液液微萃取結(jié)合GC-MS-SIM法檢測(cè)醬香型白酒中15種微量成分含量

陸倫維，孫優(yōu)蘭，王金龍，韋露露，尹延順，程平言，胡 峰

（貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州習(xí)水 564622）

醬香型白酒是以高粱為主要原料，以高溫大曲作為糖化發(fā)酵劑，采用固態(tài)發(fā)酵方式，經(jīng)蒸煮、糊化、糖化、蒸餾、儲(chǔ)存和勾調(diào)等步驟而形成的蒸餾酒，其工藝復(fù)雜性在中國白酒行業(yè)內(nèi)具有唯一性[1]。在蒸餾、勾調(diào)及貯存體系中，為白酒帶來了豐富的微量成分。這些成分或構(gòu)成白酒骨架香氣，或賦予白酒獨(dú)特風(fēng)格和口感，或賦予白酒多種功效作用[2-4]。

近年來，許多學(xué)者對(duì)醬香型白酒與人體健康的關(guān)系進(jìn)行了深入研究，特別是吡嗪類和酚類化合物[5]。白酒中的吡嗪類化合物是由美拉德反應(yīng)和芽孢桿菌代謝產(chǎn)生。吡嗪是1,4 位含氮的六元雜環(huán)化合物，其衍生物廣泛存在于天然和發(fā)酵食品中，具有類似于炒堅(jiān)果、烤肉的怡人香氣[6]，由于它們具有極低的風(fēng)味閾值，還對(duì)其他香味物質(zhì)有明顯的烘托作用，可使白酒的香氣更為豐滿，對(duì)白酒風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[7-8]。另外，吡嗪還略帶廣藿香、香草根及薄荷香味，用于制作香水，具有強(qiáng)烈、自然、持久的效果[9]。

吡嗪類物質(zhì)作為白酒中一類重要的健康功能因子，很多專家學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了研究。李大和等[10]闡述了白酒中的功能性成分對(duì)人體生理功能有一定影響；孫寶國等[11]對(duì)白酒中有益成分及其功效進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，其中的有益成分主要包括低分子有機(jī)酸、內(nèi)酯類、酚類、雜環(huán)類、氨基酸和微量元素等；徐巖等[12]對(duì)醬香型、濃香型和董香型白酒中的生物活性成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，主要包括萜烯類、吡嗪類以及多酚類化合物；羅強(qiáng)等[13-14]證明了醬香型高溫大曲白酒中吡嗪類物質(zhì)具有體外抗炎活性和對(duì)幽門螺桿菌代謝物誘導(dǎo)人胃上皮細(xì)胞炎癥的抑制作用。除此之外，一些含吡嗪的天然產(chǎn)物對(duì)人類的醛糖還原酶(ALR2)有抑制活性，有助于減輕糖尿病并發(fā)癥[15]。研究表明，吡嗪類化合物具有擴(kuò)張血管、促進(jìn)血循環(huán)、改善學(xué)習(xí)障礙、護(hù)肝等功能[12]，近年來成為白酒健康養(yǎng)生領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

酚類亦稱為多酚，是芳香烴環(huán)上氫被羥基取代的一類芳香族化合物[16]，廣泛存在于釀酒原料中，如葡萄、大麥等各種釀酒谷物[17-20]。酚類物質(zhì)是由釀酒原料中的單寧、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)分解而來，或經(jīng)由發(fā)酵過程中微生物直接代謝生成，或是由釀造過程中形成的氨基酸和阿魏酸等中間產(chǎn)物經(jīng)酵母菌或細(xì)菌代謝生成[21]。揮發(fā)性酚類化合物是白酒中的重要香味組成部分，對(duì)于白酒的聞香、口味及穩(wěn)定性等方面均具有重要的作用。揮發(fā)性酚類化合物在白酒中的含量極少，但呈香作用卻很強(qiáng)，在幾百萬分之一甚至千萬分之一就能使人感覺到強(qiáng)烈的香氣[22]。酚類物質(zhì)為白酒提供了獨(dú)特的煙熏風(fēng)味、焦醬味、奶香味和窖泥味等，是白酒主要的風(fēng)味組成[23-27]。

酚類化合物不僅是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，更是一類具有生理活性的功能成分。4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚不僅是良好的抗氧化成分，還可以預(yù)防疾病、延緩衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、降低血糖活性[28-31]；苯酚作為阿司匹林及磺胺藥等醫(yī)藥的原料，也具有一定的醫(yī)用價(jià)值；愈創(chuàng)木酚可用于慢性支氣管炎多痰咳嗽的治療；麝香草酚具有抗菌活性、祛痰治咳等作用[32]；異丁香酚具有抗氧化、防腐功效[33]。

液液微萃取最大的優(yōu)點(diǎn)是萃取時(shí)間短，且該方法集采樣、萃取和濃縮于一體，具有快速、成本低、富集效率高、有機(jī)溶劑用量少的優(yōu)點(diǎn)[34-35]。本研究建立了液液微萃取結(jié)合GC-MS-SIM 法快速檢測(cè)醬香型白酒中15 種吡嗪和酚類化合物的檢測(cè)方法，并對(duì)12 個(gè)醬香型白酒中吡嗪和酚類化合物的含量分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：見表1，均購于市場(chǎng)。

表1 21個(gè)醬香酒樣信息

試劑：無水乙醇（色譜純），默克公司；乙醚（色譜純，純度≥99.5%），重慶川東化工有限公司；正己烷（色譜純，純度≥99.5%），安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆宦然c（分析純，純度≥99.5%），成都金山化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)樣品2-甲基吡嗪（≥98.0%）、2,5-二甲基吡嗪（≥98.0%）、2,6-二甲基吡嗪（≥98.0 %）、2-乙基吡嗪（≥99.0 %）、2,3-二甲基吡嗪（≥95.0%）、2,3,5-三甲基吡嗪（≥98.0%）、2,3-二乙基吡嗪（≥98.0 %）、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪（≥98.0%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（≥98.0%）、愈創(chuàng)木酚（≥98.0%）、4-甲基愈創(chuàng)木酚（≥98.0%）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（≥97.0%）、苯酚（≥98.0%）、4-甲基苯酚（≥99.0%）、4-乙基苯酚（≥97.0%），ANPEL公司。

儀器設(shè)備：7890A-5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；MPS2多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，德國Gerstel 公司；電子天平AR2130/C，上海奧豪斯公司；QT-1 旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

稱取不同質(zhì)量的各標(biāo)準(zhǔn)樣品于100 mL 容量瓶中，加入53%vol 乙醇水溶液進(jìn)行溶解并定容至刻度線，得到混合標(biāo)樣母液。取混合標(biāo)樣母液1 mL于50 mL 容量瓶中，加入乙醇水溶液稀釋定容，得到稀釋的混標(biāo)溶液；將混標(biāo)溶液分別稀釋1 倍、2倍、4 倍、8 倍、16 倍、32 倍、64 倍作為梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.2.2 樣品前處理

取2 mL 酒樣于25 mL 具塞試管中，用飽和氯化鈉溶液將其稀釋至10%vol左右，旋渦混勻，加入2 mL 萃取劑（乙醚∶正己烷=1∶1）進(jìn)行萃取，渦旋振蕩混勻1 min，靜置分層5 min，取上清液于樣品瓶中上機(jī)分析。

1.2.3 GC-MS分析檢測(cè)

色譜分析條件：安捷倫DB-FFAP 毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速1.2 mL/min，不分流模式，進(jìn)樣量2 μL；升溫程序：起始40 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升溫至80 ℃，不保持，以2.5 ℃/min 升溫至115 ℃，不保持，以8 ℃/min 升溫至155 ℃，不保持，再以5 ℃/min升溫至220 ℃。

質(zhì)譜分析條件：傳輸線溫度250 ℃；EI 離子源；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；四級(jí)桿溫度150 ℃。溶劑延遲7 min；定性采用全掃描模式，掃描范圍30.00～350.00 amu。

1.2.4 定量分析

定量采用SIM 模式，SIM 參數(shù)見表2。以待定量物質(zhì)峰面積（y）為縱坐標(biāo)，待定量物質(zhì)質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)進(jìn)行評(píng)估。

表2 選擇離子檢測(cè)模式參數(shù)

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及表格制作采用軟件Microsoft Excel。

2 結(jié)果與分析

2.1 總離子流圖及標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖

利用標(biāo)準(zhǔn)樣品，根據(jù)上述質(zhì)譜條件，所得總離子色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 15種標(biāo)準(zhǔn)樣品總離子流色譜圖

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

將7 個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品混合液進(jìn)行GC-MS 分析，以質(zhì)量濃度-峰面積進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，15 種標(biāo)準(zhǔn)樣品在各自的線性范圍內(nèi)R2均大于0.9990，線性關(guān)系良好。通過添加標(biāo)準(zhǔn)樣品和重復(fù)進(jìn)樣計(jì)算樣品加標(biāo)回收率和儀器精確性，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，15 種標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于5.00 %，加標(biāo)回收率在84.23 %～98.85 %之間，表明該方法對(duì)于檢測(cè)這15 種標(biāo)準(zhǔn)樣品具有很好的準(zhǔn)確性和精確性，完全能夠滿足分析要求。

表3 15種標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.3 樣品檢測(cè)結(jié)果

按照試驗(yàn)方法分析定量12 個(gè)醬香型白酒中9種吡嗪和6 種多酚含量，結(jié)果如表4 和表5 所示，典型的總離子流圖見圖2。

表4 酒樣中9種吡嗪定量結(jié)果

表5 酒樣中6種多酚定量結(jié)果

圖2 典型樣品總離子

四甲基吡嗪又稱川芎嗪，可通過微生物代謝和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，對(duì)酒體貢獻(xiàn)甜香、水果香及花香，具有抑制血小板聚集、改善微循環(huán)及降低腦萎縮傷害等生理功效。四甲基吡嗪在吡嗪類物質(zhì)中含量最高，12 個(gè)醬香型白酒中均有檢出，但不同樣品中含量差異較為顯著，總體上看，省外酒樣含量相對(duì)較低。其中，JX-8 酒樣中四甲基吡嗪含量最高，達(dá)8.10 mg/L；JX-5 和JX-9 樣品中四甲基吡嗪含量均高于3 mg/L，相對(duì)較高；其余酒樣均低于1 mg/L，相對(duì)較低。2,3-二乙基吡嗪由于含量較低，在所有酒樣中均未檢測(cè)到，其他吡嗪類物質(zhì)均在酒樣中檢測(cè)到。除四甲基吡嗪外，其他含量較高的吡嗪類物質(zhì)有2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪和2-甲基吡嗪，2,3-二甲基吡嗪和2-乙基吡嗪含量相對(duì)較低。從吡嗪類總含量來看，12個(gè)醬香型白酒中吡嗪類物質(zhì)含量范圍為1.00～11.89 mg/L，JX-8酒樣最高，JX-2酒樣最低，差異較為顯著。

酚類物質(zhì)是由高粱、小麥、大曲等釀酒原料中的單寧、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)分解而來，或經(jīng)由發(fā)酵過程中微生物直接代謝生成，或是由釀造過程中形成的氨基酸和阿魏酸等中間產(chǎn)物經(jīng)酵母菌或細(xì)菌代謝生成。4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚是優(yōu)良的自由基清除劑，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、提高免疫力、阻斷致癌物形成等功能。在12個(gè)醬香型酒樣中均檢測(cè)到6 種酚類物質(zhì)，但總含量相對(duì)較低，苯酚在酚類物質(zhì)中含量最高，4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量相對(duì)較低。從酚類物質(zhì)總含量來看，其含量范圍為0.32～0.84 mg/L，JX-4 酒樣最低，JX-12 酒樣最高，酚類物質(zhì)總含量在所有酒樣中差異相對(duì)較小。總之，由于釀酒原料、操作工藝和微生物環(huán)境等差異，導(dǎo)致了不同廠家或地區(qū)的酒樣中吡嗪類物質(zhì)和酚類物質(zhì)的含量差異，進(jìn)而影響了酒體風(fēng)格特征和質(zhì)量。

3 結(jié)論

GC-MS-SIM 方法具有檢測(cè)快速、準(zhǔn)確性高、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用該方法結(jié)合液液微萃取對(duì)12 個(gè)醬香型白酒中的15 種微量成分進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，在醬香型白酒中，四甲基吡嗪是含量最高的吡嗪類物質(zhì)，2，6-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪含量也相對(duì)較高，2,3-二乙基吡嗪因含量較低未在上述酒樣中檢出，不同酒樣中吡嗪類物質(zhì)含量差異較大。酚類物質(zhì)中苯酚含量相對(duì)較高，4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量相對(duì)較低，整體而言，酚類總含量均較低，但因?yàn)槠溟撝迪鄬?duì)較低，對(duì)酒體風(fēng)味仍然有較大貢獻(xiàn)。上述研究結(jié)果可為白酒微量成分研究提供借鑒和參考，白酒中微量成分還有很多值得研究之處，特別是其產(chǎn)生機(jī)制、作用機(jī)制、拮抗機(jī)制及白酒與健康研究等，這是中國白酒研究人員現(xiàn)階段甚至未來幾十年的研究重點(diǎn)領(lǐng)域之一，也是中國白酒進(jìn)軍世界的關(guān)鍵研究點(diǎn)。