穩(wěn)定同位素稀釋-增強(qiáng)脂質(zhì)去除凈化-聯(lián)用 氣質(zhì)法快速測定水產(chǎn)品中的多環(huán)芳烴

何雯倩，韋 譽(yù)，馬承鴻，葉日金

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442； 3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442）

多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs） 是煤、石油、木材、煙草和有機(jī)高分子化合物等有機(jī)物不完全燃燒時產(chǎn)生的揮發(fā)性碳?xì)浠衔?，是重要的環(huán)境和食品污染物[1-3]。由于多環(huán)芳烴的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在環(huán)境中降解速度較慢[4-5]，因此容易富集并通過食物鏈進(jìn)入食品生產(chǎn)原料當(dāng)中[6-7]。菲在多環(huán)芳烴中，由于三個環(huán)的中心不在同一直線上，因此對稱性沒有萘或蒽等化合物強(qiáng)，芳香性也更弱，同時由于其毒性較大，2017年被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為3類致癌物。報(bào)道稱，多環(huán)芳烴具有很強(qiáng)的致癌、致畸、致突變等毒副作用[8-10]，對組織器官有嚴(yán)重的損害和影響。因此，對食品原料或終端產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題進(jìn)行有效監(jiān)管具有重要的意義，而開發(fā)快速高效的分析方法是進(jìn)行市場監(jiān)管的有效手段。

目前，多環(huán)芳烴的檢測方法主要有熒光法、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-16]和高效液相色譜-熒光/紫外檢測法[17-18]等。熒光法雖然選擇性強(qiáng)， 但對同類化合物定性還需要出峰時間確證，尤其對于同分異構(gòu)體，難以區(qū)分定性定量。高效液相色譜對多種化合物的分離時間長、分離難度大、方法定性需要核對每個化合物的出峰時間，步驟煩瑣，且無法使用內(nèi)標(biāo)物對結(jié)果進(jìn)行校正。質(zhì)譜法具有高通量、分析時間短、定性定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)，因此被檢測實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。本文使用增強(qiáng)脂質(zhì)去除凈化管（Enhanced Matrix Removal，EMR）對提取液進(jìn)行凈化，同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量校正，建立了快速測定水產(chǎn)品中多環(huán)芳烴菲的分析方法。該方法定量準(zhǔn)確、回收率高、重現(xiàn)性好，為水產(chǎn)品中的多環(huán)芳烴檢測研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

7890B-5975C安捷倫氣相色譜-質(zhì)譜儀，配有電子轟擊離子源（Electron impact ion source, EI）；KQ-800DB超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；Promax 2020搖床，德國海道夫公司；3-18k高速離心機(jī)，德國西格瑪公司；Heidolph Multi Reax渦旋振蕩器，德國海道夫公司；Hei-VAP Core ML/G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國海道夫公司；MilliQ超純水機(jī)，德國默克密理博公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙酸乙酯、乙腈，色譜純，美國賽默飛世爾公司；無水硫酸鎂，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；C18、PSA固相萃取劑，分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；商品化增強(qiáng)脂質(zhì)去除凈化管（Enhanced Matrix Removal，EMR），分析純，安捷倫科技有限公司；多環(huán)芳烴菲和菲-d10標(biāo)準(zhǔn)溶液，100 mg·L-1，天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

①外標(biāo)溶液。取1 mL菲標(biāo)準(zhǔn)溶液，正己烷溶解并定容至100 mL容量瓶，配制成1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。②內(nèi)標(biāo)儲備溶液。取1 mL菲-d10標(biāo)準(zhǔn)溶液，正己烷溶解并定容至100 mL容量瓶，配制成1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。③標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取上述菲標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液使用正己烷配制5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1和200.0 μg·L-1的校準(zhǔn)曲線（各點(diǎn)含內(nèi)標(biāo)濃度為20.0 μg·L-1）。

1.3 前處理方法

①取樣。取約200 g水產(chǎn)品可食用部分均質(zhì)， -18 ℃冷凍保存。②提取。稱取5 g均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中，加入20 μL濃度為1 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液，加入15 mL乙腈，超聲提取15 min，以 8000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至梨形瓶中。重復(fù)提取1次，合并提取液于梨形瓶中。40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2～3 mL，待凈化。③凈化。EMR管用 2 mL水活化，將待凈化液轉(zhuǎn)移至管中，梨形瓶使用2 mL乙腈洗滌一次，并將洗滌液轉(zhuǎn)移至凈化管中，渦旋振蕩2 min，以4000 r·min-1離心5 min。凈化液用2 g無水硫酸鎂于15 mL離心管中除水后， 4000 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，40 ℃氮吹至近干，用1 mL正己烷復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)相濾膜后，供氣相色譜-質(zhì)譜儀測定。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

安捷倫DB-5ms石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：80 ℃保持1 min，10 ℃·min-1升溫至180 ℃保持1 min，20 ℃·min-1升溫至280 ℃保持7 min；載氣流速：1.3 mL·min-1；分流進(jìn)樣：分流比2∶1；接口溫度：300 ℃；進(jìn)樣口溫度：290 ℃；溶劑延遲：8 min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源；電子能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：8 min；選擇離子采集模式（SIM）；定量離子：m/z178，定性離子：m/z176、m/z152；內(nèi)標(biāo)定量離子：m/z188。菲和菲-d10內(nèi)標(biāo)的定量離子流色譜圖見圖1。

圖1 菲和菲-d10內(nèi)標(biāo)定量離子流圖

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)以均質(zhì)好的陰性九節(jié)蝦樣品作為試樣，標(biāo)準(zhǔn)溶液添加梯度為10 μg·kg-1，分別考察了甲醇、乙腈和乙酸乙酯的提取效率。結(jié)果顯示，乙酸乙酯回收率較低，可能是因?yàn)橐宜嵋阴O性較低，容易提取到脂溶性的雜質(zhì)，對結(jié)果造成影響；甲醇和乙腈的回收率較好，但相對于甲醇，乙腈的回收率更突出，可能是由于菲的疏水性較強(qiáng)，更易溶于乙腈。實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈作為提取液，回收率結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同提取溶劑的回收率結(jié)果

2.2 提取方式的選擇

實(shí)驗(yàn)同時對比搖床，超聲和渦旋等3種提取方式。以陰性九節(jié)蝦樣品作為試樣，標(biāo)準(zhǔn)溶液添加梯度為10 μg·kg-1，使用乙腈進(jìn)行提取。結(jié)果表明，搖床提取效率最低，回收率只有75.8%；其次是渦旋振蕩的回收率為79.5%；回收率最好的是超聲方式，回收率達(dá)到84.3%。其主要原因可能是因?yàn)槠胀ǖ恼駬u模式，樣品難以與提取溶劑充分接觸，所以回收率較低，而超聲通過高頻率的振動，可使樣品充分提取，因此最終選擇超聲方式進(jìn)行提取，結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取方式的回收率結(jié)果

2.3 提取次數(shù)的確定

由于菲的脂溶性較強(qiáng)，而水產(chǎn)品中含有較多的脂肪，提取次數(shù)過少，可能造成提取不完全，影響回收率；若提取次數(shù)過多，則溶劑消耗量大，后續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理耗時長，同時可能導(dǎo)致提取到樣品中過多的油脂等低極性雜質(zhì)，增大基質(zhì)效應(yīng)而影響回收率。實(shí)驗(yàn)分別對加標(biāo)樣品進(jìn)行1次、2次和3次提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取1次時，提取并不充分，回收率只有53.7%，而提取2次和3次的回收率則分別達(dá)到84.1%和84.5%。綜合考慮，提取3次相比提取2次，回收率只提升0.4個百分點(diǎn)，而時間和試劑消耗卻高出1.5倍，因此最終選擇重復(fù)提取2次。

2.4 凈化劑類型的選擇

為了保護(hù)設(shè)備和降低基質(zhì)效應(yīng)，需要對提取液進(jìn)行凈化。水產(chǎn)品中的雜質(zhì)多以蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪以及一些血液和組織中的神經(jīng)遞質(zhì)和其他內(nèi)源物質(zhì)為主。實(shí)驗(yàn)對比了EMR增強(qiáng)脂質(zhì)去除凈化管和固相含量同樣為400 mg的C18和PSA，以陰性九節(jié)蝦樣品作為試樣考察其回收率，標(biāo)準(zhǔn)溶液添加梯度為10 μg·kg-1。由圖4可知，EMR增強(qiáng)脂質(zhì)去除凈化管的回收率最高，而C18和PSA的回收率相當(dāng)。根據(jù)固相基團(tuán)進(jìn)行分析，可能是因?yàn)镋MR可針對脂質(zhì)進(jìn)行吸附，較大程度上降低了干擾。C18和PSA雖然一定程度上也能對氨基酸和脂質(zhì)等雜質(zhì)進(jìn)行吸附，但其選擇性較低，導(dǎo)致回收率偏低。實(shí)驗(yàn)最終選用EMR增強(qiáng)脂質(zhì)去除凈化管凈化。

圖4 不同凈化劑類型的回收率結(jié)果

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的討論

基質(zhì)效應(yīng)分為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)減弱效應(yīng)兩種類型，即基質(zhì)對目標(biāo)物質(zhì)的檢測信號有增強(qiáng)或抑制的作用，從而影響目標(biāo)物質(zhì)的最終定量結(jié)果。基質(zhì)效應(yīng)可根據(jù)公式（基質(zhì)曲線斜率/溶劑曲線斜率-1）×100進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)以陰性九節(jié)蝦樣品作為空白基質(zhì)，用其基質(zhì)提取液和正己烷分別配制菲的外標(biāo)物曲線，測定后經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)效應(yīng)為40，（絕對值小于20為弱基質(zhì)效應(yīng)，在20～50為中等基質(zhì)效應(yīng)，超出50為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)），說明基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重。內(nèi)標(biāo)法是抵消基質(zhì)效應(yīng)最有效的方法之一，因此實(shí)驗(yàn)最終使用菲的同位素內(nèi)標(biāo)菲d-10對結(jié)果進(jìn)行 校正。

2.6 線性方程及靈敏度

由于前處理凈化后，基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的影響仍然明顯，因此使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，配制濃度為5.0～200.0 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中內(nèi)標(biāo)濃度為20.0 μg·L-1，在實(shí)際的測定過程中，可根據(jù)樣品的實(shí)際含量進(jìn)行稀釋或者濃縮，使測定值在曲線范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)所測得的方程及相關(guān)系數(shù)見表1，同時以低濃度加標(biāo)測定方法檢出限和方法定量限，由表1可知，相關(guān)系數(shù)為0.9996，說明線性關(guān)系良好，曲線定量準(zhǔn)確，檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1，方法整體靈敏度較高，達(dá)到測定要求。

2.7 精密度、回收率及重復(fù)性

選擇陰性九節(jié)蝦樣品和草魚樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，以驗(yàn)證方法的回收率和穩(wěn)定性，對樣品進(jìn)行1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1水平的加標(biāo)，平行測定6次樣品，結(jié)果如表2所示，九節(jié)蝦和草魚所測得回收率差異不大，回收率為78.7%～85.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.52%～3.36%。表明該方法的回收率較高，且偏差小，詳見表2。

2.8 方法實(shí)際測定應(yīng)用

選擇市場或者超市售賣的水產(chǎn)樣品進(jìn)行測定，最終檢測了10個魚樣品，均未檢出；10個蝦樣 品，1個檢出3.55 μg·kg-1；10個螃蟹樣品，1個檢出 9.92 μg·kg-1。說明目前市面上的水產(chǎn)品受到了一定的污染，存在影響消費(fèi)者健康安全的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)管力度，建立有效的管理手段。

表1 菲的線性方程和相關(guān)系數(shù)

表2 回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本文以菲作為探針化合物，建立了EMR增強(qiáng)脂質(zhì)去除凈化管結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中多環(huán)芳烴殘留量的分析方法。樣品使用乙腈進(jìn)行提取，經(jīng)凈化后，基質(zhì)效應(yīng)降低，且回收率較高，同時使用內(nèi)標(biāo)物校正結(jié)果，準(zhǔn)確度好；目標(biāo)物在短時間內(nèi)完成出峰，峰形對稱，柱效高；該方法檢出限低，靈敏度高，回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差符合一般測定要求，對于不同樣品，回收率均達(dá)到分析條件，可對水產(chǎn)品中多環(huán)芳烴的分析方法開發(fā)提供技術(shù)支持。