徐長卿中的天然產(chǎn)物XCQ-9對Jurkat細胞增殖和凋亡的影響及機制研究 Δ

韋學耐 ，楊坤 ，劉琴 ，趙鵬 ，晏英 ，李艷梅 （1.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 55005；.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴陽 550014；.貴州醫(yī)科大學醫(yī)藥衛(wèi)生管理學院，貴陽 55005）

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是以未成熟T或B淋巴細胞異常增生為特征的惡性克隆性疾病，根據(jù)免疫表型一般分為T細胞型和B細胞型[1]。ALL多發(fā)病于2～5歲，是兒童最常見和發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2—4]。其中，急性T淋巴細胞白血?。═-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一種侵襲性疾病，在兒童ALL病例中占10%～15%[5]。目前臨床上治療T-ALL的化療藥物有長春新堿、柔紅霉素、可的松和依托泊苷等，但上述藥物具有高毒性和耐藥性，這在一定程度上限制了其臨床應用[6—7]。且有研究表明，這些化療藥物的耐藥性已成為T-ALL患兒復發(fā)的主要原因，嚴重影響患兒的預后[8]。因此，開發(fā)新型抗T-ALL的藥物是臨床迫切需要的。

徐長卿Cynanchum paniculatum（Bge.） Kitag.為蘿摩科鵝絨藤屬多年生草本植物，以干燥根和根莖入藥。其味辛，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風化濕、止痛止癢的功能，用于治療風濕、牙痛、跌打傷痛、風疹、濕疹等病癥[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，徐長卿具有抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等藥理作用[10]。徐長卿中已報道的化學成分有168種，其中C21甾體類成分有47種[11]。本課題組前期對從徐長卿中提取分離得到的C21甾體化合物進行了抗癌活性篩選，發(fā)現(xiàn)化合物XCQ-9具有抗人急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞的作用，其結(jié)構(gòu)式見圖1。本研究擬通過體外實驗初步探索XCQ-9對Jurkat細胞增殖和凋亡的影響，并從經(jīng)典的胱天蛋白酶（Caspase）途徑和細胞周期兩個方面來考察其可能的作用機制，以期為將XCQ-9開發(fā)為治療T-ALL的藥物提供實驗基礎。

圖1 XCQ-9的化學結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有A2型生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Microfuge型臺式高速冷凍離心機（美國Backman公司）、Axi Vert AL型倒置光學顯微鏡（德國Zeiss公司）、Synergy2型多功能酶標儀（美國Gene公司）、PowerPacTMBasic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）、ACEA NovoCyte型流式細胞儀[艾森生物（杭州）有限公司]、Odyssey&CLX型雙色紅外成像系統(tǒng)（美國LI-COR Odyssey公司）。

1.2 主要藥品與試劑

XCQ-9為本課題組提取制備，分子式為C21H30O2，純度≥98%[12]；胎牛血清購自美國HyClone公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測試劑盒（批號0315976）購自美國BD公司；二甲基亞砜、MTT和二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號分別為401P031、810K052、20211213）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號62u0922）購自美國Affinity公司；兔源細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）、細胞周期蛋白 B1（Cyclin B1）抗體（批號分別為 ab133327、ab32072）均購自美國Abcam公司；兔源Caspase-9、活化的 Caspase-9（Cleaved Caspase-9）、Caspase-3、活化的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly ADP-ribose poly-merase，PARP）抗 體和 Dy-LightTM800標記的抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 細胞株

人急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞株購買于美國ATCC細胞庫，現(xiàn)于本實驗室保存。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將Jurkat細胞接種于含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，將細胞置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 XCQ-9對細胞增殖的影響

采用MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期的Jurkat細胞，按1×105個/孔接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞穩(wěn)定后，將其分為空白對照組（0 μmol/L）和不同濃度（2.5、5、10、20、40 μmol/L，藥物濃度根據(jù)前期預實驗結(jié)果設置）的XCQ-9組，每組平行設置5個復孔。分別干預24、48、72 h后，加入10 μL含5 mg/mL的MTT試劑常規(guī)孵育4 h，然后再加入三聯(lián)液（500 mL三聯(lián)液中含十二烷基硫酸鈉50 g、異丁醇25 mL和濃鹽酸0.5 mL）100 μL，孵育過夜。使用酶標儀測定各孔在570 nm波長處的吸光度（A），計算細胞存活率[細胞存活率（%）＝（給藥組A/空白對照組A）×100%]。實驗重復3次。

2.3 XCQ-9對細胞周期的影響

采用流式細胞術(shù)進行檢測。取對數(shù)生長期細胞，按4×105個/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細胞穩(wěn)定后，將其分為空白對照組（0 μmol/L）和不同濃度（2.5、5、10 μmol/L，濃度根據(jù)“2.2”項下MTT實驗結(jié)果設置）的XCQ-9組，每組平行設置5個復孔，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。干預24、48 h后，以1 000 r/min離心4 min，收集細胞。用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，然后加入500 μL預冷的70%乙醇固定過夜，再次以1 000 r/min離心4 min去除乙醇，并用預冷的PBS洗滌細胞；加入含0.1 mg/mL RNase、50 μg/mL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）和0.05%Triton-100的PBS，混勻，室溫避光染色30 min，上樣流式細胞儀測定各組細胞的細胞周期占比。實驗重復3次。

2.4 XCQ-9對細胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期細胞，按“2.3”項下方法接種、分組、給藥、培養(yǎng)并收集細胞。用50 μL 1×Binding buffer混勻，并加入Annexin V-FITC和PI各2.5 μL，避光染色15 min，上樣流式細胞儀檢測和分析。實驗重復3次。

2.5 XCQ-9對細胞中凋亡和周期相關(guān)蛋白表達的影響

采用Western blot法進行檢測。取對數(shù)生長期細胞，按12×105個/皿接種于60 mm培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞穩(wěn)定后，將其分為空白對照組（0 μmol/L）和不同濃度（2.5、5、10 μmol/L，濃度設置依據(jù)同“2.3”項下）的XCQ-9組。干預24 h后收集細胞，用預冷的PBS清洗3次，加入80～150 μL含有1%苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心15 min，去沉淀得到細胞蛋白溶液。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，并將5×loading buffer和細胞蛋白溶液按1∶4的體積比混勻，95 ℃變性5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ?0%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中，每孔加入50 μg蛋白，待蛋白分離完全后（電泳條件為電壓100 V、時間2 h），轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)膜條件為電流220 mA、時間2 h）到0.2 μm的聚偏二氟乙烯膜上，以3%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；加入相應的一抗（GAPDH、Cyclin B1、CDK1的稀釋比例均為1∶5 000，Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、PARP 的稀釋比例均為 1∶1 000），4 ℃孵育過夜；Tris緩沖鹽溶液（TBS）洗3次、每次5 min，加入DyLightTM800標記的二抗（稀釋比例均為1∶30 000），避光室溫孵育1.5 h；TBS洗3次、每次5 min，用雙色紅外成像系統(tǒng)檢測和分析。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 9.0軟件作圖。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 XCQ-9對Jurkat細胞增殖的影響

與空白對照組比較，作用24、48、72 h后，XCQ-9不同濃度組細胞的存活率均顯著降低（P＜0.01），并呈時間和濃度依賴性趨勢。結(jié)果見表1。

表1 XCQ-9干預不同時間后各組細胞的存活率測定結(jié)果（±s，n＝5，%%）

表1 XCQ-9干預不同時間后各組細胞的存活率測定結(jié)果（±s，n＝5，%%）

a：與空白對照組比較，P＜0.01

組別空白對照組XCQ-9 2.5 μmol/L組XCQ-9 5 μmol/L組XCQ-9 10 μmol/L組XCQ-9 20 μmol/L組XCQ-9 40 μmol/L組72 h 100 72.58±2.40a 50.62±1.59a 34.48±0.56a 27.62±1.26a 22.99±0.14a 24 h 100 82.59±1.45a 74.08±0.73a 61.04±2.41a 60.81±1.51a 61.20±1.55a 48 h 100 77.84±1.45a 59.14±2.07a 44.26±1.59a 38.19±1.34a 33.87±0.94a

3.2 XCQ-9對Jurkat細胞凋亡的影響

與空白對照組比較，作用24、48 h后，XCQ-9 5、10 μmol/L組細胞的凋亡率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且呈濃度和時間依賴性趨勢。結(jié)果見圖2、表2。

表2 XCQ-9干預24、48 h后各組細胞的凋亡率測定結(jié)果（±s，n＝3，%%）

表2 XCQ-9干預24、48 h后各組細胞的凋亡率測定結(jié)果（±s，n＝3，%%）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與空白對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組XCQ-9 2.5 μmol/L組XCQ-9 5 μmol/L組XCQ-9 10 μmol/L組24 h 6.93±0.88 5.53±0.31 10.19±0.57a 25.64±0.93a 48 h 5.92±1.52 4.48±1.07 12.79±2.99b 34.64±6.25a

圖2 XCQ-9干預24、48 h后各組細胞凋亡檢測的流式細胞圖

3.3 XCQ-9對Jurkat細胞周期的影響

與空白對照組比較，XCQ-9 10 μmol/L組干預24 h后及XCQ-9 5、10 μmol/L組干預48 h后，細胞中處于G2期的比例均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見表3、圖3。

圖3 XCQ-9作用24、48 h后各組細胞周期檢測的流式細胞圖

表3 XCQ-9干預24、48 h后各組細胞的細胞周期占比測定結(jié)果（±s，n＝3，%%）

表3 XCQ-9干預24、48 h后各組細胞的細胞周期占比測定結(jié)果（±s，n＝3，%%）

a：與空白對照組比較，P＜0.01

組別24 h 48 h G1期40.71±4.30 39.81±3.02 35.49±3.02 23.87±2.42 G2期17.19±1.13 21.55±2.72 38.70±3.30a 45.31±1.82a S期38.87±2.18 39.20±1.75 29.63±6.37 25.89±1.94 S期38.14±1.98 40.12±2.45 36.44±9.78 24.21±1.61 G2期19.87±6.57 18.87±4.24 32.96±0.69 47.63±3.83a G1期42.63±2.05 37.59±3.16 30.00±3.11 18.07±15.32空白對照組XCQ-9 2.5 μmol/L組XCQ-9 5 μmol/L組XCQ-9 10 μmol/L組

3.4 XCQ-9對細胞中凋亡和周期蛋白表達的影響結(jié)果

與空白對照組比較，XCQ-9 10 μmol/L組細胞中CDK1和Caspase-9蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.01），XCQ-9 2.5、5、10 μmol/L組細胞中Cyclin B1、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白表達均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），5、10 μmol/L組細胞中Cleaved Caspase-9蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果見圖4、表4。

表4 各組細胞中凋亡和周期相關(guān)蛋白表達水平的測定結(jié)果（±s，n＝3）

表4 各組細胞中凋亡和周期相關(guān)蛋白表達水平的測定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與空白對照組比較，P＜0.05

組別Cyclin B1/GAPDH CDK1/GAPDH Caspase-9/GAPDH Caspase-3/GAPDH PARP/GAPDH空白對照組XCQ-9 2.5 μmol/L組XCQ-9 5 μmol/L組XCQ-9 10 μmol/L組0.52±0.08 0.79±0.12a 1.04±0.16b 0.98±0.16a 0.46±0.06 0.41±0.04 0.46±0.04 0.16±0.01b 1.26±0.03 1.24±0.08 1.11±0.09 0.76±0.06b Cleaved Caspase-9/GAPDH 0.04±0.00 0.04±0.01 0.23±0.01b 1.03±0.02b 1.28±0.07 1.25±0.04 1.29±0.04 1.31±0.09 Cleaved Caspase-3/GAPDH 0.41±0.03 0.70±0.01b 1.29±0.06b 1.80±0.06b 2.30±0.13 2.22±0.13 2.03±0.09 2.09±0.14 Cleaved PARP/GAPDH 0.51±0.01 0.72±0.06b 0.71±0.04b 0.92±0.01b

圖4 各組細胞中凋亡和周期相關(guān)蛋白表達的電泳圖

4 討論

腫瘤的發(fā)生是由于受到遺傳因素、環(huán)境因素和基因突變等的綜合影響，使得細胞增殖與死亡之間的穩(wěn)態(tài)被破壞，從而導致腫瘤細胞不可控制地生長，因此在研究抗腫瘤藥物時，通常將凋亡和周期阻滯作為抗腫瘤效果評價的兩大指標[13—14]。本研究發(fā)現(xiàn)，XCQ-9可以抑制Jurkat細胞的增殖，同時促進Jurkat細胞的凋亡，并誘導Jurkat細胞發(fā)生G2期阻滯。這提示，XCQ-9具有一定的抗白血病活性。

凋亡是由Caspase介導的一種非炎癥形式的程序性細胞死亡[15]。其中，Caspase-9活化后（即Cleaved Caspase-9）可以啟動Caspase級聯(lián)反應，使凋亡執(zhí)行者Caspase-3活化（即Cleaved Caspase-3）[16]。與Caspase家族的其他成員相比，Caspase-3處于Caspase級聯(lián)的末端，其激活是啟動凋亡程序的必經(jīng)之路，可以水解底物PARP（Cleaved PARP是Cleaved Caspase-3水解的產(chǎn)物，是凋亡的標志），從而抑制DNA修復，使細胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示，XCQ-9可上調(diào)Jurkat細胞中Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白的表達，這可能是誘導其發(fā)生凋亡的重要原因。

細胞周期是由檢查點、細胞周期蛋白依賴性激酶和細胞周期蛋白共同調(diào)節(jié)的、高度保守的、嚴格控制的過程[18]。CDK1是細胞周期進程的核心，其失調(diào)可導致腫瘤侵襲性發(fā)展、染色體不穩(wěn)定和細胞增殖加強[19]。Cyclin B1在細胞生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，在細胞分裂中期達到高峰，在分裂后期下降，被認為是G2期阻滯的標志[20]。本研究結(jié)果顯示，XCQ-9可下調(diào)Jurkat細胞中CDK1的表達，上調(diào)Cyclin B1的表達，進一步驗證XCQ-9是通過阻滯G2期來發(fā)揮作用的。

綜上，XCQ-9可通過Caspase途徑來促進細胞凋亡，主要通過上調(diào)Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白促進細胞凋亡，下調(diào)CDK1和上調(diào)Cyclin B1蛋白使細胞發(fā)生G2期阻滯來抑制細胞增殖，這提示XCQ-9可能是一種具有潛力的抗T-ALL的新型候選藥物。但本研究僅在體外研究了該藥的抗白血病活性，尚未在體內(nèi)驗證其活性，之后將進一步進行體內(nèi)實驗驗證，從而為其應用于臨床奠定基礎。