實時熒光PCR快速鑒定小金蝠蛾

劉靜遠,朱雅君,傅怡寧,易建平,印麗萍

(上海海關動植物食品檢驗檢疫技術中心,上海 200135)

小金蝠蛾(Hepialus xiaojincusisTu,MaetZhang),隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)蝠蛾屬(Hepialus),是四川小金縣冬蟲夏草的寄主昆蟲[1],四川省阿壩州小金縣是冬蟲夏草主要產地。冬蟲夏草為冬蟲夏草菌(Ophiocordyceps sinensisiBerk.)寄生在蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆蟲幼蟲后形成的蟲的僵體和菌的子實體組合體。據研究,冬蟲夏草寄主昆蟲超過60種[2],大多冬蟲夏草產區(qū)的寄主昆蟲為單一的種類,只有少數種類在多個產地分布[3-4],具有顯著的地域分布特征。小金蝠蛾僅產在四川省阿壩州小金縣,準確鑒定冬蟲夏草寄主小金蝠蛾可實現(xiàn)四川小金縣產的冬蟲夏草的快速、精準鑒定。

冬蟲夏草為寄主蝙蝠蛾科幼蟲僵體與菌的復合體,開展寄主昆蟲形態(tài)鑒定難度較大。針對冬蟲夏草寄主昆蟲分子水平的系統(tǒng)發(fā)育研究主要應用昆蟲線粒體基因COI、Cytb以及16S rDNA基因[5-7],上述基因系統(tǒng)發(fā)育研究表明,冬蟲夏草寄主昆蟲的種間差異較小,鑒定困難[8]?，F(xiàn)今美國國家生物技術信息中心(NCBI)記錄冬蟲夏草寄主昆蟲COI序列較多,但大多只記錄到蝙蝠蛾科(Hepialidae sp.),未能記錄到種,這給冬蟲夏草寄主昆蟲的分子鑒定帶來極大困難。

實時熒光PCR方法相對傳統(tǒng)PCR方法具有快速、準確、靈敏度高的優(yōu)點,適用于昆蟲等許多類群的快速鑒定。為探尋小金蝠蛾線粒體DNA中可用于實時熒光Taqman探針設計的特異性片段,本研究利用小金蝠蛾線粒體基因組全序列與GenBank數據庫中蝙蝠蛾科冬蟲夏草寄主昆蟲的線粒體DNA序列比對[9],尋找小金蝠蛾穩(wěn)定的特異性片段,據此設計實時熒光Taqman探針,隨后篩選可用探針,并優(yōu)化反應條件,建立小金蝠蛾實時熒光PCR快速鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 標本來源

研究于2019年6月到2020年9月,冬蟲夏草產地四川、青海、西藏等地采集冬蟲夏草樣品,包括四川阿壩州小金縣采集的小金蝠蛾成蟲、蛹以及小金縣產的寄主昆蟲為小金蝠蛾的冬蟲夏草。因地理距離近,其親緣關系也較近,選擇與小金縣較近的四川省阿壩州理縣、黑水縣采集的冬蟲夏草為對照,包括:四川省甘孜州康定縣、石渠縣冬蟲夏草,青海果洛州達日縣、軍工縣冬蟲夏草,西藏林芝、西藏亞東冬蟲夏草(表1)。標本浸泡于無水乙醇并儲存于-20℃冰箱中,保存于上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心植檢實驗室。

表1 試驗材料具體信息Table 1 Detailed information of experimental material

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

分別針對小金蝠蛾成蟲、蛹、以及冬蟲夏草寄主昆蟲提取基因組DNA。

取小金蝠蛾成蟲以及蛹的頭部,使用95%酒精清洗組織表面,將清洗后的組織放置于吸水濾紙上,待酒精揮發(fā)后,將組織放入1.5 mL離心管中,用攪拌棒將蟲體組織研碎。取冬蟲夏草寄主昆蟲尾部組織,使用95%酒精清洗組織表面,將清洗后的組織放置于吸水濾紙上,放置2 min,待酒精揮發(fā)后,將組織放入1.5 mL離心管中,放至Omni BeadRuptor 24 Elite均質器中,將組織研碎。使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen,Germany)試劑盒提取樣品基因組DNA,并用NanoVue Plus超微量分光光度計進行DNA濃度測定,記錄參數A260∕A280值。

1.2.2 冬蟲夏草寄主昆蟲的鑒定

1.2.2.1 PCR擴增及測序

為明確冬蟲夏草的寄主昆蟲為小金蝠蛾,使用引物LCO1490∕HCO2198[10]對寄主昆蟲基因組DNA進行擴增。PCR反應體系為50μL,包括:1μL DNA模板(10 ng),引物各1μL(5μmol∕L),5μL dNTPs(10 mmol∕L),5μL 10×PCR buffer(含有Mg2+,TaKaRa Bio.Dalian,China),0.4 g Taq DNA polymerase(TaKaRa Bio.Dalian,China),37μL ddH2O。PCR反應條件為:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,重復35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。

使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,陽性PCR產物委托華大基因科技有限公司進行雙向測序。

1.2.2.2 序列分析

小金蝠蛾線粒體COI序列在GenBank上與已知蝙蝠蛾科昆蟲線粒體基因序列比對,參比序列為GenBank數據庫中436條蝙蝠蛾科冬蟲夏草寄主昆蟲線粒體COI序列,具體種類及序列數見表2。表1中樣品序號1—3經比對對應到小金蝠蛾,相似度為98.52%—99.24%;序號4—11均比對到不同序列號的Hepialidae sp.,說明序號4—11冬蟲夏草寄主昆蟲不是小金蝠蛾。

表2 參考序列信息表Table 2 Reference sequences

1.2.3 實時熒光Taqman探針設計及反應條件

1.2.3.1 供試引物和探針的設計

下載GenBank中小金蝠蛾與其他冬蟲夏草寄主昆蟲線粒體全序列,序列主要為表2序號1、3—7、9。應用MEGA軟件進行序列多重比對,尋找小金蝠蛾與其他種類穩(wěn)定的差異性序列片段,篩選適合于探針、引物設計片段(圖1)。使用Primer Primier 5.0輔助進行引物設計,引物和探針由上?；倒竞铣?。

圖1 小金蝠蛾與近似種序列比對Fig.1 Alignment among sequences of H.xiaojincusis and close related species

1.2.3.2 實時熒光PCR反應條件

實時熒光PCR擴增體系25μL(應用大連寶生物公司TaKaRa Premix Ex TaqTM試劑盒):2×Premix Ex Taq 12.5μL,50×ROX Reference Dye 0.5μL,上下游引物(5μmol∕L)各1.0μL,探針(10μmol∕L)1.0μL,DNA模板2.0μL,超純水補至25μL。

實時熒光PCR擴增在AB 7500 Real-Time PCR System定量PCR擴增儀上進行。反應條件為:預變性95℃30 s;然后95℃5 s,60℃30 s循環(huán)40次。

1.2.3.3 特異性檢測

以樣品XJ01的DNA為模板,水為空白對照,進行實時熒光PCR。選用與小金蝠蛾較近緣的四川省阿壩州黑水縣、理縣的冬蟲夏草、甘孜州康定縣、石渠縣的冬蟲夏草以及西藏、青海等地的冬蟲夏草進行小金蝠蛾探針特異性檢測。

1.2.3.4 靈敏度測試

在XJ01樣品DNA濃度的基礎上,進行10倍梯度稀釋,經實時熒光PCR測定,反應體系和反應條件不變。

2 結果與分析

2.1 引物與實時熒光Taqman探針篩選

通過比對小金蝠蛾及幾個近似種的mtDNA基因序列,最終確定在小金蝠蛾線粒體COIII區(qū)段上設計探針(圖1)。探針的熒光標記信號FAM,引物分別為XJF2∕XJR2,具體內容見表3。

表3 鑒別小金蝠蛾的實時熒光PCR引物、探針Table 3 Primer and probe used in real-time PCR for diagnosing H.xiaojincusis

2.2 實時熒光PCR檢測引物與探針的特異性

經實時熒光PCR擴增,小金蝠蛾特異性探針PC-MGB2對供試的6個小金蝠蛾及寄主昆蟲為小金蝠蛾的冬蟲夏草樣品(表1樣品序號1—3)均出現(xiàn)熒光增長曲線,有強的熒光信號增加,表現(xiàn)為陽性擴增,樣品擴增曲線參照圖2。而供試的6個(表1樣品序號4—9)的寄主昆蟲非小金蝠蛾的冬蟲夏草樣品和空白對照則沒有檢測到熒光信號,表現(xiàn)為陰性,樣品擴增曲線參照圖3。

圖2 TaqMan實時熒光PCR鑒別小金蝠蛾的檢測Fig.2 Detection of the TaqMan real-time PCR for diagnosing H.xiaojincusis

圖3 小金蝠蛾的TaqMan實時熒光PCR特異性檢測Fig.3 Specific detection of H.xiaojincusis with TaqMan real-time PCR

2.3 實時熒光PCR檢測的靈敏度

經檢測,XJ01DNA樣品DNA濃度為334 ng∕μL,其A260∕280值為1.966。將XJ01DNA按10倍梯度稀釋,進行實時熒光檢測。熒光信號曲線如圖4所示,Ct值分別為1號18.43、2號20.95、3號24.59、4號27.72、5號29.64、6號34.53、7號37.39。由于7號的Ct值＞35,無法確定是否為陽性。所以,小金蝠蛾特異性探針PC-MGB2的檢測限位DNA濃度為334×10-5ng∕μL,即3.34 pg∕μL。

圖4 TaqMan實時熒光PCR鑒別小金蝠蛾的靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity test of the TaqMan real-time PCR for diagnosing H.xiaojincusis

3 討論

小金蝠蛾是冬蟲夏草優(yōu)勢寄主昆蟲,作為優(yōu)勢寄主廣泛應用于冬蟲夏草的培育領域[11]。冬蟲夏草寄主昆蟲種類超過60種,種類分布具有地域性[2]。小金蝠蛾僅分布在四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣,可根據寄主昆蟲判定冬蟲夏草產地。

昆蟲鑒定條形碼基因基本集中在線粒體基因上。陳抒云等[6]研究表明,線粒體COI基因適合用于冬蟲夏草寄主昆蟲DNA條形碼研究,全慶梅[12]研究表明,COI基因較COII、Cytb基因更能反映冬蟲夏草寄主昆蟲的遺傳分化。彭樹英等[7]用16S rDNA基因分析了冬蟲夏草寄主蝠蛾的系統(tǒng)進化關系,認為該基因可用于科屬級分類標記基因。但GenBank上記錄的冬蟲夏草寄主昆蟲序列大多為COI序列,且只記錄到蝙蝠蛾科,只有少數種類到種,這使基于DNA條形碼的冬蟲夏草寄主昆蟲的分子鑒定缺少標準對照。

本研究針對局限分布的小金蝠蛾探索實時熒光特異性Taqman探針鑒定方法,為小金蝠蛾的鑒定提供了一種新方法,對小金蝠蛾成蟲、蛹以及寄主冬蟲夏草昆蟲小金蝠蛾均能精準鑒定,較之使用線粒體COI基因序列比對鑒定小金蝠蛾的方法省去了電泳跑膠、序列比對等程序。在引物與探針的雙重保證下,完成了小金蝠蛾的實時熒光PCR快速、精準鑒定,基于此,可探索基于寄主昆蟲的冬蟲夏草產地溯源研究。根據試驗靈敏度測試結果,對樣品的DNA最低濃度要求可達到pg級,靈敏度較高。