油橄欖葉提取物對Botrytis cinerea抑菌效果與機理研究

田立鵬 萬強貴 王 婷 李春愛 蔡 夢 蒲陸梅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院，甘肅蘭州 730070）

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是核盤菌科孢盤菌屬生物，是灰霉病的致病菌［1］?；移咸焰叻植紡V泛，由其引起的糧食損害成本達數(shù)百億甚至千億美元，是威脅糧食安全的病原體之一［2］。目前，噻苯咪唑、苯基吡咯、苯菌靈和咯菌腈被廣泛應(yīng)用于灰霉病防治［3］，但化學殺菌劑含有有害成分，會導(dǎo)致產(chǎn)品中的副產(chǎn)物和其他活性物質(zhì)積累，對環(huán)境和人體健康產(chǎn)生不良影響［4］，也會增加病原體對殺真菌劑的抗性，因此，尋找可以替代化學殺菌劑的抑菌物質(zhì)具有重要意義。

油橄欖（Olea europaea）屬于木犀科木犀欖屬，原產(chǎn)于地中海，在非洲和亞洲地區(qū)分布廣泛［5］。每年在修剪橄欖樹的過程中會產(chǎn)生大量的橄欖葉副產(chǎn)物。油橄欖葉提取物富含羥基酪醇、橄欖苦苷、木樨草苷、咖啡酸和蘆丁等多種酚類及黃酮類化合物［6］，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒［7］、降壓、抗高血糖、抗動脈粥樣硬化、降膽固醇作用［8］。近年來，關(guān)于天然提取物在抑菌和水果保鮮方面應(yīng)用的研究較多，如孔維寶等［9］研究證明了油橄欖葉提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等8種致病菌具有較強的抑菌活性，且病原菌對提取物的敏感程度存在較大差異；Carla等［10］發(fā)現(xiàn)芳香植物月桂油及其提取物成分具有抗菌特性，富含抗氧化劑和其他活性物質(zhì)；Khalifa等［11］將油橄欖葉及果渣提取物添加到殼聚糖保鮮膜中，有效抑制了擴展青霉和匍枝根霉的生長繁殖，降低了蘋果和草莓的腐爛率。但現(xiàn)有研究主要集中在油橄欖葉提取物或提取物中單一成分的抗氧化性、抗菌性，而對提取物成分組成的分析不足，且有關(guān)油橄欖葉提取物對真菌抑制活性的研究還鮮有報道。

本試驗以灰葡萄孢為對象，基于抑菌濃度、菌落直徑、孢子抑制率等指標測定，研究了油橄欖葉提取物對灰葡萄孢生長的抑制作用，并通過細胞膜通透性、丙二醛含量以及活性氧代謝等方面，進一步探討其抑菌作用的機理，以期為油橄欖葉提取物作為天然植物來源殺菌劑在果蔬采后病害控制中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮油橄欖葉（含水量42.5%），于2020年5月采自甘肅省隴南市祥宇油橄欖開發(fā)有限責任公司生態(tài)產(chǎn)業(yè)園，品種為萊星；灰葡萄孢（B.cinerea），甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院實驗室保存菌種；無水乙醇（分析純），無錫晶科化工有限公司；乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、硫代巴比妥酸、三氯乙酸，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；超氧陰離子、過氧化氫試劑盒，上海源葉科技有限公司；還原型輔酶Ⅱ氧化酶、谷胱甘肽還原酶、抗壞血酸過氧化物酶試劑盒，南京建成生物科技有限公司；過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶試劑盒，上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JC-UT2000型紫外可見分光光度計，北京通用儀器有限公司；MF53-N型倒置熒光顯微鏡，廣州市明美光電技術(shù)有限公司；JY92-IIN超聲波細胞破碎儀，上海葉拓科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取物制備參照王玉等［12］的方法，將新鮮的油橄欖葉自然風干，分別用蒸餾水、50%、70%、90%乙醇溶液按料液比1∶10（g/mL）浸泡1 h。然后在80℃條件下回流1 h，重復(fù)提取2次，合并濾液，減壓蒸餾回收溶劑后，冷凍干燥，得到油橄欖葉提取物（含水量分別為4.09%、3.61%、1.97%、1.26%），存于4℃冰箱備用。

1.3.2 提取物成分分析總多酚含量（以干基計）的測定參照王曉杰等［13］的方法，氣相色譜-質(zhì)譜分析參照高歌等［14］的方法。

1.3.3 最低抑菌濃度的測定參照劉萍等［15］的方法并稍作修改，分別配制濃度為10.00、5.000、2.500、1.250、0.625 0、0.312 5 mg·mL-1的提取物溶液，于滅菌后的96孔板每孔依次加入20μL（1×106CFU·mL-1）菌懸液、90μL液體培養(yǎng)基以及提取物溶液，以無菌水為對照，置于23℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每孔取100 μL涂布于平板，培養(yǎng)12 h，以第一個出現(xiàn)單菌落平板的樣品濃度作為最低抑菌濃度。

1.3.4 病斑菌落直徑的測定經(jīng)油橄欖葉提取物處理，濃度見表1，通過十字交叉法測定灰葡萄孢菌落生長直徑［16］，以蒸餾水處理為空白對照，記為CK。

1.3.5 菌絲干重的測定經(jīng)油橄欖葉提取物處理，濃度見表1，配制1×106CFU·mL-1的菌懸液，以無菌水處理組為對照，取10μL菌懸液加入100 mL液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3 d，抽濾，收集菌絲，在80℃下烘干至恒重，測定菌絲干重。

1.3.6 孢子細胞膜完整性參考Zhang等［17］的方法，經(jīng)油橄欖葉提取物處理，濃度見表1，配制1×106CFU·mL-1的菌懸液，以無菌水處理組為對照，將20μL菌懸液滴至載玻片中央，將碘化丙啶染色液滴于菌懸液中，再放入23℃培養(yǎng)箱中固定15 min后，在蓋玻片一端滴無菌水并用吸水紙放于蓋玻片另一側(cè)將染色液洗凈，在熒光顯微鏡20倍鏡頭下觀察并拍照。

1.3.7B.cinerea電導(dǎo)率變化率的測定采用武淑娟等［18］的方法并稍作修改，經(jīng)油橄欖葉提取物處理，濃度見表1，配制1×106CFU·mL-1的菌懸液，以無菌水處理組為對照，于4℃、8 000 r·min-1條件下離心5 min，取沉淀懸浮于20 mL蒸餾水中，分別于25、98℃環(huán)境下孵育30、15 min測定電導(dǎo)率，分別記為A1、A2。按公式（1）計算電導(dǎo)率變化率：

1.3.8 細胞內(nèi)容物泄漏量的測定參照Paul等［19］的方法并稍作修改，經(jīng)油橄欖葉提取物處理，濃度見表1，配制1×106CFU·mL-1的菌懸液，以無菌水處理組為對照，準確移取8 mL菌懸液，于4℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，分別測定260和280 nm下的吸光度OD280和OD260，蛋白質(zhì)泄漏量以O(shè)D280表示，核酸泄漏量以O(shè)D260表示。

1.3.9 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定參照張蕊［20］的方法，經(jīng)油橄欖葉提取物處理，濃度見表1，配制1×106CFU·mL-1的菌懸液，以無菌水處理組為對照，取10 μL菌懸液加入100 mL液體培養(yǎng)基中，（23±0.5）℃振蕩培養(yǎng)3 d，抽濾，收集菌絲，菌絲中加入預(yù)冷的25 mL 0.1 mol·L-1pH值為7.8的磷酸鉀緩沖溶液，磷酸鉀緩沖溶液由1 mmol·L-1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和2%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）配制而成，使用細胞破碎儀破碎3 min，離心取上清液，加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA），混勻后在沸水浴反應(yīng)30 min，冷卻離心取上清液，分別測定532和600 nm下的吸光度，記作OD532、OD600，并按照公式（2）計算MDA含量：

式中，A為反應(yīng)液體積，mL；V為提取液體積，mL；α為測定提取液的體積，mL；w為材料鮮重，g；消光系數(shù)為155 mmol·L-1·cm-1。

1.3.10 活性氧代謝相關(guān)酶活性的測定NADH氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、抗 壞 血 酸 過 氧 化 物 酶（ascorbate peroxides，APX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性及超氧陰離子（O·-2）、過氧化氫（H2O2）含量均按照試劑盒方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2016統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)，并計算平均值與標準偏差，SPSS 19.0軟件進行相關(guān)性和顯著性分析，用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對油橄欖葉提取物中總多酚的影響

由圖1可知，在一定的乙醇濃度范圍內(nèi)（50%～90%），隨著乙醇體積分數(shù)的增大，溶液中的總多酚含量顯著升高，90%乙醇的提取效率顯著高于其他溶劑（P<0.05）。乙醇/水溶液溶劑系統(tǒng)總多酚提取效率優(yōu)于單一的水相溶劑，主要是因為乙醇/水溶液溶劑系統(tǒng)可以破壞多酚類物質(zhì)與多糖等其他物質(zhì)的結(jié)合鍵，有利于總多酚的提?。?1］。

圖1 不同溶劑提取物中的總多酚含量Fig.1 Total polyphenol content in different solvent extracts

2.2 不同溶劑提取物的氣相色譜-質(zhì)譜分析

甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院蒲陸梅團隊前期研究表明，油橄欖葉提取物中存在的酚類化合物是提取物具有抗氧化活性和抑菌活性的主要原因［22］。固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）分析結(jié)果（圖2）表明，水、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇提取物均鑒定出7種類型的化合物：酚類、烴類、醇類、醛類、酮類、酸類、酯類，其中酚類、烴類、醇類、醛類為主要物質(zhì)，相對含量明顯高于酮類、酸類和酯類。且90%乙醇提取物中酚類物質(zhì)相對含量最高，達到29.34%，水、50%乙醇、70%乙醇提取物中酚類物質(zhì)的相對含量在9.36%～23.87%之間，主要成分為2，6-二叔丁基對甲酚、2，4-二叔丁基苯酚，上述結(jié)果差異是由酚類物質(zhì)的主要成分在乙醇相和水相中溶解度不同所致。

圖2 不同溶劑提取物中主要化合物的相對含量Fig.2 Comparative content of main compounds in different solvent extracts

2.3 提取物的抑菌性能

2.3.1 提取物的最低抑菌濃度以最低抑菌濃度的提取物處理B.cinerea后，結(jié)果表明B.cinerea的生長受到了抑制，如表1所示，70%、90%乙醇提取物相較于其他提取物抑菌效果更好，其中灰葡萄孢對90%乙醇提取物最敏感，其最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值最小，為1.25 mg·mL-1，說明醇提物對灰葡萄孢具有較強的抗菌活性。

表1 不同溶劑提取物對B.cinerea的最低抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentration of different solvent extracts against B.cinerea /（mg·mL-1）

2.3.2 提取物對B.cinerea菌落直徑的影響由圖3可知，提取物（濃度均為對應(yīng)的最低抑菌濃度）處理B.cinerea后，與對照相比，處理組灰葡萄孢菌落直徑降低（P<0.05），且菌落直徑隨著提取溶劑乙醇體積分數(shù)的增大而減小，其中70%乙醇、90%乙醇提取物抑菌效果較佳。

圖3 不同溶劑提取物對B.cinerea菌落直徑的影響Fig.3 Effect of different solvent extracts on colony diameter of B.cinerea

2.3.3 提取物對B.cinerea菌絲干重的影響由圖4可知，不同溶劑提取物處理B.cinerea后，菌絲干重隨著提取溶劑乙醇體積分數(shù)的增大而減小，且70%乙醇、90%乙醇提取物處理后的菌絲干重顯著降低（P<0.05），分別為對照的18.83%和8.91%，表明不同溶劑提取物處理后，能夠有效抑制B.cinerea生物量的積累。

圖4 不同溶劑提取物對菌絲干重的影響Fig.4 Effects of different solvent extracts on dry weight of mycelium

2.4 提取物對B.cinerea細胞膜完整性的影響

碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，能夠用來驗證細胞膜是否受損，其熒光強度越強，表明細胞的破損越嚴重，若能在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光，說明細胞質(zhì)膜不完整［23］。由圖5可知，隨著提取溶劑乙醇體積分數(shù)的增大，處理組中被PI染色的孢子數(shù)逐漸增多，且90%乙醇提取物處理后染色的孢子數(shù)顯著高于其他處理組（P<0.05）。處理組可觀察到明顯熒光，而對照組幾乎無光。由此說明提取物處理破壞了B.cinerea細胞膜的完整性。

圖5 不同溶劑提取物處理對B.cinerea細胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of different solvent extracts on cell membrane integrity of B.cinerea

2.5 提取物對B.cinerea細胞膜通透性的影響

2.5.1 提取物對B.cinerea電導(dǎo)率變化率的影響由圖6可知，不同溶劑提取物處理B.cinerea后，處理組的電導(dǎo)率變化率均顯著高于對照組，且90%乙醇提取物處理后的電導(dǎo)率變化率最大，達到對照的3倍，表明不同溶劑提取物處理可提高B.cinerea細胞膜的電導(dǎo)率，破壞細胞膜的選擇通透性，導(dǎo)致內(nèi)容物外滲，由此說明細胞膜是提取物的作用靶點之一［24］。

圖6 不同溶劑提取物對B.cinerea電導(dǎo)率變化率的影響Fig.6 Effect of different solvent extracts on the change rate of electrical conductivity in B.cinerea

2.5.2 提取物對B.cinerea內(nèi)容物泄露的影響在菌體細胞遭受外界脅迫時，蛋白質(zhì)和核酸泄漏量的增加是細胞膜受損的表現(xiàn)之一。不同溶劑提取物處理后，與對照相比，蛋白質(zhì)（圖7-A）和核酸泄漏量（圖7-B）均有升高，且隨提取溶劑乙醇體積分數(shù)的增大而增加，其中90%乙醇提取物處理后蛋白質(zhì)和核酸泄漏量分別為對照的1.63倍和1.94倍（P<0.05）。上述結(jié)果表明，不同溶劑提取物處理導(dǎo)致B.cinerea孢子的細胞膜受損，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生泄露。

圖7 不同溶劑提取物對B.cinerea蛋白質(zhì)、核酸泄漏量的影響Fig.7 Effects of different solvent extracts on protein and nucleic acid leakage in B.cinerea

2.5.3 提取物對B.cinereaMDA含量的影響丙二醛含量是反映機體抗氧化潛在能力的參數(shù)，可表征組織過氧化的損傷程度［25］。由圖8可知，不同溶劑提取物處理后，MDA含量隨著提取溶劑乙醇體積分數(shù)的增大而增加，其中70%乙醇、90%乙醇提取物處理后的MDA含量較CK組顯著升高，說明細胞膜的脂質(zhì)氧化嚴重。上述結(jié)果表明，70%乙醇、90%乙醇提取物處理能夠顯著引起細胞膜脂質(zhì)過氧化，且提取溶劑乙醇體積分數(shù)越大，MDA含量越高，從而導(dǎo)致B.cinerea細胞膜損傷越嚴重。

圖8 不同溶劑提取物對B.cinerea MDA含量的影響Fig.8 Effects of different solvent extracts on MDA content in B.cinerea

2.6 提取物對B.cinerea活性氧代謝的影響

2.6.1 提取物對B.cinerea活性氧代謝相關(guān)酶活性的影響活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝過程中的相關(guān)酶活性是衡量活性氧產(chǎn)生或清除的重要指標。由圖9可知，經(jīng)提取物處理后，處理組B.cinerea的NOX、CAT、POD活性顯著高于對照組，且隨著提取溶劑乙醇體積分數(shù)的增大呈現(xiàn)升高的趨勢，其中90%乙醇提取物處理后酶活較CK組的變化率最大，NOX、CAT、POD活性分別為對照組的1.8、7、8倍。SOD、GR、APX活性在經(jīng)過提取物處理后呈現(xiàn)降低的趨勢。

圖9 不同溶劑提取物對B.cinerea ROS代謝相關(guān)酶活性的影響Fig.9 Effect of solvent extract on the activity of ROS metabolism related enzymes in B.cinerea

2.6.2 提取物對B.cinerea活性氧代謝的影響ROS是細胞內(nèi)具有化學反應(yīng)活性的氧代謝產(chǎn)物，主要以氧化過程形成的超氧陰離子形式存在。由圖10-A可知，油橄欖葉提取物處理B.cinerea后，O·-2含量隨著提取溶劑乙醇體積分數(shù)的增大呈現(xiàn)升高的趨勢，90%乙醇提取物處理最高，達到了對照組的11倍，且處理組的O·-2含量顯著高于對照組（P<0.05），說明油橄欖葉提取物處理促進了胞內(nèi)ROS的積累。

由圖10-B可知，油橄欖葉提取物處理B.cinerea后，處理組的H2O2含量顯著高于對照組，表明提取物處理增強了B.cinerea的胞內(nèi)抗氧化能力。

圖10 不同溶劑提取物對B.cinerea O·-2、H2O2含量的影響Fig.10 Effects of different solvent extracts on O·-2 and H2O2contents of B.cinerea

3 討論

油橄欖葉提取物富含酚類物質(zhì)，能夠有效抑制病原菌的生長［6］，本研究結(jié)果表明，總多酚含量較高的提取物對B.cinerea菌體具有更佳的抑菌效果。經(jīng)油橄欖葉提取物處理能夠抑制B.cinerea菌落直徑的擴大，降低菌絲生物量的積累，這與Khalifa等［11］的研究結(jié)論一致。

細胞膜對生物體的生長與繁殖起著重要的作用，MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，可以反映組織過氧化損傷程度［25］。本試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)油橄欖葉提取物處理后，B.cinerea的細胞膜受損，且處理組的電導(dǎo)率變化率、內(nèi)容物泄露量及MDA含量均升高，說明油橄欖葉提取物處理能夠加速膜脂質(zhì)過氧化發(fā)生，造成細胞膜結(jié)構(gòu)的降解和損傷，該結(jié)果與武淑娟等［18］對粉紅單端孢細胞膜結(jié)構(gòu)的研究結(jié)論一致。

Ge等［26］研究發(fā)現(xiàn)，NOX、CAT、SOD、POD是抗氧化系統(tǒng)中主要的抗氧化酶。SOD可以通過歧化反應(yīng)將超氧陰離子自由基歧化為H2O2和O2［27-28］。有研究表明，可以通過提高NOX、CAT、POD的活性來促進H2O2和O·-2的產(chǎn)生，從而抑制粉紅單端孢［18］、硫色鐮刀菌［20］等的生長。抗氧化酶有助于減少應(yīng)激條件下ROS的產(chǎn)生和過量積累［29］。Hasanuzzaman等［30］研究發(fā)現(xiàn)，APX、脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）、GR等酶相互協(xié)作，有助于減少ROS的積累、降低H2O2含量并維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)油橄欖葉提取物處理后，與對照組相比，NOX、CAT、POD活性均呈現(xiàn)上升的趨勢，但SOD、GR、APX的活性顯著降低，O·-2和H2O2含量在以上酶的相互協(xié)調(diào)作用下處于較高水平，致使細胞內(nèi)部活性氧積累增加，破壞了機體的活性氧代謝平衡，進而加劇了菌體的死亡凋零，抑制了菌體的生長。但本研究僅在體外試驗探究了油橄欖葉提取物對B.cinerea菌體生長及細胞膜的影響，因此，后續(xù)還需對油橄欖葉提取物對B.cinerea的作用機制在果實體內(nèi)進行進一步的驗證。

4 結(jié)論

B.cinerea菌體對油橄欖葉90%乙醇提取物有較強的敏感性，90%乙醇提取物（1.25 mg·mL-1）處理破壞了B.cinerea菌體細胞膜的完整性，提高了電導(dǎo)率變化率，增加了細胞內(nèi)容物泄露量，并促進了MDA含量的積累，從而加劇了細胞膜的損傷程度，誘導(dǎo)機體內(nèi)ROS相關(guān)酶活性的變化，破壞了活性氧代謝平衡，使菌體的生長受到抑制。本試驗揭示了油橄欖葉提取物對B.cinerea的抑制作用及機理，為油橄欖葉提取物作為天然植物來源殺菌劑提供了理論依據(jù)。