蛋清蛋白-β-環(huán)狀糊精復(fù)合物對小龍蝦蝦仁凍融穩(wěn)定性的影響

張新燦，李小定

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢 430070）

小龍蝦學(xué)名為克氏原螯蝦（Procambarus clarkia），屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目、蝲蛄科、淡水螯蝦屬[1]。小龍蝦原產(chǎn)于美國和墨西哥，在20世紀(jì)20年代末經(jīng)日本引入我國南京[2]，然后逐漸擴(kuò)展流通至長江中下游地區(qū)，江蘇、安徽、湖北等地為其主要養(yǎng)殖地區(qū)[3]。小龍蝦除了以精美的菜肴形式呈現(xiàn)給消費者外，大部分以冷凍整蝦、冷凍蝦仁、凍蝦黃等成品或者半成品出口，主要出口美洲、歐洲等地區(qū)的國家[4]，為我國帶來巨大的社會效益與經(jīng)濟(jì)效益。但是小龍蝦及其產(chǎn)品大都需要冷鏈運輸，所需設(shè)備和儀器成本高、能耗大，并且在運輸過程中會不可避免的因為溫度的升高而融化，再次冷凍又會使得蝦仁重新結(jié)晶。蝦仁在凍融過程中重新生成的冰晶，由于其形狀不規(guī)則，顆粒大，會擠壓肌肉組織導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，汁液外流，質(zhì)地變軟[5]。此外，蝦仁在凍融過程中蛋白質(zhì)和脂肪的氧化也不容忽視，凍融過程中，蛋白質(zhì)氧化使得肽鏈展開，疏水性氨基酸暴露[6-7]。脂肪分解產(chǎn)生丙二醛等代謝產(chǎn)物也是造成肉制品品質(zhì)下降的重要原因[8]。

雞蛋清中含有豐富的蛋清蛋白（Egg white protein，EWP），由于游離巰基（SH）的存在，EWP可以通過結(jié)合金屬離子來調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)[9]。研究表明，在肌原纖維蛋白中添加EWP可抑制其在凍藏過程中的結(jié)晶、蛋白質(zhì)和疏水相互作用引起的蛋白氧化，還可減少表面疏水性增加引起的結(jié)構(gòu)變化[10]。此外，將蛋清蛋白作為低熱量冷凍保護(hù)劑可以減緩翹嘴鲌肌原纖維蛋白在反復(fù)凍融循環(huán)或長期冷凍儲存下的氧化、營養(yǎng)損失和感官惡化[11]。

β-環(huán)狀糊精（β-cyclodextrin，β-CD）已被報道為肉類產(chǎn)品中的冷凍保護(hù)劑，可以減少酶活性的損失來防止蛋白質(zhì)損傷[12]。β-CD中大量的羥基可以與水分子或某些蛋白質(zhì)形成氫鍵，阻止水分子的移動，冷凍狀態(tài)下減少冰晶生成并阻止其進(jìn)一步生長，減少對產(chǎn)品造成的物理擠壓，進(jìn)而對產(chǎn)品到保護(hù)作用。β-CD的親水性伯醇羥基全部排列在筒形立體結(jié)構(gòu)的外側(cè)，而疏水基C-H排列在內(nèi)壁，使得β-CD的外側(cè)親水，空穴疏水，鑒于這一獨特的分子特性，可以與溶劑中暴露的疏水性氨基酸殘基結(jié)合[13]，抑制蛋白質(zhì)的聚集。研究表明，在鲌魚中添加β-CD可減少魚肉白度、持水性和硬度的下降幅度，同時有效抑制了肌肉組織的結(jié)構(gòu)劣化，保護(hù)了內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性[14]。在肌原纖維蛋白中添加β-CD后，羰基含量顯著減小，同時延緩了巰基含量下降[10]，提高了肌原纖維蛋白凝膠硬度、彈性、膠質(zhì)度和粘結(jié)性以及白度和保水性能[15]。

目前，大多數(shù)研究關(guān)注單一種類的物質(zhì)作為冷凍保護(hù)劑在冷凍儲存期間對肉制品的影響，例如蔗糖、山梨糖醇、寡糖和多糖。當(dāng)與其他食物的添加劑（蛋清蛋白、多酚等）結(jié)合使用時，它們作為冷凍保護(hù)劑的冷凍保護(hù)能力可以增強(qiáng)[11]。蛋白與糖類可以通過兩者的靜電相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使其具有更加穩(wěn)定的性質(zhì)和更廣闊的使用范圍[16]。EWP在加熱時可形成熔融的球狀蛋白，通過填充作用提高肉制品的保水性[10]。此外，與糖的共價鍵可增強(qiáng)EWP的抗氧化性能[15]。因此，本文以EWP和β-CD為原料制備EWP-β-CD復(fù)合抗凍劑，探究EWP-β-CD復(fù)合物對蝦仁品質(zhì)的保護(hù)作用，以期改善蝦仁在反復(fù)凍融過程中的品質(zhì)劣變問題，為開發(fā)綠色健康的抗凍劑提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋清白蛋白（EWP）（純度90%）、β-環(huán)狀糊精（β-CD）（純度99%）、過氧化氫酶（牛肝BR，2000～5000 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；鮮活小龍蝦（35～40 g/只） 淮安漁夫水產(chǎn)有限公司；牛血清蛋白 廣州賽國生物科技有限公司；福林酚 北京索萊寶科技有限公司；0.1 mol/L檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液（pH3.0～6.0） 上海澤葉生物科技有限公司、Tris-HCl緩沖液（pH7.0～9.0） 廣州碩譜生物科技有限公司、甘氨酸-HCl緩沖液（pH10.0） 上海滬震實業(yè)有限公司；其余試劑 均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-1500紫外-可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀 Thermo Scientific；PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Avanti JXN-26冷凍離心機(jī)、Allegra 64R冷凍離心機(jī) Beckman Coulter；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀

英國STABLE MICROSYS公司；DR-410色差儀日本Konica Minolta公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EWP-β-CD復(fù)合物制備工藝優(yōu)化

1.2.1.1 復(fù)合物制備 準(zhǔn)確稱取60 g EWP溶于2000 mL蒸餾水，室溫下磁力攪拌3 h，充分溶解后放入4 ℃冰箱過夜，得到EWP樣品濃度為0.03 g/mL的儲備液。準(zhǔn)確稱取6 gβ-CD溶于1000 mL EWP儲備液，使得EWP樣品濃度為0.03 g/mL、β-CD樣品濃度為0.6 g/100 mL，β-CD與EWP的復(fù)合比為1:5。用緩沖液調(diào)節(jié)EWP儲備液、EWP與β-CD的混合溶液pH為7.0，并將所有溶液在70 ℃水浴中加熱3 h，加熱后振蕩樣品并冷卻至室溫，測定其抗凍活性[17]。

1.2.1.2 抗凍活性的測定方法 樣品抗凍活性的測定和過氧化氫酶活力的測定參考劉璐的方法略作修改[18]。向100 μL 0.02 mg/mL過氧化氫酶液中加入50 μL樣品溶液，測定初始酶活力，然后將該樣品放入-20 ℃冰箱冷凍12 h，取出后37 ℃水浴解凍，測定解凍后的酶活力。

將1 mL的0.1%過氧化氫稀釋液和0.1 mL的過氧化氫酶液混勻，測定240 nm處的吸光值，靜置10 min后再測定一次。以10 min內(nèi)240 nm處的吸光值減少0.1為1個酶活力單位（U）。

1.2.1.3 單因素實驗 根據(jù)預(yù)試驗預(yù)設(shè)混合溶液pH為7.0，β-CD與EWP的復(fù)合比為1:5和熱處理溫度70 ℃為單因素實驗中的常規(guī)量。以pH（3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0）、β-CD與EWP的復(fù)合比（1:20、1:10、1:5、1:2、1:1）、熱處理溫度（65、70、75、80、85 ℃）3個因素變量替換試驗中的常規(guī)量。按照1.2.1.1方法制備樣品，測定其抗凍活性，確定單因素的最佳取值范圍。

1.2.1.4 響應(yīng)面設(shè)計試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以pH（A）、β-CD與EWP的復(fù)合比（B）、熱處理溫度（C）3個因素為自變量，以抗凍活性為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗。實驗因素與水平見表1。

表1 試驗因素與水平編碼表Table 1 Coding table of experimental factors and levels

1.2.2 小龍蝦蝦仁凍融循環(huán)品質(zhì)的測定

1.2.2.1 蝦仁樣品的制備 將小龍蝦用清水沖洗干凈，去頭、殼、蝦線后得到蝦仁。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗的結(jié)果，選擇pH為7.0，β-CD:EWP為1:10，熱處理溫度為75 ℃制備EWP-β-CD復(fù)合物，冷凍干燥后即為EWP-β-CD復(fù)合物。將蝦仁分別用2%、4%、6%的EWP-β-CD復(fù)合物浸泡，并選擇用蒸餾水浸泡作為空白對照，商業(yè)抗凍劑（4%蔗糖+4%山梨糖醇）浸泡為陽性對照，分別命名為2% EWP-β-CD、4%EWP-β-CD、6% EWP-β-CD，空白對照，陽性對照。所有處理組在4 ℃下浸泡6 h，真空包裝，-80 ℃冷凍6 h。-18 ℃冷凍1周，然后4 ℃解凍6 h，此為一次凍融循環(huán)。

1.2.2.2 解凍損失率測定 參考張樹峰等[19]的方法略作修改。解凍前將蝦仁稱重M1，4 ℃冰箱中解凍后，用濾紙擦去表面水分后稱重M2，計算蝦仁解凍損失率。

1.2.2.3 質(zhì)構(gòu)特性分析 參考汪蘭等[20]的方法略作修改。采用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀及其軟件，使用P/36R探頭對蝦仁背部第二腹節(jié)肌肉進(jìn)行2次壓縮質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）測試。測定指標(biāo)包括硬度、咀嚼性、回復(fù)性、彈性和內(nèi)聚性。

TPA參數(shù)：測量前探頭下降速度3 mm/s，測試速度0.5 mm/s，測試后回程速度3 mm/s，測試距離5 mm，觸發(fā)力5 g，形變50%，兩次壓縮時間間隔5 s。

1.2.2.4 色差測定 參考陸云飛等[21]的方法略作修改。用高精度色差儀測定蝦仁第二腹節(jié)表面的亮度值L*、紅綠值a*、黃藍(lán)值b*，根據(jù)公式計算白度W。

1.2.2.5 TCA-可溶性肽含量測定 參考Benjakul等[22]的方法略作修改。稱取2 g處理后的蝦仁，加入預(yù)冷的18 mL 5%的三氯乙酸，冰浴中8000 r/min均質(zhì)2 min，然后4 ℃靜置1 h后再以4 ℃，10000 r/min離心15 min，離心后取上清液1 mL，加入5 mL 0.4 mol/L的Na2CO3溶液，1 mL福林酚，然后40 ℃水浴20 min，680 nm處測吸光值，對照酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.01x+0.06，R2=0.999）得到樣品中酪氨酸濃度，最終結(jié)果用μmol酪氨酸/g樣品表示（umol Tyrosine/g Sample）TCA-可溶性肽含量。

式中：x表示樣品中酪氨酸濃度，μg/mL；MTyrosine為181.19 g/mol。

1.2.2.6 脂肪氧化程度分析 參考GB 5009.181-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙二醛的測定》分光光度法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均做三次平行，實驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Microsoft excel 2019整理數(shù)據(jù)，Origin 2021軟件作圖，IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異判別標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EWP-β-CD復(fù)合物制備工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實驗

2.1.1.1 pH對EWP-β-CD復(fù)合物抗凍活性的影響

過氧化氫酶在低溫凍藏條件下酶活力會因為溫度的降低而減弱，因此可以用過氧化氫酶活力的大小表示抗凍活性的大小[18,23]。圖1反映不同pH的EWP和EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的變化情況。由圖可知，隨著pH的增大，EWP和EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性先增大后減小，當(dāng)pH為7.0時，兩者的抗凍活性均達(dá)到最大值64.00%和76.61%，且EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性顯著高于EWP（P＜0.05），因此，β-CD的加入可以增強(qiáng)EWP的抗凍活性。研究表明，EWP與β-CD在中性條件下可通過靜電相互作用形成可溶性復(fù)合物，原因是此時EWP表面帶有負(fù)電荷，β-CD表面帶有正電荷，正負(fù)電荷會發(fā)生相互吸引，形成的復(fù)合物同時改善了EWP和β-CD的功能性質(zhì)，這可能是pH為7.0時EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性較高的原因[16]。因此，選擇7.0作為pH的較優(yōu)水平。

圖1 不同pH的EWP和EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性變化Fig.1 Changes of antifreeze activity of EWP and EWP-β-CD composite system at different pH

2.1.1.2 復(fù)合比對EWP-β-CD復(fù)合物抗凍活性的影響 圖2顯示了不同復(fù)合比的EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性變化。隨著β-CD添加量的增加（β-CD與EWP的復(fù)合比由1:20變化到1:10），EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)β-CD與EWP的復(fù)合比為1:10時，EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性最大，比EWP提高了23.43%。隨著復(fù)合比繼續(xù)增加，抗凍活性逐漸減小，當(dāng)β-CD與EWP的復(fù)合比為1:1時，EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性僅為52.31%，顯著低于EWP（P＜0.05）。隨著β-CD添加量的增加，β-CD所帶的正電荷為EWP表面的負(fù)電荷提供了更多的結(jié)合位點，可以形成更多的EWP-β-CD復(fù)合物，對過氧化氫酶的保護(hù)效果增強(qiáng)，從而表現(xiàn)出更高的抗凍活性[16]。因此，選擇1:10作為復(fù)合比的較優(yōu)水平。

圖2 不同復(fù)合比的EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性Fig.2 Antifreeze activity of EWP-β-CD composite system at different composite ratio

2.1.1.3 溫度對EWP-β-CD復(fù)合物抗凍活性的影響圖3顯示了不同熱處理溫度的EWP和EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的變化。隨著熱處理溫度的升高，EWP的抗凍活性呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢，當(dāng)熱處理溫度為75 ℃時，EWP的抗凍活性為75.51%，顯著高于80 ℃處理的EWP（P＜0.05）。與EWP相比，β-CD的加入顯著提高了EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性（P＜0.05）。隨著溫度的升高，EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性呈先升高再降低的趨勢，當(dāng)熱處理溫度為70 ℃和75 ℃時，EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性分別為78.54%和81.42%，二者無顯著性差異（P＞0.05）。因此，選擇75℃作為溫度的較優(yōu)水平。

圖3 不同熱處理溫度的EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性Fig.3 Antifreeze activity of EWP-β-CD composite system at different heat treatment temperatures

2.1.2 響應(yīng)面試驗

2.1.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 以抗凍活性為響應(yīng)值，選取pH（A）、β-CD與EWP的復(fù)合比（B）和熱處理溫度（C）為主要因素的自變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，進(jìn)一步優(yōu)化EWP-β-CD復(fù)合物的工藝，試驗方案與結(jié)果見表2。

2.1.2.2 響應(yīng)面回歸模型的方差分析 使用Design Expert 10.0.1軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合與方差分析，得回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 2 Scheme and results of response surface test design

回歸方程方差分析見表3。

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results of regression equation

經(jīng)分析，該抗凍活性模型的F值為48.77，P＜0.0001，失擬項的F值為1.06，P=0.459＞0.05，失擬項不顯著，模型的R2=0.9641，因此該回歸方程參數(shù)可靠，準(zhǔn)確性高。一次項A、B，二次項A2、B2、C2的影響極顯著（P＜0.01），一次項C的影響顯著（P＜0.05）；交互項影響均不顯著。

2.1.2.3 響應(yīng)面圖分析 分別將模型中的pH、β-CD與EWP的復(fù)合比和熱處理溫度三個因素中的一個因素固定在零水平，研究另外兩個因素的改變和他們之間的相互作用對EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性影響，得到的子模型結(jié)果分別如圖4～圖6所示，AB、AC和BC的相互作用均不顯著，與方差分析得到的結(jié)果相似。

圖4 pH和β-CD與EWP的復(fù)合比的相互作用對EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的影響Fig.4 Effect of interaction between pH and composite ratio of β-CD and EWP on antifreeze activity of EWP-β-CD composite system

圖6 β-CD與EWP的復(fù)合比和處理溫度交互作用對EWPβ-CD復(fù)合體系抗凍活性的影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Effect of interaction between composite ratio of β-CD and EWP and heat treatment temperature on antifreeze activity of EWP-β-CD composite system

2.1.2.4 工藝參數(shù)的確定 通過EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的響應(yīng)面模擬得到EWP-β-CD復(fù)合體系的最佳制備條件和抗凍活性結(jié)果如下：pH為6.8，β-CD與EWP的復(fù)合比為1:8.33，熱處理溫度為73 ℃，此時EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性可以達(dá)到最大值83.97%?？紤]到實際生產(chǎn)應(yīng)用中難以達(dá)到如此高精度和高準(zhǔn)確度的條件，為使EWP-β-CD復(fù)合體系的制備更能廣泛和普遍的應(yīng)用，現(xiàn)將EWP-β-CD復(fù)合體系的最佳制備條件修改成pH7.0，β-CD與EWP的復(fù)合比1:10，熱處理溫度75 ℃。經(jīng)檢驗，此時EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性為84.09%±1.06%，與理論的最大值很接近。此響應(yīng)面法優(yōu)化得到的制備高抗凍活性EWP-β-CD復(fù)合體系的參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，可以代替理論值進(jìn)行使用。

圖5 pH和熱處理溫度的相互作用對EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的影響Fig.5 Effect of interaction between pH and heat treatment temperature on antifreeze activity of EWP-β-CD composite system

2.2 EWP-β-CD復(fù)合物對小龍蝦仁品質(zhì)的影響

2.2.1 蝦仁凍融循環(huán)過程總解凍損失率的變化 蝦仁的解凍損失（Thawing loss，TL）可反映肌肉組織保持水分的能力[24]。添加不同抗凍劑的蝦仁經(jīng)凍融循環(huán)后，TL如圖7所示。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，所有處理組蝦仁TL均逐漸增大。其中商業(yè)抗凍劑TL值低于其他樣品，表明商業(yè)抗凍劑能更好地保持蝦仁水分。當(dāng)凍融循環(huán)次數(shù)一定時，隨著EWP-β-CD復(fù)合物添加量的增大，蝦仁TL逐漸減小，表明EWP-β-CD復(fù)合物的添加量為6%時，更能保持蝦仁水分。

圖7 蝦仁解凍損失率變化Fig.7 Changes of thawing loss rate of shrimp

2.2.2 蝦仁凍融循環(huán)過程質(zhì)構(gòu)特性分析 添加不同抗凍劑的蝦仁TPA參數(shù)如表4所示。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，蝦仁硬度、咀嚼性、回復(fù)性、彈性、內(nèi)聚性均逐漸減小。這是因為在凍融循環(huán)過程中，在細(xì)胞外形成大冰晶，通過擠壓對肉制品造成物理損傷，同時蝦仁中脂肪和蛋白質(zhì)的氧化降解破壞了蝦仁肌肉組織原有的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，使得質(zhì)地變軟[25-26]。經(jīng)過1次凍融循環(huán)后，添加4%和6%的EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁硬度顯著高于空白對照組（P＜0.05），添加6%的EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁咀嚼性顯著高于其他處理組（P＜0.05）。經(jīng)過4次凍融循環(huán)后，添加商業(yè)抗凍劑的蝦仁硬度和咀嚼性與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05），添加EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁硬度顯著高于空白對照組和陽性對照組（P＜0.05），添加6%的EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁咀嚼性顯著高于其他處理組（P＜0.05）。這說明在凍融循環(huán)期間，添加商業(yè)抗凍劑不能延緩硬度等指標(biāo)的降低，而添加EWP-β-CD復(fù)合物能維持蝦仁硬度和咀嚼性，其添加量為6%時，對維持蝦仁內(nèi)部肌肉組織結(jié)構(gòu)的作用最好。

表4 不同處理的蝦仁的TPA參數(shù)Table 4 TPA parameters of shrimp with different treatments

2.2.3 蝦仁凍融循環(huán)過程色差測定 色度是衡量蝦仁品質(zhì)的另一項重要指標(biāo)，蝦仁的色度可以直觀地影響消費者的可接受程度[21]。添加不同抗凍劑的蝦仁L*值、a*值、b*值和白度（W）如表5所示。由表可知，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，添加EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁的L*值和W無顯著變化，并且與空白對照組的L*值和W無顯著差異（P＞0.05）；同時凍融3、4次后，添加6%的EWP-β-CD復(fù)合物組蝦仁和空白對照組的蝦仁L*值和W顯著高于陽性對照組的蝦仁（P＜0.05）。由此可知，商業(yè)抗凍劑具有良好的保水作用，但會降低蝦仁的L*值和W，EWP-β-CD復(fù)合物則對蝦仁的色度無顯著影響。

表5 蝦仁白度的變化Table 5 Changes of whiteness of shrimp

2.2.4 蝦仁凍融循環(huán)過程TCA-可溶性肽含量測定

TCA-可溶性肽反映小分子肽的含量，從而反映蛋白質(zhì)在內(nèi)源性組織蛋白酶作用下的水解程度[6]。添加不同抗凍劑的蝦仁TCA-可溶性肽含量變化如圖8所示。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，所有處理組的蝦仁TCA-可溶性肽含量逐漸升高，表明蝦仁中蛋白質(zhì)的降解在不斷進(jìn)行。經(jīng)過1次凍融循環(huán)后，陽性對照組的蝦仁TCA-可溶性肽含量顯著高于空白對照組（P＜0.05），說明商業(yè)抗凍劑蔗糖和山梨糖醇對蝦仁蛋白質(zhì)降解最嚴(yán)重。除了內(nèi)源性蛋白酶不斷分解蛋白質(zhì)的原因外，蔗糖和山梨糖醇的加入為微生物提供適宜的環(huán)境，使得某些細(xì)菌大量生長和繁殖[27]。當(dāng)EWP-β-CD復(fù)合物的添加量為4%和6%時，經(jīng)過4次凍融循環(huán)后TCA-可溶性肽含量仍顯著低于空白對照組和陽性對照組（P＜0.05）。

圖8 蝦仁TCA-可溶性肽含量變化Fig.8 Changes of TCA soluble peptide content in shrimp

2.2.5 蝦仁凍融循環(huán)過程脂肪氧化程度 蝦仁在冷凍和解凍的過程中除了蛋白質(zhì)會發(fā)生氧化降解外，蝦仁中大量的不飽和脂肪酸易被氧化成丙二醛（MDA），其含量與脂肪氧化程度呈正相關(guān)[28]。通常用TBARS值反映脂肪的氧化程度，研究表明若蝦仁的TBARS值在0.2～0.66 mg/kg范圍內(nèi)，則表示品質(zhì)良好，若TBARS值超過1 mg/kg，說明蝦仁已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重的品質(zhì)劣變[29]。添加不同抗凍劑的蝦仁脂肪氧化程度如圖9所示。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，各處理組蝦仁的TBARS值逐漸增大，說明在凍融循環(huán)過程中蝦仁的脂肪發(fā)生了較為嚴(yán)重的氧化。添加2%、4%和6%的EWP-β-CD復(fù)合物和商業(yè)抗凍劑的蝦仁經(jīng)4次凍融循環(huán)后，TBARS顯著低于空白對照組（P＜0.05）。同時，添加EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁脂肪氧化程度顯著低于陽性對照組（P＜0.05），說明EWP-β-CD復(fù)合物抑制脂肪氧化的效果比商業(yè)抗凍劑要好。

圖9 蝦仁脂肪氧化程度的變化Fig.9 Changes of lipid oxidation degree of shrimp

3 結(jié)論

低甜度、低熱量是未來抗凍劑發(fā)展的趨勢。以EWP和β-CD為原料制備新型抗凍劑，以EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性大小為指標(biāo)，通過單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗確定了最佳抗凍活性的EWP-β-CD復(fù)合體系的制備條件：pH為7.0，β-CD與EWP的復(fù)合比為1:10，熱處理溫度75 ℃，此時EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性為84.09%。將EWP-β-CD復(fù)合物按不同濃度應(yīng)用于小龍蝦蝦仁的凍融循環(huán)體系，發(fā)現(xiàn)添加EWP-β-CD復(fù)合物能起到增強(qiáng)蝦仁保水性的作用，當(dāng)添加量為6%時能維持蝦仁硬度和咀嚼性，同時不會影響蝦仁的色度。添加EWP-β-CD復(fù)合物可以在一定程度上抑制蝦仁蛋白質(zhì)的降解和脂肪氧化，當(dāng)EWP-β-CD復(fù)合物的添加量為4%和6%時，其效果明顯優(yōu)于商業(yè)抗凍劑。本研究擴(kuò)大了蛋品和低聚糖的應(yīng)用范圍，為新型抗凍劑的研發(fā)提供一定的試驗基礎(chǔ)，同時改善蝦仁在反復(fù)凍融過程中的品質(zhì)劣變問題。