩次經(jīng)股靜脈團(tuán)注對比劑釓噴替酸葡甲胺(1mL/kg，注射時間＜3s)，第一次團(tuán)注用于測量微血管通透性并作為第二次團(tuán)注測腦血流灌注的預(yù)負(fù)荷量，以往研究[6]發(fā)現(xiàn)，預(yù)負(fù)荷量可以減少對比劑滲漏對灌注圖像的影響。注射對比劑30min后作冠狀位T1WI延遲增強(qiáng)掃描，掃描參數(shù)同T1WI。

DCE-MRI序列后處理運用CINETOOL 2.0軟件(GE Healthcare，China)，通過對多翻轉(zhuǎn)角圖像處理計算出T1Mapping，動脈輸入函數(shù)(vascular input function，VIF)選擇上矢狀竇，將動態(tài)增強(qiáng)圖像的時間-信號強(qiáng)度曲線轉(zhuǎn)換為時間-對比劑濃度曲線，利用藥代動力學(xué)兩室模型Modified Tofts計算出Ktrans圖。PWI序列后處理使用GE后處理工作站的Functool軟件，計算出反應(yīng)腦血流灌注的腦血流量(cerebral blood volume,CBV)圖。參照DWI、增強(qiáng)T1WI圖，于Ktrans圖上選擇梗死區(qū)內(nèi)異常信號畫劃取感興趣區(qū)(regions of interest,ROI)，避開血管，測量三次取平均Ktrans值。在平掃與增強(qiáng)T1WI圖像測量缺血側(cè)強(qiáng)化區(qū)域的信號強(qiáng)度(signal intensity,SI)，根據(jù)以下公式求出增強(qiáng)后相對信號強(qiáng)度百分比rSI=缺血側(cè)增強(qiáng)后SI/增強(qiáng)前SI×100%。增強(qiáng)后局部SI增加10%以上者認(rèn)為有強(qiáng)化。CBV及假手術(shù)組、無肉眼觀察強(qiáng)化者ROI選取均為視交叉水平層面(前囟后0.5mm)的皮層和基底節(jié)區(qū)直徑2mm的圓形范圍。為降低個體差異所引起的血流誤差，計算CBV的相對值(缺血側(cè)/健側(cè))，得到rCBV。

1.4 伊文思藍(lán)染色假手術(shù)組和實驗組大鼠完成各時間點(再灌注0h、1h、3h、6h、24h)掃描后，行EB染色。于股靜脈插管注入2%EB(4mL/kg)，30 min后經(jīng)心臟灌注100mL生理鹽水直至右心耳流出清亮液體。斷頭取腦，按照MR掃描的層面切成2mm厚的腦片，拍照觀察缺血灶藍(lán)染情況。分別取兩側(cè)大腦半球，稱重后置入10%的三氯乙酸溶液中。勻漿、離心，取上清液用乙醇稀釋后，分光光度儀在波長為620nm處比色，依據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析EB含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料首先進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()描述。兩組數(shù)據(jù)比較運用獨立樣本或配對樣本t檢驗，多組比較使用單因素方差分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗。Ktrans值、rSI和EB含量用相關(guān)性分析，滿足雙變量正態(tài)分布用Pearson相關(guān)，否則用Spearman等級相關(guān)。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MACO模型建立實驗組和假手術(shù)組共60只大鼠于術(shù)前行MRI頭顱平掃，均未發(fā)現(xiàn)異常。實驗組8只大鼠分別因DWI上發(fā)現(xiàn)缺血區(qū)未累積皮層區(qū)、PWI上未出現(xiàn)再灌注及未到觀察點死亡而被排除實驗。再灌注0h、1h、3h、6h、24h組納入實驗的大鼠數(shù)量分別為9、9、8、8、8。實驗組和假手術(shù)組大鼠術(shù)后的神經(jīng)功能評分，見表2。

表2 假手術(shù)組與實驗組大鼠術(shù)后神經(jīng)功能評分

2.2 再灌注評估再灌注前(再灌0 h組)CBV偽彩圖出現(xiàn)明顯灌注缺損，再灌注1 h、3 h、6 h、24 h組rCBV均高于再灌0 h組(P＜0.05)，除再灌注24 h組(P＞0.05)，余實驗組與假手術(shù)組rCBV具有顯著差異(P＜0.05)(見表3)。

2.3 大鼠BBB通透性MRI分析再灌注1h、3h、6h、24h組大鼠缺血區(qū)Ktrans圖均出現(xiàn)異常，缺血側(cè)Ktrans值與假手術(shù)組、再灌注0 h組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，其中再灌注6h組Ktrans值高于其他實驗組(P＜0.05)(見表3)(圖1)。再灌注1h、3h、6h、24h組分別有3例、5例、5例、7例出現(xiàn)強(qiáng)化，除0h、24h組(P＞0.05)，余實驗組延遲增強(qiáng)T1WI強(qiáng)化率與Ktrans圖異常率相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。計算各實驗組強(qiáng)化rSI，于再灌注24 h出現(xiàn)強(qiáng)化高峰(P＜0.05)(見表3)(圖2)。

表3 假手術(shù)組與實驗組rCBV、Ktrans 值和rSI

2.4 EB染色結(jié)果再灌注1h、3h、6h、24h組分別有5例、5例、8例、8例出現(xiàn)EB滲漏藍(lán)染區(qū)。分光光度儀比色測量各個時間點實驗組缺血側(cè)EB含量與假手術(shù)組相比，除再灌注0h組外(P＞0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，實驗組各個時間點缺血側(cè)EB含量與對側(cè)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表4)。

表4 假手術(shù)組與實驗組腦組織EB含量(單位：μg/g)

2.5 MRI與EB染色相關(guān)性分析分析Ktrans值、rSI與EB染色定量相關(guān)性，Ktrans值與EB含量呈正相關(guān)(r=0.69，P＜0.05)，rSI與EB含量無明顯線性相關(guān)(r=0.31，P＞0.05)。分析Ktrans值、rSI與rCBV相關(guān)性，rSI與rCBV呈正相關(guān)(r=0.78，P＜0.01)，Ktrans值與rCBV無明顯線性相關(guān)(r=0.25，P＞0.05)。

圖1A～圖1E 再灌注0、1、3、6、24h組Ktrans圖像比較，再灌注0h未見異常，從再灌注1h開始大鼠缺血區(qū)開始出現(xiàn)異常，持續(xù)至再灌注24h，其中再灌注6h組Ktrans值高于其他實驗組(P＜0.05)。圖2A～圖2E 再灌注0、1、3、6、24h組延遲增強(qiáng)T1WI圖像比較，再灌注0 h可見淺淡強(qiáng)化，再灌注1h、3h缺血側(cè)基底節(jié)區(qū)出現(xiàn)小片狀及片狀強(qiáng)化，再灌注6h組強(qiáng)化范圍較前增大，24h組強(qiáng)化范圍累積皮層和皮層下區(qū)。

3 討論

以往對BBB的研究局限于組織學(xué)方法，不能用于在體研究和動態(tài)觀察。近年來有國外研究[7-8]利用專用動物MRI掃描儀完成了大鼠BBB通透性的定量分析，但是由于專用動物MRI掃描儀不普及，該技術(shù)仍很少應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。本研究利用臨床3.0 T掃描儀對大鼠BBB通透性進(jìn)行定量及半定量分析，與組織學(xué)“金標(biāo)準(zhǔn)”對照，探究MRI新技術(shù)在腦缺血再灌注基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。

DCE-MRI應(yīng)用動態(tài)成像跟蹤對比劑隨時間透過破壞的BBB擴(kuò)算到組織中的情況，獲得BBB通透性改變的信息。Ktrans代表對比劑從血管內(nèi)向血管外細(xì)胞外空間的單向通透程度，單位是min-1。BBB通透性增高、存在血流灌注是保證對比劑滲漏到血管外間隙、Ktrans值能夠測量的前提。本實驗發(fā)現(xiàn)再灌注0 h組Ktrans圖未見異常，從再灌注1 h開始大鼠缺血區(qū)Ktrans圖出現(xiàn)異常，持續(xù)至再灌注24h，其中再灌注6h組Ktrans值高于其他實驗組(P＜0.05)。上述研究結(jié)果說明從再灌注1 h起B(yǎng)BB通透性就開始升高，到達(dá)再灌注6h時BBB通透性達(dá)到最高，至再灌注24h時BBB通透性較前有所下降，但仍處于異常狀態(tài)。腦缺血BBB開放的時間比較復(fù)雜，一般認(rèn)為短暫性腦缺血后BBB呈雙相性開放，永久腦缺血只存在單相變化。短暫性腦缺血再灌注后由于能量障礙、炎性反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、蛋白酶的激活、凋亡基因激活等多個環(huán)節(jié)相互影響，惡性循環(huán)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或壞死，腦血管結(jié)構(gòu)改變，BBB功能破壞，血管再通后較短時間內(nèi)時BBB通透性明顯增加，經(jīng)過短暫下降后于24-48 h再次升高，但不同的研究結(jié)果有一定的差異[9-11]。Ramadan等[9]發(fā)現(xiàn)再灌注直到4周BBB持續(xù)開放，并且滲漏程度是隨著時間減小的，該實驗并未得出雙相開放的結(jié)果，考慮可能與研究時間有關(guān)，僅觀察24 h之內(nèi)的Ktrans值變化規(guī)律，與本實驗結(jié)果一致。Kim等[10]運用DCE-MRI定量測量BBB通透性，發(fā)現(xiàn)Ktrans在腦缺血再灌注后2-3 h即可出現(xiàn)明顯升高。Hoffmann等[11]研究結(jié)果表明Ktrans在再灌注后4 h對HT具有較高的預(yù)測價值。

常規(guī)增強(qiáng)中BBB開放區(qū)域可表現(xiàn)為缺血區(qū)腦實質(zhì)的異常強(qiáng)化，通過計算rSI對BBB開放程度進(jìn)行半定量分析。該技術(shù)計算簡單，但不能精確評估組織內(nèi)對比劑濃度，半定量參數(shù)與病變組織生理、對比劑動力學(xué)的關(guān)系尚不明確[12]。本實驗中延遲增強(qiáng)T1WI強(qiáng)化率低于Ktrans圖異常率(P＜0.05)，說明DCE-MRI可以發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)圖像上未出現(xiàn)強(qiáng)化的BBB異常區(qū)。Pillai等[13]利用常規(guī)增強(qiáng)發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注后4 h和48 h為BBB雙相開放時間，與本研究再灌注24 h出現(xiàn)強(qiáng)化高峰(P＜0.05)的結(jié)果不一致。本研究還發(fā)現(xiàn)rSI與灌注參數(shù)rCBV呈正相關(guān)，說明rSI不僅取決于BBB通透性，還受血流灌注影響。因此，利用常規(guī)增強(qiáng)判斷BBB破壞程度時需結(jié)合反映微循環(huán)的灌注加權(quán)成像來全面分析。

本研究應(yīng)用EB染色離體評價BBB通透性，利用組織學(xué)方法再次表明腦缺血再灌注后BBB通透性增加，Ktrans值與EB含量呈正相關(guān)(P＜0.05)，該結(jié)果進(jìn)一步支持DCE-MRI對腦缺血再灌注后BBB通透性的定量評估價值。但是，Ktrans異常區(qū)域與EB藍(lán)染區(qū)并不是完全一致，考慮由于對比劑與EB的分子量及外滲機(jī)制不同，造成兩者在組織間的分布差異[13]。Hoffmann等[14]在研究自發(fā)性高血壓大鼠和Wistar大鼠腦缺血再灌注后BBB通透性改變時發(fā)現(xiàn)，所有在EB染色上確認(rèn)有BBB破壞的區(qū)域，測量其Ktrans值均高于非梗死組織，Ktrans值與EB滲漏程度相關(guān)。

本研究利用臨床3.0 T掃描儀對大鼠急性腦缺血再灌注后BBB通透性進(jìn)行定量及半定量分析，由于觀察時間為24h以內(nèi)，本文沒有進(jìn)一步探討B(tài)BB通透性與再灌注損傷的關(guān)系，下一步將延長再灌注時間，結(jié)合T2maping和ESWAN序列，更全面地分析BBB通透性在腦水腫演變和HT發(fā)生中的作用。