絲狀真菌培養(yǎng)及其產(chǎn)物的研究進展

李一華，徐賢柱

（江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330022）

絲狀真菌俗稱霉菌，是具有發(fā)達菌絲體且不產(chǎn)生大型子實體的一類異養(yǎng)真核生物。絲狀真菌通常附著在有機物上生長，是地球上出現(xiàn)最早且分布最廣的生物類群[1]。絲狀真菌廣泛存在于陸地土壤、水體及水體沉積物中，或以內(nèi)生真菌的形式存在于植物根系或內(nèi)部。絲狀真菌是生物活性天然化合物的重要來源，其產(chǎn)物包括抗生素、多肽、多糖及植物激素等，其中部分產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌等作用，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域都得到了不同程度的應(yīng)用[2]。

1 絲狀真菌的培養(yǎng)

1.1 半合成固體培養(yǎng)基培養(yǎng)

半合成固體培養(yǎng)基性質(zhì)穩(wěn)定，能夠比較清晰地呈現(xiàn)絲狀真菌的特征，往往用于絲狀真菌的分離、鑒定與保藏。市售用于培養(yǎng)絲狀真菌的半合成固體培養(yǎng)基主要為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），此外有沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基等[3]。李志克等[4]從四川省阿壩州茂縣溝口鎮(zhèn)與疊溪鎮(zhèn)花椒園取根腐病花椒病根樣本，使用組織分離法，切取5 mm×5 mm樣本，在PDA試管斜面培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)，分離出了該種花椒根腐病的病原菌腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）。

1.2 半合成液體培養(yǎng)基培養(yǎng)

抗生素生產(chǎn)工業(yè)得到發(fā)展以后，液體發(fā)酵技術(shù)在真菌發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。用液體發(fā)酵的方式培養(yǎng)絲狀真菌具有周期短、效率高、產(chǎn)量高及可連續(xù)等優(yōu)勢，發(fā)酵液中還會產(chǎn)生氨基酸、維生素、酶等多種化合物，因此是十分理想的絲狀真菌產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)方式[5]。用于絲狀真菌培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基內(nèi)往往包括碳源、氮源、無機鹽和生長因子等成分[6]。此外，在實際的生產(chǎn)發(fā)酵中，需要根據(jù)生產(chǎn)的不同需求及生產(chǎn)菌種的不同特性，針對性地對培養(yǎng)基成分（如碳源、氮源）進行改良，以達到高效生產(chǎn)的目的。

1.3 天然固體培養(yǎng)基培養(yǎng)

以木屑、大米、馬鈴薯等天然營養(yǎng)成分為來源的培養(yǎng)基也可以用于絲狀真菌的培養(yǎng)。部分天然培養(yǎng)基的原材料為農(nóng)作物余料或副產(chǎn)物，具有來源豐富、價格低廉的優(yōu)勢。王麗芳等[7]使用木屑基礎(chǔ)培養(yǎng)基（木屑78%、石膏1%、玉米粉20%、蔗糖1%及固體基料重量80%的水，混合均勻取自然pH）對野生痂狀炭角菌（Xylaria escharoidea）進行培養(yǎng)，并以基料重量1%的比例添加氨基酸，對木屑培養(yǎng)基進行優(yōu)化。白永軍等[8]使用大米培養(yǎng)基培養(yǎng)黃曲霉（Aspergillus flavus），并從大米培養(yǎng)基發(fā)酵液中分離鑒定出5種不同的次生代謝產(chǎn)物。實驗結(jié)果表明，使用大米作為黃曲霉的培養(yǎng)基質(zhì)可以在控制成本的同時得到豐富的產(chǎn)物。

2 絲狀真菌產(chǎn)物的種類與應(yīng)用

2.1 生產(chǎn)抗生素

人類利用抗生素已有近90年的歷史。如青霉素的發(fā)現(xiàn)推動了抗生素工業(yè)的發(fā)展，催生了大量與抗生素相關(guān)的研究。然而，野生絲狀真菌菌株往往在產(chǎn)量上不能滿足生產(chǎn)的需求，生產(chǎn)上應(yīng)用的工業(yè)菌株往往經(jīng)過了不同手段的菌株改良，其效價和生產(chǎn)率與原始菌株相比高出3～5個數(shù)量級。段志鋼等[9]采用高能電子誘變技術(shù)對黃青霉菌原生質(zhì)體進行誘變，并結(jié)合高通量篩選方法，得到了青霉素高產(chǎn)的黃青霉菌菌株B13-15-36。該菌株發(fā)酵單位可達到14萬U/mL，較之前提高了46%，同時優(yōu)化了青霉素發(fā)酵工藝，得到了更低成本、更高效率的青霉素生產(chǎn)方法。

2.2 生產(chǎn)脂質(zhì)

絲狀真菌是優(yōu)良的脂質(zhì)來源。如高山被孢霉（Mortierella alpina）是一種具有代表性的產(chǎn)油絲狀真菌，菌絲油脂含量高達自身干重的50%以上，產(chǎn)物多為長鏈多不飽和脂肪酸。目前，高山被孢霉主要用于生產(chǎn)其胞內(nèi)油花生四烯酸（Arachidonic Acid，ARA），現(xiàn)已作為商業(yè)菌株被廣泛投入生產(chǎn)。高山被孢霉產(chǎn)脂條件優(yōu)化也是當(dāng)前的研究熱點之一。CHANG等[10]提出了高山被孢霉發(fā)酵花生四烯酸的一系列優(yōu)化方案，包括以正己烷作為氧載體或提高氧分壓提高溶解氧（DO）、采用分批補料系統(tǒng)維持有利于脂質(zhì)積累的碳氮比、選擇廉價復(fù)合氮源等。這些方法均能在控制生產(chǎn)成本的前提下提高高山被孢霉的脂質(zhì)生產(chǎn)效率。

2.3 生產(chǎn)蛋白質(zhì)類產(chǎn)物

絲狀真菌可以通過頂端分泌的方式經(jīng)胞吐作用分泌蛋白質(zhì)，具有優(yōu)越的蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力。與原核生物相比，絲狀真菌具有成熟的翻譯后修飾系統(tǒng)，在用于生產(chǎn)各類蛋白質(zhì)產(chǎn)物時具有諸多優(yōu)勢。目前，市面上有超過50%的商用蛋白質(zhì)都來源于絲狀真菌。

絲狀真菌本身可以產(chǎn)生種類多樣的酶，經(jīng)過分離篩選可以得到具有生產(chǎn)潛力的優(yōu)良菌株。馮欣欣等[11]從新疆寒冷地區(qū)腐木中的真菌進行了6次分離和純化，共得21個目標菌株，采用DNS法篩選出具有纖維素酶（CMC）活性的菌株，鑒定結(jié)果分別為脈紋孢菌（Neurospora sitophila）、桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride）和產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）。實驗表明，這些菌株均具有在低溫條件下生產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良特性。HE等[12]建立了一種將熒光激活細胞分選（FAC）技術(shù)與紅色熒光蛋白DsRed表達偶聯(lián)的高通量篩選方法，用于分離纖維素酶高產(chǎn)的里氏木霉（Trichoderma reesei）菌株，并使用該方法成功篩選出了兩株纖維素酶高產(chǎn)的里氏木霉菌株，其纖維素酶活性分別較普通菌株高出46%和27%，驗證了該方法用于篩選高產(chǎn)菌株的可行性。

絲狀真菌經(jīng)過基因工程等技術(shù)改造，亦可以用于生產(chǎn)異源蛋白。ARAKI等[13]運用減毒選擇標記法標記大豆黃曲霉的啟動子區(qū)域并將其截斷，成功引入了異源蛋白的表達基因，建立了大豆黃曲霉異源蛋白高水平表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)在非選擇性培養(yǎng)基上也能維持其蛋白產(chǎn)量，可用于產(chǎn)業(yè)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

2.4 生產(chǎn)色素

生物色素可以從植物、動物和微生物中獲得，這些天然來源的色素往往具有生物可降解、環(huán)境友好、毒性較低等優(yōu)點。其中，動植物生產(chǎn)的色素具有色素不穩(wěn)定、溶解性高、生產(chǎn)依賴季節(jié)等缺點，相比之下微生物具有生長速度快、產(chǎn)物穩(wěn)定且不受季節(jié)影響的優(yōu)點。而在微生物中，真菌不需要陽光、受外界因素影響較小，最適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。近年來，不斷有新的真菌被發(fā)現(xiàn)具有生產(chǎn)色素的能力，這些真菌廣泛存在于海洋、陸地土壤及紅樹林生態(tài)系統(tǒng)等環(huán)境中。例如，拜萊青霉（Penicillium bilaii）是一種從澳大利亞塔斯馬尼亞休恩港分離的海洋真菌，能夠產(chǎn)生黃色真菌色素；新南威爾士州沙爾維附近采集的一種青霉分離菌被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生黃色色素等。

2.5 生產(chǎn)有機酸

有機酸是微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的重要物質(zhì)。絲狀真菌可以產(chǎn)生種類多樣的有機酸，其中不乏具有抗菌、抗氧化等生物活性的優(yōu)良產(chǎn)物。檸檬酸是一種重要的平臺化合物，目前作為化學(xué)產(chǎn)品的檸檬酸主要來自絲狀真菌黑曲霉深層液體發(fā)酵。HU等[14]總結(jié)了絲狀真菌黑曲霉的檸檬酸生產(chǎn)與優(yōu)化策略，包括利用代謝工程手段使得黑曲霉的糖化酶基因過度表達、利用等離子體誘變得到高產(chǎn)突變株、優(yōu)化培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件等。這些手段往往能使黑曲霉菌株的檸檬酸產(chǎn)量較原始水平有很大幅度的提高，較大限度地發(fā)揮黑曲霉的生產(chǎn)能力。

2.6 其他產(chǎn)物

除了上述產(chǎn)物以外，在真菌次級代謝產(chǎn)物中還有大量結(jié)構(gòu)新穎的生物活性化合物被不斷發(fā)現(xiàn)。劉碧麗等[15]使用乙酸乙酯萃取及減壓硅膠柱洗脫等方法對一株海底沉積物來源的青霉菌（Penicillium polonicumH92）進行分離純化與液體發(fā)酵，從發(fā)酵液中分離出7種次生代謝產(chǎn)物，包括4個喹啉酮類化合物、2個二酮哌嗪類化合物和1個生物堿，其中部分化合物被證明對流感病毒神經(jīng)氨酸酶具有抑制活性。趙江源等[16]對一種土壤真菌煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的固態(tài)發(fā)酵物采用硅膠柱層析和Sephadex LH-20分離純化，并使用核磁共振波譜法進行結(jié)構(gòu)鑒定，分離出13種化合物。在后續(xù)的抗氧化活性實驗中，證明化合物8（ourosperone A）對ABTS＋（IC50為0.155 mg/mL）、DPPH（IC50為3.453 mg/mL）自由基具有一定的清除效果。

ORBAN等[17]提出，絲狀真菌來源的芳香性物質(zhì)在許多產(chǎn)業(yè)尤其是食品產(chǎn)業(yè)也具有巨大的應(yīng)用前景。許多絲狀真菌能夠產(chǎn)生兼具營養(yǎng)與風(fēng)味的特殊成分，包括多種醇類、酮類和酯類化合物。這些具有芳香氣味的化合物能為發(fā)酵類的食物提供特有的風(fēng)味與營養(yǎng)價值，作為食品添加劑或香料也具有優(yōu)秀的潛力。

3 結(jié)語

絲狀真菌作為一種常見的微生物，對其培養(yǎng)與利用已具有漫長且深厚的基礎(chǔ)；20世紀青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，絲狀真菌及其產(chǎn)物的研究更是進入了新的紀元。絲狀真菌分布廣泛、種類繁多、容易大規(guī)模培養(yǎng)，且多數(shù)具有性質(zhì)穩(wěn)定、環(huán)境友好、毒性較低或無毒的優(yōu)點，是非常理想的產(chǎn)業(yè)化微生物，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等許多領(lǐng)域都占據(jù)了重要的地位。然而到目前為止，還有許多絲狀真菌的發(fā)酵產(chǎn)業(yè)處于產(chǎn)率較低、產(chǎn)物品質(zhì)較差的狀態(tài)，許多優(yōu)化手段也還停滯在試驗階段。此外，部分絲狀真菌菌種還具有會自身降解產(chǎn)物、產(chǎn)量不穩(wěn)定、培養(yǎng)條件復(fù)雜等缺點。因此，如何有效優(yōu)化培養(yǎng)方式并投入應(yīng)用、如何選育高產(chǎn)且穩(wěn)定的優(yōu)良菌株是絲狀真菌資源研究的當(dāng)務(wù)之急。

近年來不斷有新穎的化合物從絲狀真菌中被分離，但其中許多化合物的具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生機理還未能明了。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展及聯(lián)合質(zhì)譜等技術(shù)的跟進，絲狀真菌及其產(chǎn)物的應(yīng)用還有著無限的可能性。