牙齦卟啉單胞菌第Ⅸ分泌系統(tǒng)組成的研究進(jìn)展

李碧榕，蔡 青，尹昭懿，王子璇，孟維艷

牙齦卟啉單胞菌是一種革蘭氏陰性桿菌，可分泌血凝素、脂多糖、牙齦蛋白酶等多種毒力因子，是牙周炎的主要致病菌[1-5]。牙齦卟啉單胞菌第Ⅸ分泌系統(tǒng)(type Ⅸ secretion system，T9SS)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種存在于擬桿菌屬的新型分泌系統(tǒng)，可以將細(xì)菌胞內(nèi)合成的蛋白跨外膜運(yùn)輸至細(xì)菌細(xì)胞表面[6-8]。牙齦卟啉單胞菌可以通過T9SS分泌至少30種蛋白質(zhì)，其中包括主要毒力因子牙齦蛋白酶(Kgp，RgpA，RgpB)[3,9]。本文將從牙齦卟啉單胞菌T9SS結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子兩個(gè)方面介紹其跨外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白裝置的組成及功能，以便理解該菌毒力因子的分泌機(jī)制，為疾病的治療策略提供新的思路。

1 T9SS組成和分泌

目前已知T9SS至少由16種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成[10-12]，這些蛋白按照在細(xì)胞膜上的定位可分為以下5種：包埋于內(nèi)膜的蛋白(PorL、PorM)，包埋于外膜的蛋白(PorG、PorT、PorP、Sov、PorV、PorQ、PorF、Plug)，與外膜相關(guān)并定位于周質(zhì)的脂蛋白(PorE、PorK、PorW)，錨定在細(xì)胞表面的蛋白(PorU、PorZ)和周質(zhì)蛋白(PorN)[12-23]。PorU和PorZ分別通過PorV和PorQ錨定于細(xì)胞表面[17]，PorN通過PorK錨定于外膜，定位于周質(zhì)內(nèi)[14]。PorK-PorN-PorM-PorL構(gòu)成跨周質(zhì)核心復(fù)合體，Sov和PorV構(gòu)成外膜轉(zhuǎn)位復(fù)合體，PorU-PorZ-PorV-PorQ構(gòu)成附著在外膜上的附著復(fù)合體[22]，PorM和PorW可能形成了能量轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體，PorP和PorT可能是O-脫?；竅11]。外膜相關(guān)蛋白中的任何一個(gè)蛋白失活都會(huì)導(dǎo)致T9SS貨物蛋白在周質(zhì)中的滯留和分泌減少，從而降低牙齦卟啉單胞菌的毒力。T9SS分泌的貨物蛋白可以被運(yùn)輸至細(xì)胞表面[24]。在分泌過程中，貨物蛋白的C端保守結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain signal，CTD)被切割后產(chǎn)生的新末端連接到陰離子脂多糖(A-LPS)上，形成毒力涂層，即電子致密表層(electron-dense surface layer，EDSL)[25-27]。T9SS向外膜分泌蛋白的調(diào)控系統(tǒng)由PorX和PorY組成的雙組分系統(tǒng)(two-component system，TCS)及其下游的胞質(zhì)外功能(extracytoplasmic function，ECF)σ因子SigP組成[28]。最近有研究發(fā)現(xiàn)一種新型含CTD的T9SS蛋白PorA能夠調(diào)節(jié)PorXY-SigP信號(hào)通路[29]。

2 結(jié)構(gòu)蛋白

2.1 跨周質(zhì)核心復(fù)合體

T9SS功能所需的18個(gè)基因中，porK、porL、porM和porN這4個(gè)基因位于同一個(gè)共轉(zhuǎn)錄的操縱子上，表達(dá)跨周質(zhì)核心復(fù)合體PorK-PorN-PorM-PorL。PorM-PorK、PorM-PorN、PorK-PorN以及PorP-PorK/PorM之間存在相互作用，PorP是PorK-PorN-PorM-PorL復(fù)合體的輔助成分，被認(rèn)為可以與該復(fù)合體在特定條件下結(jié)合，存在不穩(wěn)定的相互作用[18]。

PorM、PorN和PorK形成同源二聚體，而PorL形成同源三聚體，共同組成PorL3/PorM2/PorN2-PorK2跨周質(zhì)核心復(fù)合體(圖1紫色部分)，其總質(zhì)量約為410 ku[18]。PorM是這個(gè)跨周質(zhì)核心復(fù)合體的核心成分，連接內(nèi)膜(PorL-PorM)和外膜(PorK-PorN)復(fù)合物。PorL由跨膜螺旋和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(PorLC)組成，PorM由跨膜螺旋和周質(zhì)結(jié)構(gòu)域(PorMP)組成[18]。PorM二聚體包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，即D1～D4，呈不對(duì)稱纏繞的桿狀，長度約180?[21-22]。PorM二聚體通過它的2個(gè)螺旋與PorL三聚體的3個(gè)螺旋相互作用，將PorM一端錨定于內(nèi)膜。細(xì)菌雙雜交分析顯示PorL與PorM的相互作用不涉及PorLC。PorMP和PorN在外膜附近發(fā)生了寡聚，PorM通過其D4結(jié)構(gòu)域與PorK-PorN環(huán)形結(jié)構(gòu)結(jié)合，PorM的一端借助PorK-PorN環(huán)形結(jié)構(gòu)錨定于外膜，使PorM跨越整個(gè)周質(zhì)，成為連接外膜成分和內(nèi)膜成分的紐帶[18,21-22]。

圖1 T9SS結(jié)構(gòu)和功能示意圖

PorK和PorN在周質(zhì)側(cè)的外膜附近以1∶1化學(xué)計(jì)量比相互作用，形成了一個(gè)直徑50 nm的環(huán)形結(jié)構(gòu)，該大環(huán)由兩個(gè)子環(huán)組成，其中較大的子環(huán)由PorK亞基組成，較小的子環(huán)由PorN亞基組成，PorK環(huán)的脂質(zhì)成分將這個(gè)復(fù)合體錨定于外膜[14]。Gorasia等[14]通過化學(xué)交聯(lián)和質(zhì)譜分析推測該環(huán)形結(jié)構(gòu)可能通過與PGN_0297(PG0189)外膜蛋白結(jié)合來穩(wěn)定錨定在外膜上，并且該環(huán)形結(jié)構(gòu)的形成與PorL或PorM無關(guān)，PorL和PorM能夠形成一個(gè)獨(dú)立于PorK和PorN的穩(wěn)定復(fù)合物，而Sato等[30]推測認(rèn)為PorK、PorN、PorL和PorM相互作用共同形成一個(gè)大的復(fù)合體[14,30-32]。

PorK、PorL和PorM的穩(wěn)定表達(dá)需要PorN，PorN的表達(dá)也需要PorK的保護(hù)，從而共同形成穩(wěn)定的環(huán)。PorK-PorN環(huán)形結(jié)構(gòu)可能構(gòu)成T9SS分泌通道的一部分[14]，該結(jié)構(gòu)可能與外膜上的分泌孔相連，并通過操縱裝置調(diào)節(jié)貨物蛋白進(jìn)出，但目前還沒有明確的論據(jù)來證明具體是由哪種物質(zhì)來調(diào)節(jié)其分泌的[21-22]。

PorL-PorM可能調(diào)控PorK-PorN環(huán)形結(jié)構(gòu)的開放，且PorL為PorM提供能量，質(zhì)子流導(dǎo)致跨周質(zhì)的PorM相對(duì)于內(nèi)膜上5個(gè)PorL組成的環(huán)旋轉(zhuǎn)，從而驅(qū)動(dòng)外膜蛋白質(zhì)運(yùn)輸，這種能量通過PorK-PorN傳遞到外膜[33]。Vincent等[18]認(rèn)為PorL-PorM作為一個(gè)能量轉(zhuǎn)換復(fù)合體，將化學(xué)能(質(zhì)子動(dòng)力或ATP)轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，并為T9SS的組裝或底物通過外膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量。Emrizal等[11]通過基因序列分析，推測PorM還可能和PorW形成了能量轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體，并通過T9SS激活底物轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.2 外膜轉(zhuǎn)位復(fù)合體

約氏黃桿菌中的易位子SprA是牙齦卟啉單胞菌中Sov的同源物，牙齦卟啉單胞菌的Sov可能具有類似SprA跨外膜轉(zhuǎn)運(yùn)貨物蛋白的功能[8]。SprA形成一個(gè)極大的(36鏈)單肽跨外膜β桶，直徑約為7.0 nm，足夠容納折疊的貨物蛋白，其頂端具有兩個(gè)開口，一個(gè)通向周質(zhì)側(cè)，另一個(gè)通向外膜表面[20]。SprA與T9SS不同成分結(jié)構(gòu)結(jié)合，控制跨膜通道的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。SprA存在以下兩種結(jié)合情況：SprA與肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PⅡ)和PorV結(jié)合形成PorV復(fù)合體，或SprA與PⅡ和Plug蛋白結(jié)合形成Plug復(fù)合體[20]。SprA桶運(yùn)輸結(jié)構(gòu)的兩端分別被Plug蛋白(周質(zhì)側(cè)開口)和PorV(外膜表面?zhèn)认蜷_口)封閉，這兩種蛋白與SprA的結(jié)合是互相排斥的，當(dāng)SprA形成PorV復(fù)合體時(shí)，允許SprA桶通道從周質(zhì)中攝取貨物蛋白，而當(dāng)SprA形成Plug復(fù)合體時(shí)，則代表貨物蛋白已經(jīng)被釋放到外膜表面[20]，PorV可能通過識(shí)別T9SS底物CTD蛋白并相互作用，觸發(fā)PorV-底物復(fù)合物從SprA桶中釋放[17]，同時(shí)Plug蛋白封閉SprA桶的周質(zhì)側(cè)開口，直到PorV再次結(jié)合在側(cè)面開口，實(shí)現(xiàn)了底物通過T9SS單向運(yùn)輸[20]。牙齦卟啉單胞菌中的Sov和PorV在T9SS中可能也發(fā)揮相似作用。

2.3 外膜表面附著復(fù)合體

外膜蛋白PorU和PorZ分別通過與PorV和PorQ的相互作用錨定在細(xì)胞表面，形成PorU-PorZ-PorV-PorQ附著復(fù)合體(圖1綠色部分)。PorU是一種轉(zhuǎn)肽酶，通過PorV錨定于外膜[17]，其在細(xì)胞表面暴露的同時(shí)需要PorZ的存在[16]。OmpH樣蛋白Omp17可能作為分子伴侶參與PorU向外膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，PorU可能是T9SS的最后一個(gè)分泌到表面的成分[16,34]。在T9SS將貨物蛋白易位至外膜的過程中，PorU切割貨物蛋白CTD，并將產(chǎn)生的新末端連接到陰離子脂多糖(A-LPS)上，使貨物蛋白錨定在細(xì)菌外膜表面[25,35]。PorU可以通過切割RgpB前體(proRgpB)酶原N末端原結(jié)構(gòu)域(prodomain，PD)來激活牙齦蛋白酶RgpB；另外，PorU還可能通過一種非典型的分泌型或表面表達(dá)型蛋白酶間接介導(dǎo)PD的切割，從而調(diào)節(jié)proRgpB的激活，牙齦蛋白酶RgpB的活性或分泌依賴于PorU[9]。

PorZ位于外膜及外膜囊泡中，其晶體結(jié)構(gòu)顯示有兩個(gè)β-螺旋結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-末端的β-夾心結(jié)構(gòu)域，它具有完整的CTD結(jié)構(gòu)域，通過T9SS運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面，沒有被PorU切割[16]。Lasica等[16]發(fā)現(xiàn)在PorU缺失的突變體中，PorZ依然可以被轉(zhuǎn)運(yùn)至外膜，反之在PorZ缺失的突變體中，PorU無法被轉(zhuǎn)運(yùn)至外膜，說明PorZ暴露于細(xì)胞表面與PorU的活性無關(guān)，而PorZ的缺失可以阻止PorU暴露于細(xì)胞表面，這可能是由于PorZ可以直接與PorQ結(jié)合[16-17]。PorZ可以對(duì)T9SS貨物蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，包括酶前體的成熟、CTD的去除以及結(jié)合并呈遞A-LPS到PorU[36]。

PorV作為外膜穿梭蛋白可以與T9SS分泌至外膜的貨物蛋白CTD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將其呈遞給PorU切割，并輸送至外膜分泌裝置Sov通道[17,20]。

2.4 外膜支架蛋白

PorE是一種定位在外膜周質(zhì)側(cè)的脂蛋白，可能作為連接T9SS周質(zhì)和外膜組分的重要支架發(fā)揮作用。PorE在T9SS底物分泌中發(fā)揮重要作用，不影響A-LPS的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。應(yīng)用計(jì)算機(jī)對(duì)PorE的結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，推測PorE具有一個(gè)新的N-到C-末端結(jié)構(gòu)，包括一個(gè)四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)五葉β-螺旋體結(jié)構(gòu)域、一個(gè)羧肽酶調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域樣折疊和一個(gè)OmpA_C樣肽聚糖結(jié)合域[15]。Park等[37]提出具有OmpA_C樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)通過連接外膜和肽聚糖來穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Trinh等[23]證明PorE可以與牙齦卟啉單胞菌外膜上肽聚糖中的干肽相互作用，PorE可作為外膜和肽聚糖網(wǎng)絡(luò)之間的橋梁，將T9SS錨定在外膜上。

牙齦卟啉單胞菌T9SS運(yùn)輸貨物蛋白(caogo protein)的過程我們推測如下。貨物蛋白通過Sec復(fù)合體，其N-末端信號(hào)肽(signal peptide，SP)被切割，之后被招募到跨周質(zhì)核心復(fù)合體。貨物蛋白通過其CTD結(jié)構(gòu)域與PorM結(jié)合，并被傳遞至PorN和PorK，最終到達(dá)Sov外膜轉(zhuǎn)位復(fù)合體。貨物蛋白通過Sov通道蛋白后，依靠其CTD結(jié)構(gòu)域被PorV捕獲。同時(shí)A-LPS獨(dú)立運(yùn)輸?shù)酵饽?，并被PorU-PorZ-PorV-PorQ附著復(fù)合體募集。PorV將貨物蛋白傳遞給PorU，PorU將CTD結(jié)構(gòu)域切割并結(jié)合A-LPS，CTD被釋放到細(xì)胞外界環(huán)境中。

3 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

3.1 PorX和PorY

PorX是一種反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，而PorY是一種組氨酸激酶，它們組成雙組分系統(tǒng)來調(diào)控T9SS基因的轉(zhuǎn)錄[38]。PorX由一個(gè)CheY樣受體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PglZ功能未知結(jié)構(gòu)域組成，PorY細(xì)胞質(zhì)組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域通過跨膜發(fā)夾結(jié)構(gòu)固定在內(nèi)膜上。它們可以激活牙齦卟啉單胞菌中porK，porN，porL，porM，porT，porP和sov基因的表達(dá)[28,30]。另外，PorX/PorY系統(tǒng)能夠通過與氯化血紅素作用使牙齦卟啉單胞菌對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生抗性[39]。

Vincent等[38]證明，PorX不結(jié)合T9SS基因啟動(dòng)子，也不直接激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，而是在它被PorY激活后，通過內(nèi)膜上PorL的C末端疏水結(jié)構(gòu)介導(dǎo)與PorL胞質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域相互作用，從而被移位至T9SS分泌裝置的基底部(圖2)，通過動(dòng)力學(xué)作用來促進(jìn)T9SS蛋白的表達(dá)。

3.2 SigP

SigP是胞質(zhì)外功能(ECF)σ因子家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[19,40]，參與調(diào)控牙齦卟啉單胞菌表達(dá)毒力因子，可以增強(qiáng)牙齦蛋白酶活性，促進(jìn)自凝集、血凝以及外膜囊泡的形成[41]。SigP可以與T9SS貨物蛋白基因的啟動(dòng)子結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄[28]。PorY激活的PorX還可誘導(dǎo)SigP基因的表達(dá)[29]。Kadowaki等[28]發(fā)現(xiàn)PorX可以與SigP相互作用并穩(wěn)定SigP形成異源二聚體，共同發(fā)揮激活T9SS基因轉(zhuǎn)錄的作用(圖2)。PorXY雙組分系統(tǒng)可以通過SigPECFσ因子促進(jìn)T9SS分泌蛋白質(zhì)[28]。

圖2 T9SS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子示意圖

3.3 PorA

PorA是一種新型含CTD的T9SS蛋白，存在于外膜表面。PorA可以調(diào)節(jié)PorXY-SigP信號(hào)通路，是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)參與T9SS結(jié)構(gòu)蛋白基因調(diào)控的含CTD T9SS蛋白，并且其分泌并不依賴Sov通道。PorA在細(xì)胞表面有兩種存在形式：第一種是PorA的CTD被PorU切割，而后其末端與A-LPS共價(jià)結(jié)合；第二種是PorA將CTD保留，共同定位于細(xì)胞表面，這種形式的PorA具有激活PorXY-SigP信號(hào)通路的能力，從而增加T9SS基因的表達(dá)[29]。

4 展 望

牙周炎中，菌斑生物膜可導(dǎo)致免疫微環(huán)境的失衡與破壞，其代謝產(chǎn)生的牙齦蛋白酶等毒力因子能夠激發(fā)機(jī)體固有免疫應(yīng)答，引起炎癥反應(yīng)，造成組織壞死[42]。牙齦卟啉單胞菌通過T9SS分泌包括牙齦蛋白酶等在內(nèi)的多種毒力因子。抑制T9SS可以使牙齦卟啉單胞菌的毒力減弱，并且使牙齦卟啉單胞菌可以迅速被機(jī)體免疫系統(tǒng)從組織中清除，因此T9SS可以作為治療牙周炎的藥物靶點(diǎn)。牙齦卟啉單胞菌T9SS結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的相關(guān)研究，可以幫助研究人員了解毒力因子產(chǎn)生的過程，并且為藥物研制等提供理論基礎(chǔ)，但目前仍有許多功能尚不清楚的T9SS蛋白，T9SS各組成部分之間的相互調(diào)控和能量傳遞還有待進(jìn)一步研究。