不同再礦化處理對漂白后釉質(zhì)表面形貌及鈣磷比的影響

王婧嬋，李艷萍，何麗娜，牛玉梅

牙齒漂白作為一種減輕牙齒變色的保守方法[1]，已經(jīng)為患者帶來了許多美學(xué)益處[2]。然而，漂白劑是否會影響釉質(zhì)的表面性能現(xiàn)有的研究仍然存在爭議[3-5]。盡管過氧化物不會引起牙釉質(zhì)表面宏觀結(jié)構(gòu)的改變[6]，但多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)高濃度的過氧化物會導(dǎo)致釉質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的改變[7-9]，例如釉質(zhì)粗糙度增加、顯微硬度降低、表面形態(tài)改變以及鈣磷含量降低。雖然造成這些不利影響的原因國內(nèi)外學(xué)者報(bào)道不盡相同[10-11]，但過氧化物漂白的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。研究表明，漂白后使用再礦化劑可以修復(fù)這種微觀結(jié)構(gòu)的改變[12]。

原花青素(procyanidins，PC)是一種天然的植物代謝物，因其良好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗凋亡和抗癌性能備受關(guān)注。一些水果中存在的PC可以防止活性氧造成的傷害，抑制糖基轉(zhuǎn)移酶和變形鏈球菌產(chǎn)生的酸。以往的研究表明，PC能夠中和殘留于牙面的氧以及氧自由基，促進(jìn)漂白后牙體與復(fù)合樹脂的即刻粘接，并且其對牙體硬組織的生物調(diào)節(jié)具有強(qiáng)效作用，可用作膠原蛋白交聯(lián)劑，提高膠原強(qiáng)度，增強(qiáng)膠原耐酶解能力[13]。酪蛋白磷酸肽-無定形磷酸鈣(casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate，CPP-ACP)從牛奶中提取出來，可以作為鈣和磷酸鹽的儲存庫，與主要使病變淺表區(qū)域再礦化的氟化物不同，CPP-ACP由于其分子尺寸較小，可以使病變的更深區(qū)域再礦化[14]。但目前關(guān)于其對漂白后釉質(zhì)再礦化的作用鮮見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察PC及CPP-ACP對漂白后釉質(zhì)再礦化能力以及顏色的影響，為漂白后釉質(zhì)脫礦的防治提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 低速切割機(jī)SYJ-150(中國沈陽科晶公司)；色差儀ZE6000(日本電色)；原子力顯微鏡(美國 Bruker DIMENSION ICON 公司)；掃描電鏡SU8010(日本日立公司)；Element型氮化硅(Si3N4)超薄窗口電制冷能譜儀(美國EDAX公司)。

1.1.2 試劑 40% HP Opalescence Boost 皓齒診室美白劑(Ultradent 公司，美國)；原花青素(純度>95%，合肥博美生物科技有限公司)；CPP-ACP(日本 GC 株式會社)；人工唾液：(ISO/TR10271標(biāo)準(zhǔn))NaCl 0.4 g、KCl 0.4 g、CaCl20.795 g、NaH2PO4·2H2O 0.78 g、Na2S·2H2O 0.005 g、尿素1.0 g，蒸餾水稀釋至1 000 mL，pH值為6.8(東莞市信恒科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛切牙的處理 2021年6月10日在黑河市愛輝區(qū)養(yǎng)牛場購買60顆同一品種牛新鮮的離體切牙，徹底清除殘留物，用低速切割機(jī)將冠根分離，去除冠髓，去離子水沖凈，再用超聲清洗30 min，選取大小均一、無裂痕的牙冠，使用前將牙冠保存在4 ℃生理鹽水中。

1.2.2 釉質(zhì)塊的制備 牛切牙自然晾干，石膏包埋后，用低速切割機(jī)切成8 mm×8 mm小塊，共獲得符合實(shí)驗(yàn)要求的樣本77個(gè)。丙烯酸樹脂包埋，在流水下依次用500、1 000、2 000目碳化硅砂紙打磨拋光(磨除約100 μm)，涂布抗酸指甲油，暴露5 mm×5 mm的釉質(zhì)開窗區(qū)。隨機(jī)選取11個(gè)樣本作為漂白前對照組。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 剩余66個(gè)樣本使用皓齒診室美白劑進(jìn)行漂白，在釉質(zhì)表面均勻涂抹一層美白劑，20 min后去除凝膠，重復(fù)2次，徹底沖洗吹干試件表面。隨機(jī)選取11個(gè)樣本作為漂白后對照組。其余55個(gè)樣本隨機(jī)分為5組(n=11)：去離子水(deionized water，DW)組(陰性對照組)；2%NaF組(陽性對照組)；10%PC組；CPP-ACP組；PC+CPP-ACP組。分別在DW、2%NaF、10%PC、CPP-ACP、10%PC+CPP-ACP溶液中浸泡10 min，自然晾干5 min，去離子水沖洗1 min，3次/d，分別為每天的7:00、12:00和17:00，共1周。其余時(shí)間將樣本置于人工唾液中，人工唾液需要每日更換。

1.2.4 色差儀檢測 牙齒顏色測定采用ZE6000色差儀，光源為D65光源。以CIE-LAB顏色系統(tǒng)記錄牙齒顏色的L、a、b值，然后按照公式ΔE*=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2分別計(jì)算各組漂白后即刻、再礦化后與漂白前釉質(zhì)表面的色差值ΔE1和ΔE2。

1.2.5 原子力顯微鏡分析 每組選取5個(gè)樣本，每個(gè)樣本選取3個(gè)位點(diǎn)，用原子力顯微鏡進(jìn)行檢測，使用數(shù)據(jù)處理軟件NanoScope Analysis分析釉質(zhì)表面形貌及粗糙度。以納米為單位測量平均粗糙度(average roughness，Ra)和均方根粗糙度(root mean square roughness，Rq)兩個(gè)參數(shù)。Ra、Rq從不同方面反映樣本表面的綜合狀態(tài)。

1.2.6 掃描電鏡及能譜分析 每組選取6個(gè)樣本，梯度脫水后放在干燥器內(nèi)干燥，然后在牙釉質(zhì)表面真空沉積一層微米級的鉑金薄膜，在每個(gè)樣本觀察界面上隨機(jī)選取3個(gè)位點(diǎn)，用掃描電鏡觀察表面超微結(jié)構(gòu)，再用能譜儀進(jìn)行元素成分及含量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)值采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較不同組間粗糙度、鈣磷比值及顏色的差異，若總體比較有差異，則采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢驗(yàn)水平定為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 色差儀檢測牙齒顏色改變

各組ΔE>8，漂白效果明顯。各組ΔE值漂白后升高，再礦化處理后略有降低，降低值(ΔE1，ΔE2)為1.34～1.89，各組ΔE1、ΔE2間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 不同再礦化處理各組間ΔE變化

2.2 掃描電鏡觀察表面超微結(jié)構(gòu)

漂白前釉質(zhì)表面形態(tài)(圖1A)：鏡下可見其表面光滑平坦，結(jié)構(gòu)均勻致密，磨痕不明顯。漂白后即刻釉質(zhì)表面形態(tài)(圖1B)：鏡下可見表面因脫礦形成較大凹坑，并有散在孔隙。DW組釉質(zhì)表面形態(tài)(圖1C)：與漂白后即刻相似，可見有大量孔隙，無沉積層。NaF組釉質(zhì)表面形態(tài)(圖1D)：鏡下可見釉質(zhì)表面有排列整齊而致密的晶體沉積。PC組釉質(zhì)表面形態(tài)(圖1E)：鏡下可見排列緊密不均勻的晶體沉積。CPP-ACP組釉質(zhì)表面形態(tài)(圖1F)：鏡下可見大小不一的晶體沉積，有散在孔隙。PC+CPP-ACP組釉質(zhì)表面形態(tài)(圖1G)：鏡下可見排列均勻而致密的晶體沉積。

A：漂白前；B：漂白后即刻；C：DW組；D：NaF組；E：PC組；F：CPP-ACP組；G：PC+CPP-ACP組

2.3 能譜分析

X-射線能譜儀分析元素成分顯示，NaF組主要含有 Ca、P、C、O、F 元素，其余各組主要含有 Ca、P、C、O 元素，而未觀察到F元素沉積(圖2)。

A：漂白前；B：漂白后即刻；C：DW組；D：NaF組；E：PC組；F：CPP-ACP組；G：PC+CPP-ACP組

由表2定量分析元素含量比值可知，漂白后釉質(zhì)表面鈣磷質(zhì)量比、物質(zhì)的量比均顯著降低(P<0.005)，再礦化后NaF、PC、CPP-ACP和PC+CPP-ACP組均有不同程度的升高(P<0.005)，DW組無明顯變化(P>0.005)，兩兩比較顯示從低到高的牙釉質(zhì)表面鈣磷比是：漂白后即刻、DW、CPP-ACP、PC、漂白前、PC+CPP-ACP和NaF組。其中，PC和CPP-ACP組鈣磷比值均低于NaF組(P<0.005)，而PC+CPP-ACP組與NaF組鈣磷比相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.005)。

表2 釉質(zhì)表面鈣磷比值

2.4 原子力顯微鏡檢測結(jié)果

2.4.1 表面形貌 漂白前組(圖3A)釉質(zhì)表面平整，顆粒之間排列致密而有序，三維重建圖黃色部分凸起均勻；漂白后即刻組(圖3B)釉質(zhì)表面粗糙不平，顆粒間隔較大，三維重建圖凸起不均勻，高低起伏差距大，可見明顯的凹陷狀小坑；DW組(圖3C)表面形態(tài)和三維重建圖與漂白后即刻組相似，未見明顯沉積物；NaF組(圖3D)釉質(zhì)表面有球狀沉積物，分布較為均勻，三維重建圖部分區(qū)域可見裂隙，凹陷小而淺；PC組(圖3E)釉質(zhì)表面有較疏松的顆粒狀沉積物，三維重建圖部分區(qū)域可見小而淺的凹陷；CPP-ACP組(圖3F)釉質(zhì)表面較為粗糙，但仍較DW組較為平整，有散在的顆粒狀沉積物，三維重建圖部分區(qū)域可見少量坑狀和尖銳突起結(jié)構(gòu)；PC+CPP-ACP組(圖3G)釉質(zhì)表面較為平整，但仍比漂白前組略粗糙，有均勻、致密的顆粒狀沉積物，三維重建圖黃色部分凸起較為均勻。

A：漂白前；B：漂白后即刻；C：DW組；D：NaF組；E：PC組；F：CPP-ACP組；G：PC+CPP-ACP組

2.4.2 粗糙度 對各組樣本的表面粗糙度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表3)，漂白后Rq、Ra均顯著升高(P<0.001)，經(jīng)不同處理后各組均有不同程度的降低(P<0.001)，兩兩比較顯示從高到低的釉質(zhì)表面粗糙度是漂白后即刻、DW、NaF、CPP-ACP、PC、PC+CPP-ACP和漂白前組。其中，PC+CPP-ACP組粗糙度值最接近漂白前，明顯小于NaF、PC和CPP-ACP組(P<0.001)。

表3 釉質(zhì)表面粗糙度

3 討 論

天然產(chǎn)品用于醫(yī)藥已有數(shù)千年歷史，資源豐富并且安全性較好，在預(yù)防和治療牙齒脫礦中有著廣闊前景。PC作為天然抗氧化劑和自由基清除劑，已被證明在各種臨床應(yīng)用中以及作為膳食補(bǔ)充劑是安全的?，F(xiàn)代藥理研究顯示[17]，PC可以通過誘導(dǎo)膠原交聯(lián)和降低生物降解率增加膠原蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)牙本質(zhì)再礦化。CPP-ACP易溶于唾液，能夠顯著提高唾液中鈣及磷酸根離子水平，有助于再礦化。此外，CPP-ACP分子有親水和疏水區(qū)域，可以掩蓋細(xì)菌表面的疏水蛋白，從而阻止細(xì)菌黏附牙齒表面[18]。

由于牙釉質(zhì)的礦物質(zhì)是基于鈣和磷酸鹽形成的，當(dāng)與這些離子相關(guān)的不飽和溶液接觸時(shí)，可能會發(fā)生羥基磷灰石溶解。反之，當(dāng)與過飽和溶液接觸時(shí)，會發(fā)生礦物沉淀或再礦化。唾液中存在鈣、磷等礦物離子，在一定程度上可修復(fù)脫礦釉質(zhì)，封閉微小孔隙，但這一再礦化進(jìn)程非常緩慢且作用輕微。因此，本實(shí)驗(yàn)去離子水處理后各項(xiàng)指標(biāo)都無明顯變化。

Poorni等[19]發(fā)現(xiàn)牙釉質(zhì)鈣磷比可以反映釉質(zhì)表面鈣磷得失，進(jìn)而判定其再礦化程度。本實(shí)驗(yàn)?zāi)茏V分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaF、PC、CPP-ACP和PC+CPP-ACP組的鈣磷比值均有不同程度的恢復(fù)，這表明它們都能促進(jìn)漂白后的釉質(zhì)再礦化，并且可以發(fā)現(xiàn)與漂白前相比新形成的沉積物的主要元素種類沒有發(fā)生改變，這表明在釉質(zhì)表面有新的晶體生成，具體成分仍需進(jìn)一步探索，推測可能是磷酸鹽、碳酸鹽或有機(jī)酸鈣的其他螯合物等。雖然PC、CPP-ACP對恢復(fù)鈣磷比值的作用不及NaF的效果顯著，但二者聯(lián)合應(yīng)用的效果與其接近。

掃描電鏡和原子力顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，再礦化處理后各組釉質(zhì)表面均有程度不一的礦物質(zhì)沉積，正如預(yù)期那樣，PC與CPP-ACP聯(lián)合應(yīng)用的沉淀物最為致密。推測其原因可能是,CPP-ACP能維持溶液中鈣、磷離子的過飽和狀態(tài)，保證礦化所需的離子滲透梯度[20-21]，PC能清除漂白劑殘留的活性氧，并且其攜帶的大量酚羥基首先與溶液中的鈣離子結(jié)合形成含鈣絡(luò)合物，然后與釉原蛋白中的氨基發(fā)生反應(yīng)，通過這兩個(gè)過程絡(luò)合物中的鈣離子轉(zhuǎn)移到了釉原蛋白中，使得游離的鈣離子聚集到釉原蛋白中[22]，從而增強(qiáng)了釉質(zhì)再礦化。因此，二者聯(lián)用能發(fā)揮更大的再礦化優(yōu)勢，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，漂白后使用PC和CPP-ACP均有良好的再礦化效果，且聯(lián)合應(yīng)用的效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。雖然天然藥物的具體有效成分目前仍不十分明確，但其不良反應(yīng)較小且資源豐富，有進(jìn)一步研發(fā)利用的價(jià)值。

利益沖突：作者聲明沒有競爭利益。