核桃粕蛋白提取純化工藝優(yōu)化及其功能性質(zhì)分析

代晹鑫，徐 瑩，畢 爽，劉 野

（北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

核桃（Juglans regiaL.）系胡桃科（Juglandaceae）核桃屬植物，有“木本油料之王”的美譽，是世界上最受歡迎的堅果之一[1]。因為核桃有令人滿意的風味、營養(yǎng)和健康特征，有極高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值，而被廣泛食用，有四大干果之首的稱號[2-4]。通常，核桃含有55%～70%的脂肪，其中約70%由多不飽和脂肪酸組成，據(jù)報道，這對于緩解一系列人類疾病和紊亂很重要[5-8]。同時，核桃還可以提供大量的維生素，維生素及多酚等活性物質(zhì)，對人體健康非常有益[9-10]。此外，核桃中含15%～18%的蛋白質(zhì)[11]，主要由球蛋白、醇溶蛋白、清蛋白、谷蛋白組成[12]，分別約占15.67%、4.73%、7.54%、72.06%[13]。

在我國，只有一少部分采摘的核桃未經(jīng)加工直接食用，由于多不飽和脂肪酸的含量極高，大多數(shù)用于榨油，榨油過程消耗的核桃質(zhì)量是其生產(chǎn)油量的兩倍[14]。因此，生產(chǎn)過程中會出現(xiàn)大量部分脫脂的核桃粕，這些核桃粕通常會被丟棄或者用作動物飼料或肥料，使得其未能得到充分的利用[15]。榨油后的核桃粕中蛋白質(zhì)含量可達40%左右，含有18種氨基酸且比例均衡，是一種優(yōu)質(zhì)的天然植物蛋白源[16-17]。核桃蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和優(yōu)質(zhì)抗氧化劑，在我國的利用率還很低。榨油后的核桃粕未得到利用，不僅造成了資源浪費，降低了產(chǎn)業(yè)鏈上下游產(chǎn)品的附加值，而且還對環(huán)境造成污染[18]。

核桃粕蛋白的提取普遍采用堿溶酸沉的方法，該方法操作簡單，成本低[13,19-20]。植物蛋白純化常用方法有膜分離法[21]、離子交換法[22]、酶法[23]等，酶法是當今蛋白純化的常用方法。尤其近年來，糖化酶酶法已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化，利用糖化酶純化蛋白的有效性在鐵核桃蛋白、菜籽蛋白和米糠蛋白中被驗證，效果極佳[24-26]。因此，本研究擬采用糖化酶純化酶法來改性核桃蛋白，提高核桃蛋白純度。

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化核桃粕蛋白的提取與純化工藝，得到核桃粕蛋白提取與優(yōu)化的最佳的工藝條件，并進行相關(guān)性質(zhì)的測定，為核桃粕的開發(fā)利用及后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃粕 實驗室液壓冷榨制備（品種為新二）；糖化酶（酶活105U/g）、十二烷基硫酸鈉 索萊寶試劑有限公司；氫氧化鈉 福晨化學試劑有限公司；鹽酸

國藥集團化學試劑有限公司。

KD-310型自動凱氏定氮儀 瑞典奧普賽斯公司；Alpha 2-4 LD plus型冷凍干燥機 德國Marin Christ 公司；CR22N型臺式離心機 日本日立公司；XHF-DY型高速均質(zhì)分散器 寧波有限公司新芝生物科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃粕基本成分測定 按表1中方法對核桃粕進行基本成分的測定。

表1 核桃粕基本成分測定Table 1 Determination of basic components of walnut meal

1.2.2 核桃粕脫脂粉的制備 參考任嬌艷等[27]和Mao等[28]的方法，將榨油所得的核桃粕放入粉碎機中，進行完全粉碎，采用正己烷對核桃粕進行脫脂處理。料液比1:10 g/mL，攪拌5 h，然后進行抽濾，直至濾液澄清后，置于通風櫥中，揮干溶劑，再進行粉碎，過100目篩，即可得到核桃脫脂粉，置于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 核桃粕蛋白制備工藝 核桃脫脂粉→加入去離子水（1:40，W/V）→調(diào)pH為12→攪拌90 min（55 ℃）→離心（10000×g，15 min，4 ℃）→上清液→調(diào)pH為4.5→攪拌1 h→離心（10000×g，15 min，4 ℃）→沉淀→水洗3次→凍干→加入去離子水（1:40，W/V）→調(diào)pH為4.5→加糖化酶（0.4%）→酶解129 min（53 ℃）→高溫滅酶（90 ℃，10 min）→離心（10000×g，15 min，4 ℃）→沉淀→冷凍干燥→純化后的核桃粕蛋白。

1.2.4 蛋白質(zhì)標準曲線的建立 參考Xue等[29]的方法，配制濃度為100 μg/mL標準牛血清白蛋白溶液，分別向試管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，溶液體積不足1 mL的，補加蒸餾水，固定溶液體積為1 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍G-250，充分混合后室溫下放置5 min，波長595 nm下測得吸光值。以標準蛋白的濃度為橫坐標X，吸光值為縱坐標Y，繪制標準曲線。所制標準曲線的線性回歸方程Y=0.0075X+0.0045，決定系數(shù)R2=0.9995，說明牛血清白蛋白在濃度0～100 μg/mL，線性關(guān)系良好。蛋白提取率采用Bradford法測定，蛋白純度采用凱氏定氮法測定，蛋白提取率和純度的測定及計算公式如下：

1.2.5 核桃粕蛋白提取工藝的優(yōu)化

1.2.5.1 pH對蛋白提取率的影響 稱取2.0 g 核桃粕脫脂粉，加入60 mL超純水，調(diào)節(jié)溶液的pH為8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13， 在30 ℃下浸提60 min。在4 ℃下10000 r/min離心20 min，取上清液采用Bradford法測定提取液中的蛋白質(zhì)含量，得出最佳pH。

1.2.5.2 時間對蛋白提取率的影響 稱取2.0 g核桃粕脫脂粉，加入60 mL超純水，調(diào)節(jié)溶液的pH為11.0，在 30 ℃下浸提30、60、90、120、150、180 min。在4 ℃下10000 r/min離心20 min，取上清液采用Bradford法測定提取液中的蛋白質(zhì)含量，得出最佳時間。

1.2.5.3 料液比對蛋白提取率的影響 稱取2.0 g核桃粕脫脂粉，按料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50加入相應(yīng)體積的超純水，調(diào)節(jié)溶液的pH為11.0，在30 ℃下浸提60 min。在4 ℃下10000 r/min離心20 min，取上清液采用Bradford法測定提取液中的蛋白質(zhì)含量，得出最佳料液比。

1.2.5.4 溫度對蛋白提取率的影響 稱取2.0 g核桃粕脫脂粉，加入60 mL 超純水，調(diào)節(jié)溶液的pH為11.0，分別在30、35、40、45、50、55、60、65 ℃下浸提60 min。然后在4 ℃下10000 r/min 離心20 min，取上清液采用Bradford法測定提取液中的蛋白質(zhì)含量，得出最佳溫度。

1.2.5.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化核桃粕蛋白提取條件

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取pH、溫度、料液比、時間這4個影響因子，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法對提取條件進行響應(yīng)面分析，以蛋白質(zhì)的提取率為響應(yīng)值，確定最佳提取條件，因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平Table 2 Levels and codes of variables chosen for response surface analysis

1.2.6 核桃粕蛋白酸沉點的確定 根據(jù)核桃粕蛋白提取的最佳條件進行實驗，收集上清液。用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液的pH 分別為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，磁力攪拌120 min。在4 ℃下10000 r/min離心20 min，取上清液采用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量，吸光值越低，說明上清液中大部分蛋白沉淀出來，就越接近核桃粕蛋白等電點，即可將吸光值最低點設(shè)置為核桃粕蛋白酸沉點。

1.2.7 核桃粕蛋白純化工藝優(yōu)化

1.2.7.1 pH對蛋白純度的影響 稱取2.0 g核桃粕蛋白，加入80 mL超純水，調(diào)節(jié)溶液的pH為3、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6，控制加酶量為0.1%，50 ℃下，酶解60 min，測定不同pH下蛋白質(zhì)的純度，確定最佳酶解pH。

1.2.7.2 溫度對蛋白純度的影響 稱取2.0 g核桃粕蛋白，加入80 mL超純水，調(diào)節(jié)溶液的pH至4.5，控制加酶量為0.1%，分別在30、35、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0 ℃下，酶解60 min，測定不同酶解溫度下蛋白質(zhì)的純度，確定最佳酶解溫度。

1.2.7.3 時間對蛋白純度的影響 稱取2.0 g核桃粕蛋白，加入80 mL超純水，調(diào)節(jié)溶液的pH至4.5，控制加酶量為0.1%，50 ℃下，分別酶解30、60、90、120、150、180 min，計算不同酶解溫度下蛋白質(zhì)的純度，確定最優(yōu)酶解時間。

1.2.7.4 加酶量對蛋白純度的影響 稱取2.0 g核桃粕蛋白，加入80 mL超純水，調(diào)節(jié)溶液的pH至4.5，分別控制加酶量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，50 ℃下，酶解60 min，計算不同加酶量下蛋白質(zhì)的純度，確定最佳加酶量。

1.2.7.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化核桃粕蛋白純化條件

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取酶解時間、溫度、加酶量這3個影響因子，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法對純化條件進行響應(yīng)面分析，以蛋白質(zhì)純度為響應(yīng)值，確定最佳純化條件。因素與水平見表3。

表3 響應(yīng)面分析因素與水平Table 3 Levels and codes of variables chosen for response surface analysis

1.2.8 核桃粕蛋白性質(zhì)分析

1.2.8.1 核桃粕蛋白溶解性測定 參考Hao等[30]的方法，略改。1 g核桃粕蛋白溶于100 mL超純水，調(diào)節(jié)溶液pH3～12，攪拌30 min，在4 ℃下10000 r/min離心10 min，去除沉淀，收集上清液，用Bradford法測定上清液的蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)的溶解度計算公式如下：

1.2.8.2 核桃粕蛋白吸水性及吸油性測定 參考Sun等[31]的方法，略改。1 g核桃粕蛋白，質(zhì)量記為W0，倒入離心管中，稱量樣品和離心管質(zhì)量記作為W1，加入20 mL超純水（核桃油），振蕩混合30 s，靜置30 min。在4 ℃下10000 r/min離心10 min，去除上清液，倒置1 min去除殘余水分（核桃油），記錄離心后沉淀和離心管質(zhì)量W2。吸水性和吸油性計算公式如下：

式中：W2—離心后沉淀和離心管質(zhì)量，g；W1—樣品和離心管質(zhì)量，g；W0—樣品質(zhì)量，g。

1.2.8.3 核桃粕蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定 參考馬開創(chuàng)[32]的方法，略改。1 g核桃粕蛋白，加入100 mL超純水，調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH3～12，攪拌30 min，高速攪打1 min，迅速轉(zhuǎn)移到量筒中，記錄量筒中溶液和泡沫的總體積V1。在室溫下記錄放置30、60、90 min后量筒中溶液和泡沫總體積V2。起泡性和泡沫穩(wěn)定性計算公式如下：

式中：V1—溶液和泡沫總體積，mL；V2—靜置后溶液和泡沫總體積，mL。

1.2.8.4 核桃粕蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性測定 參考Yan等[33]的方法，略改。稱取0.1 g核桃粕蛋白，加入10 mL超純水，調(diào)節(jié)溶液pH3～12，攪拌30 min，加入5 mL核桃油均質(zhì)1 min，取50 μL液體，加入5 mL的0.1% SDS，混勻，在500 nm處測定吸光度。放置10 min后測定吸光度。乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）的計算公式如下所示：

式中：A0—0 min時吸光值；B—稀釋倍數(shù)（100）；c—待測樣品濃度，mol/L；α為0.01 m光路；β—分散系數(shù)（0.25）；A1—10 min時吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次，取平均值，實驗結(jié)果以用三次數(shù)據(jù)的平均值和標準誤差的形式表示，采用Excel和Origin軟件進行處理分析、制圖，并用SPSS進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃粕基本成分分析

如表4所示，脫脂核桃粕和核桃粕的蛋白含量、脂肪含量、水分含量和灰分含量均有顯著性差異，脫脂核桃粕蛋白含量為51.68%±0.42%，比未進一步脫脂前提高了1.2倍，脂肪含量下降至1.42%±0.62%，水分含量上升至9.18%±0.21%，灰分含量降低至4.32%±0.15%。

表4 核桃粕基本成分Table 4 Basic ingredients of walnut meal

2.2 核桃粕蛋白提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 pH對蛋白提取率的影響 如圖1，隨著pH的升高，蛋白質(zhì)的提取率漸漸升高，當pH上升到pH12的時候，提取率達到71.43%，之后，蛋白質(zhì)的提取率趨于平緩。這是因為在核桃粕蛋白中谷蛋白含量豐富，且谷蛋白不溶于水，溶于堿，在堿性環(huán)境下，隨著pH的升高，核桃粕蛋白溶出量增多，即核桃粕蛋白提取率升高，這與Venkatachalam等[34]研究結(jié)果相似。因此，最佳pH為12。

圖1 pH對核桃粕蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of pH on the extraction rate of walnut meal protein

2.2.2 時間對蛋白提取率的影響 如圖2，核桃粕蛋白提取率隨提取時間的增加逐漸升高，提取時間90 min時，提取率達到69.98%，之后隨著時間的增加，提取率平緩上升。初期，核桃粕中蛋白含量高，溶液中蛋白含量低，隨著時間增加，核桃粕蛋白逐漸從核桃粕中向溶液中轉(zhuǎn)移，一定時間后，溶液中核桃粕蛋白含量達到待飽和狀態(tài)，時間增加，也只能溶解出少量蛋白。因此，最佳提取時間為90 min。

圖2 提取時間對核桃粕蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of walnut meal protein

2.2.3 料液比對蛋白提取率的影響 如圖3，核桃粕蛋白提取率隨料液比增加逐漸增大，當料液比為1:40的時候提取率達到71.81%，之后隨著料液比的增大，核桃粕蛋白提取率升高不明顯。這是因為隨著料液比的增加，使得核桃粕蛋白和溶液的接觸面增大，且在溶液中所能溶解的蛋白含量增多，從而促進了蛋白質(zhì)的溶解[35]。當定量的核桃粕蛋白完全溶出后，增加料液比，也只能溶出少量的蛋白。因此，最佳提取料液比為1:40。

圖3 料液比對核桃粕蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of solid liquid ratio on the extraction rate of walnut meal protein

2.2.4 溫度對蛋白提取率的影響 如圖4，核桃粕蛋白提取率隨著溫度的升高而逐漸增大，當溫度達到55 ℃時核桃粕蛋白提取率為71.88%。超過55 ℃時，隨溫度升高，核桃粕蛋白提取率逐漸減小。這是因為隨著溫度的升高，蛋白的空間構(gòu)型發(fā)生改變，有助于其與水的相互作用，加快核桃粕中蛋白向溶液中轉(zhuǎn)移，從而促進蛋白質(zhì)的溶解，當溫度升到一定值時，高溫使得部分蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)的溶解少[36]。因此，最佳提取溫度為55 ℃。

圖4 溫度對核桃粕蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of temperatures on the extraction rate of walnut meal protein

2.2.5 響應(yīng)面分析 Box-Behnken 設(shè)計的四因素三水平的響應(yīng)面試驗，以pH（A）、溫度（B）、料液比（C）、時間（D）為自變量，其方案和結(jié)果響應(yīng)面試驗結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 響應(yīng)面設(shè)計方案及實驗結(jié)果Table 5 Design scheme and result of response surface test

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance in regression model

利用Design-Expert8.0 進行二次多元回歸擬合，可得pH（A）、溫度（B）、料液比（C）以及時間（D）與響應(yīng)值為蛋白提取率（Y）的關(guān)系。Y=81.09+3.90A-0.3B-0.34C+0.17D+1.18AB+0.59AC-0.32AD-0.1BC+0.6BD+0.22CD-4.69A2-4.39B2-4.62C2-6.44D2，其中，R2=0.9870，R2Adj=0.9740。對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果回歸模型顯著，失擬檢驗不顯著，實驗誤差小，故可用該模型對核桃粕蛋白提取率進行分析與預(yù)測。根據(jù)回歸方程，為了更好地分析pH（A）、溫度（B）、料液比（C）以及時間（D）對響應(yīng)值提取率（Y）的影響，作響應(yīng)面圖，考察響應(yīng)曲面的形狀（見圖5～圖10）。

圖5 pH和溫度交互作用的曲面圖Fig.5 Surface plot of the interaction between pH and temperature

圖10 料液比和時間交互作用的曲面圖Fig.10 Surface plot of the interaction between solid liquid ratio and time

圖6 pH和料液比交互作用的曲面圖Fig.6 Surface plot of the interaction between pH and solid liquid ratio

圖7 pH和時間交互作用的曲面圖Fig.7 Surface plot of the interaction between pH and time

用Design-Expert8.0.6軟件分析得到的核桃粕蛋白提取的最佳工藝條件為：pH12，溫度55 ℃，時間90 min，料液比1:40 g/mL，為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，在此工藝條件下進行5次重復(fù)驗證試驗，實際測得核桃粕蛋白提取率的平均值為81.89%±1.64%，比預(yù)測值相差1.81%，預(yù)測值與實際值基本相符。因此實驗所得的最佳提取工藝參數(shù)可靠。此時核桃蛋白含量為80.68%±0.46%，為得到高純度的核桃粕蛋白需進行純化，故采用糖化酶進行酶解純化，進一步提高蛋白純度。

2.3 核桃粕蛋白等電點的確定

圖8 溫度和料液比交互作用的曲面圖Fig.8 Surface plot of the interaction between the temperature and solid liquid ratio

圖9 溫度和時間交互作用的曲面圖Fig.9 Surface plot of the interaction between temperature and time

見圖11，可以看出，在pH4～5之間，上清液的吸光值都較低，核桃堿溶蛋白的酸沉量是比較大的。在pH4.5下上清液的吸光值最低，所以說明大部分核桃粕蛋白可以在pH4.5下沉淀下來，即將pH4.5作為核桃粕蛋白等電點，這一結(jié)果和姜莉[37]的研究結(jié)果一致。

圖11 核桃粕蛋白的等電點的測定Fig.11 Walnut meal protein isoelectric point determination

2.4 核桃粕蛋白純化工藝的優(yōu)化

2.4.1 pH對蛋白純度的影響 如圖12，核桃粕蛋白純度隨著pH的升高先增加后降低，在pH4.5時純度達到86.70%。因為過高過低的pH會導致糖化酶的酶活下降，酶與底物的結(jié)合差。從結(jié)果上看就是蛋白純度低，所以最佳純化pH為4.5。

圖12 pH對核桃粕蛋白純度的影響Fig.12 Effect of pH on the purity of walnut meal protein

2.4.2 溫度對蛋白純度的影響 如圖13，核桃粕蛋白純度隨著酶解溫度的升高先增加后降低，在50 ℃時純度為86.29%。由于低溫會抑制糖化酶的酶活，高溫會導致糖化酶部分變性失活，導致酶解能力下降，從而造成蛋白純度下降[38]。所以最佳酶解溫度為50 ℃。

圖13 溫度對核桃粕蛋白純度的影響Fig.13 Effect of temperatures on the purity of walnut meal protein

2.4.3 時間對蛋白純度的影響 如圖14，核桃粕蛋白純度隨著酶解時間的增加而提高，而后保持平穩(wěn)，在120 min時純度為91.23%。隨著酶解時間增加，糖化酶反應(yīng)地越徹底，一段時間后，反應(yīng)達到平衡，即核桃粕蛋白純度保持穩(wěn)定，所以最佳酶解時間為120 min。

圖14 酶解時間對核桃粕蛋白純度的影響Fig.14 Effect of enzymatic hydrolysis time on the purity of walnut meal protein

2.4.4 加酶量對蛋白純度的影響 如圖15，核桃粕蛋白純度隨著加酶量的增加而提高，而純度提高的不明顯，在加酶量為0.3%時純度為89.11%。隨著加酶量的加大，糖化酶反應(yīng)越快，當加酶量為0.5%時，反應(yīng)速率達到最大值為89.91%，綜合經(jīng)濟效益考慮，最佳加酶量為0.3%。

圖15 加酶量對核桃粕蛋白純度的影響Fig.15 Effect of enzyme dosage on the purity of walnut meal protein

2.4.5 響應(yīng)面分析 Box-Behnken 設(shè)計的三因素三水平的響應(yīng)面試驗，以時間（A）、溫度（B）、加酶量（C）為自變量，其方案和結(jié)果響應(yīng)面試驗結(jié)果見表7，方差分析見表8。

表7 響應(yīng)面設(shè)計方案及實驗結(jié)果Table 7 Design scheme and result of response surface test

表8 回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance in regression model

利用Design-Expert8.0 進行二次多元回歸擬合，可得時間（A）、溫度（B）及加酶量（C）與響應(yīng)值純度（Y）的關(guān)系。方程為： Y=93.66+0.72A+1.82B+0.34C-0.17AB-0.025AC+0.045BC-1.03A2-1.67B2-0.089C2，其中R2=0.9881，R2Adj=0.9729。對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果顯示，回歸模型顯著，失擬檢驗不顯著，實驗誤差小，故可用該模型對核桃粕蛋白純度進行分析與預(yù)測。

根據(jù)回歸方程，為了更好地分析時間（A）、溫度（B）及加酶量（C）對響應(yīng)值純度（Y）的影響，作響應(yīng)面圖，考察響應(yīng)曲面的形狀（見圖16～圖18）。

圖16 時間和溫度交互作用的曲面圖Fig.16 Surface plot of the interaction between temperature and time

圖17 時間和加酶量交互作用的曲面圖Fig.17 Surface plot of the interaction between time and enzyme dosage

圖18 溫度和加酶量交互作用的曲面圖Fig.18 Surface plot of the interaction between temperature and enzyme dosage

用Design-Expert8.0.6軟件分析得到核桃粕蛋白純化的最佳工藝條件為：pH4.5，料液比1:40 g/mL，酶解時間129 min，酶解溫度53 ℃，加酶量0.4%。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，在此工藝條件下進行5次重復(fù)驗證試驗，實際測得蛋白純度的平均值為94.48%±1.83%，比預(yù)測值相差1.45%，預(yù)測值與實際值基本相符。因此實驗所得的最佳純化工藝參數(shù)可靠。

2.5 核桃粕蛋白性質(zhì)分析

2.5.1 核桃粕蛋白溶解性 不同pH下兩種核桃粕蛋白溶解性變化如圖19，兩種核桃粕蛋白在pH4.5時溶解性最低，為3.14%，4.9%，因為pH4.5是核桃粕蛋白的等電點，在pH4.5處，蛋白的凈電荷是0，蛋白分子之間無靜電斥力，蛋白聚集，造成其溶解性低。當pH偏離4.5時，溶解度增大，且在堿性環(huán)境下純化前后核桃粕蛋白的溶解度具有顯著性差異（P＜0.05）， pH7時，溶解度分別為16.47%、24.82%，pH12時，溶解度最高，分別為75.93%、86.53%，因為遠離等電點時，靜電斥力增加，有利于親水基團分布在表面，因此溶解性提高[39]。純化后的核桃粕蛋白的溶解度始終更高，這說明經(jīng)過純化后，核桃粕蛋白的溶解度得到了改善。

圖19 pH對核桃粕蛋白溶解度的影響Fig.19 Effect of pH on the solubility of walnut meal protein

2.5.2 核桃粕蛋白吸水性及吸油性 兩種的吸水性及吸油性如圖20，純化前后核桃粕蛋白的吸水性和吸油性具有顯著性差異（P＜0.05），純化前后核桃粕蛋白的吸水性分別為2.73、3.06 g/g，純化前后核桃粕蛋白吸油性分別為2.90、3.15 g/g。這說明純化后的核桃粕蛋白的吸水性和吸油性有所提高。

圖20 核桃粕蛋白的吸水性和吸油性Fig.20 Water and oil absorption of walnut meal protein

2.5.3 核桃粕蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性 pH對核桃粕蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響如圖21，核桃粕蛋白的起泡性隨pH升高，先減少后增大，在pH4.5，純化前和純化后的核桃粕蛋白的起泡性最差，分別為5.63%、8.36%。偏離pH4.5，起泡性逐漸提高，pH7時，其起泡性分別為25.51%、30.53%。因為當?shù)鞍灼x等電點時，帶電數(shù)增多，蛋白質(zhì)分子之間相互排斥，而蛋白質(zhì)與水的相互作用增強，造成了溶解性變大，有助于泡沫的形成[40]。pH12時，核桃粕蛋白起泡性有最大值，分別為38.98%、51.76%。

圖21 pH對核桃粕蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響Fig.21 Effect of pH on the foamability and foaming stability of walnut meal protein

30 min后，在pH4.5下核桃粕蛋白的泡沫穩(wěn)定性良好，遠離pH4.5時，其泡沫穩(wěn)定性變差，pH7時其起泡穩(wěn)定性分別為73.28%、75.44%，pH12時其泡沫最不穩(wěn)定。這是因為遠離等電點，蛋白質(zhì)分子間的相互作用減弱，影響了泡沫蛋白膜的壓力，導致泡沫體系失穩(wěn)[41]。且隨靜置時間的增加，核桃粕蛋白的泡沫穩(wěn)定性持續(xù)下降，因為隨時間的增加，核桃粕蛋白溶解的量變多，減少了蛋白質(zhì)分子間相互作用，造成了其泡沫穩(wěn)定性變差。在同一條件下，核桃粕蛋白在純化后的起泡性和泡沫穩(wěn)定性顯著大于純化前（P＜0.05）。因為蛋白質(zhì)純度有所增加，純度較高的蛋白質(zhì)更易形成多層且強度大的蛋白膜，可承受更大的壓力，同時也增大體系的黏度。因此，核桃粕蛋白經(jīng)過純化后，其起泡性和泡沫穩(wěn)定性得到顯著性改善。

2.5.4 核桃粕蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性 pH對核桃粕蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖22所示，隨pH增大，核桃粕蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性的變化在圖中表現(xiàn)為的“V”型，即先降低后增大與其溶解性變化的趨勢相似。核桃粕蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性在pH4.5處最差，純化前的核桃粕蛋白的乳化性為2.44 m2/g，乳化穩(wěn)定性為14.33 min。純化后的核桃粕蛋白的乳化性為3.85 m2/g，乳化穩(wěn)定性為19.95 min。pH7時其純化前后乳化性分別為10.00、16.10 m2/g。乳化穩(wěn)定性分別為33.31、38.87 min。在pH12時核桃粕蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性最好，未純化核桃粕蛋白的乳化性為57.82 m2/g，乳化穩(wěn)定性為54.97 min。純化后的核桃粕蛋白的乳化性為66.66 m2/g，乳化穩(wěn)定性為59.19 min。這是因為，蛋白質(zhì)中含有脂溶性殘基和水溶性殘基，在O/W的界面中，脂溶性殘基朝向油相，水溶性殘基朝向水相，進而減少了界面的表面張力[42]。

圖22 pH對核桃粕蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.22 Effects of pH on the emulsification and emulsification stability of walnut meal protein

在pH4.5時，核桃粕蛋白溶解性小，導致存在過高的表面疏水性，影響蛋白質(zhì)在油滴表面的排列[43]，吸附在O/W界面上的蛋白少，O/W界面張力大，從而導致乳化性差。當核桃粕蛋白溶解性升高，其在O/W界面上接觸面變大，吸附在O/W界面上的蛋白增多，促進了油相和水相的相互作用，O/W界面張力小，乳化性好。乳化穩(wěn)定性是指的是乳液在不發(fā)生聚結(jié)、絮凝和乳狀化的情況下保持分散的能力。由于蛋白在向等電點靠近時，其靜電斥力不斷降低，影響油滴顆粒的穩(wěn)定排列，使油滴容易聚結(jié)或聚集，導致乳化穩(wěn)定性下降[44]。在同一條件下，未純化的核桃粕蛋白和純化后的核桃粕蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性有顯著差異（P＜0.05），經(jīng)過純化的核桃粕蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性得到了提高。

3 結(jié)論

以核桃粕作為實驗原料，利用堿溶酸沉法和酶解法制備純度高的核桃粕蛋白。通過響應(yīng)面法優(yōu)化并驗證得到了最佳提取工藝條件為pH12，溫度55 ℃，時間90 min，料液比1:40 g/mL，且它的沉降點是pH4.5。在此條件下，核桃粕蛋白的提取率可達到81.89%±1.64%。利用糖化酶純化核桃粕蛋白以提高蛋白純度，通過響應(yīng)面法優(yōu)化并驗證得到最佳純化工藝條件為pH4.5，料液比1:40 g/mL，酶解時間128 min，酶解溫度53 ℃，加酶量0.4%。經(jīng)此條件純化的核桃粕蛋白的純度可達到94.48%±1.83%。經(jīng)過糖化酶純化的核桃粕蛋白的純度得到提高，達到了分離蛋白的標準。通過比較純化前后的兩種核桃粕蛋白的性質(zhì)，純化后的核桃粕蛋白的溶解性及乳化穩(wěn)定性均得到顯著性提高，特別是在中性條件下，其溶解度為24.82%，吸水性為3.06 g/g，吸油性為3.15 g/g，乳化性為16.10 m2/g，乳化穩(wěn)定性為38.87 min，起泡性為30.53%，起泡穩(wěn)定性為75.44%。本文僅對核桃蛋白的提取純化條件及簡單的功能性質(zhì)進行了研究，該方法對于核桃蛋白其他性質(zhì)的影響尚需進一步的研究。希望本研究可以為核桃粕蛋白的高值化利用提供一定的技術(shù)參考價值和借鑒。