擠壓組織化對芝麻蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響

黃紀(jì)念，孫 強, ，張富重，宋國輝，張國治

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南鄭州 450002；2.河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南鄭州 450002；3.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001）

蛋白質(zhì)是人類生存必需的營養(yǎng)物質(zhì)，人們每天攝入的蛋白質(zhì)主要為動物性蛋白和植物性蛋白兩大類[1]。隨著社會的不斷進步，人們對健康飲食的要求越來越高。從口感上來說，動物性蛋白是植物性蛋白所不能比擬的[2-5]，這是植物性蛋白無法取代動物性蛋白的問題所在。但動物蛋白中含有大量的膽固醇，食用過多會影響機體健康，不僅會引起“三高”和肥胖等疾病，還易造成飲食結(jié)構(gòu)紊亂等危害。據(jù)Kumer等[2]統(tǒng)計，生產(chǎn)動物肉類需消耗接近其七倍的植物資源，以及非常多的水資源，環(huán)境資源壓力大。植物蛋白擠壓組織化為解決這些問題提供了可行的方案[6]。植物組織化蛋白是一種具有纖維結(jié)構(gòu)和類似動物蛋白口感的高蛋白產(chǎn)品，在食品加工中可以替代部分動物蛋白，以此達到降低食品中脂肪和膽固醇含量的目的[7-8]。Samard等[9]研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白擠壓組織化后在咀嚼性、氮溶解度和剪切力等方面接近于真實的雞肉。目前市場上的植物組織化蛋白主要以大豆蛋白、小麥蛋白和花生蛋白為主，關(guān)于芝麻蛋白的未見有相關(guān)報道。

擠壓組織化是一個短時處理的過程，蛋白原料在此期間受到高溫、高壓和高剪切力的作用，原料中蛋白質(zhì)會發(fā)生變性，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變，進一步影響其理化性質(zhì)[10-11]。原料水分含量的高低直接影響組織化程度，一般把原料水分含量在40%～80%的擠壓過程叫作高水分?jǐn)D壓，也是生產(chǎn)替代動物蛋白的植物蛋白擠壓組織化的主要方式[12]。本實驗以利用亞臨界萃取方法脫除油脂而得到的亞臨界芝麻蛋白粉為主要原料，利用雙螺桿擠壓技術(shù)，生產(chǎn)組織化蛋白，并對擠壓組織化前后蛋白原料的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進行了研究，分析擠壓組織化對蛋白原料理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響，探究其組織化形成機理，為以后的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞臨界芝麻蛋白粉 自制；谷朊粉 中紡匯澤生物科技有限公司；胃蛋白酶（酶活≥250 U·mg-1）、胰蛋白酶（酶活1:250） 北京索萊寶科技有限公司；5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、鹽酸胍、Tris Sigma公司；硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醚 分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸、無水乙醇 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

CLEXTRAL Ev025型雙螺桿擠壓機 法國克萊斯特羅集團公司；CEB-5L亞臨界流體萃取設(shè)備河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司；K-1100型全自動凱氏定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司；S433D型氨基酸分析儀 德國SYKNM公司；JSM-5310型掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；UV-2802型紫外可見分光光度計 梅特勒托利多儀器有限公司；is5型傅里葉紅外光譜 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞臨界芝麻蛋白粉的制備 參照劉日斌[13]的亞臨界芝麻粕的制備工藝并稍加修改，具體工藝為：萃取溫度50 ℃，萃取時間40 min，料液比1:1.5（萃取溶劑為丙烷），萃取次數(shù)5次，將得到的亞臨界芝麻粕進行粉碎過80目篩即得到亞臨界芝麻蛋白粉。

1.2.2 原料理化性質(zhì)的測定 水分的測定：GB 5009.3-2016；灰分的測定：GB 5009.4-2016；粗蛋白含量的測定：GB 5009.5-2016；粗脂肪含量的測定：GB 5009.6-2016；粗纖維含量的測定：GB/T 5009.10-2003；NSI的測定：AACC 46-23。

1.2.3 擠壓組織化實驗的設(shè)計 將亞臨界芝麻蛋白粉與谷朊粉以7:3的比例混合，利用雙螺桿擠壓機參照擠壓組織化工藝：喂料速度2 kg/h，擠壓溫度160 ℃，水分含量65%，螺桿轉(zhuǎn)速190 r/min進行組織化蛋白的生產(chǎn)。

1.2.4 持水性的測定 將樣品冷凍干燥，粉碎過篩后，參考薛曉程等[14]的方法進行持水性測定。稱取3.0 g左右樣品，倒入到離心管中，加入18 mL蒸餾水，混合均勻后，靜置0.5 h，然后離心，將上清液倒掉，最后稱重。

式中：m1為樣品質(zhì)量，g；m2為離心管質(zhì)量，g；m3為稱重的質(zhì)量，g。

1.2.5 吸油性的測定 將樣品冷凍干燥，粉碎過篩后，參考Li等[15]的吸油性測定方法進行測定，并稍作修改。稱取0.3 g左右的樣品，倒入到離心管中，加入5 mL芝麻油，混合均勻后，靜置0.5 h后，離心處理，將上清液倒掉，最后稱重。公式為：

式中：a為樣品質(zhì)量，g；b為離心管質(zhì)量，g；c為離心去上清后離心管的總質(zhì)量，g。

1.2.6 蛋白質(zhì)消化率的測定 樣品經(jīng)冷凍干燥，粉碎處理后，參考劉文華等[16]的蛋白消化率的測定方法進行測定。準(zhǔn)確稱量1.00 g樣品加入到250 mL錐形瓶中，加入pH為1.5的鹽酸80 mL配成溶液，設(shè)置空白組。加入0.01 g胃蛋白酶于39 ℃下在水浴恒溫振蕩器中酶解3 h，然后調(diào)節(jié)溶液pH為6.8，加入0.5 g的胰蛋白酶相同條件下酶解3 h，最后離心處理得到上清液。蛋白含量利用全自動凱氏定氮儀進行測定。

目前，在人體中一共發(fā)現(xiàn)了22種炎癥體[26]，常見的包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP10和NLRP12等[27]。不同類型的NLRPs的激活組裝形式不盡相同，所起到作用也不盡相同。

式中：n1為消化后上清液的蛋白含量；n2為樣品粗蛋白含量。

1.2.7 游離巰基的測定 樣品經(jīng)冷凍干燥，粉碎過篩處理后參考Fischert[17]的游離巰基含量測定方法進行測定。首先取240 mg左右的樣品于離心管中，然后取10 mL 5 mol/L，pH8.0的鹽酸胍/Tris-Gly溶液加到離心管中，混合攪拌后離心，然后在上清液中各取3 mL于燒杯中，一個燒杯中加入5 mL鹽酸胍/Tris-Gly溶液，另一個燒杯中加入1.5 mL 1×10-3mol/L DTNB，混合均勻后在水浴加熱處理0.5 h，最后在412 nm處測定吸光值，以不加DTNB的為對照組。

式中：73.53=106/13600（13600為Elman試劑與巰基反應(yīng)生成物5-硫代-2-硝基苯甲酸（鹽）陰離子的摩爾消光系數(shù)，單位為L/mol系數(shù)；106為L/mol換算為L/μmol的倍數(shù)）；D為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)濃度（g/L）。

1.2.8 氨基酸含量的測定 參照GB 5009.124-2016方法進行測定

1.2.9 蛋白質(zhì)溶解度的測定 參照Prudencio-Ferreira等[18]的方法，通過蛋白質(zhì)溶解度的變化來觀察蛋白質(zhì)中化學(xué)鍵的變化。

浸提溶液：A溶液為pH7.6，0.035 mol/L磷酸鹽緩沖液，B溶液為pH7.6，A+0.015 g/mL SDS，C溶液為pH7.6，A+2% 2-巰基乙醇，D溶液為A+pH7.6，0.015 g/mL SDS+2% 2-巰基乙醇。

蛋白浸提步驟：參考馬寧等[19]的操作方法。各取0.5 g樣品于離心管中，分別加入適量的A、B、C、D溶液，在室溫下，振蕩提取120 min，然后離心，取上清液。對所得沉淀重復(fù)上述操作，最后將兩次上清液混到一塊，定容到50 mL，得到便是蛋白質(zhì)浸提溶液。蛋白質(zhì)溶解度為上清液中蛋白質(zhì)含量與總蛋白含量之比。

a.溶于A溶液中的為可溶性蛋白質(zhì)；

b.溶于B溶液中的蛋白減去溶于A溶液中的蛋白為以非共價鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)；

c.溶于C溶液中的蛋白減去溶于A溶液中的蛋白為以共價鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)；

d.溶于D溶液中的蛋白與溶于A溶液中的蛋白之和減去溶于B溶液和C溶液之和得到為以非共價鍵與二硫鍵交互作用結(jié)合的蛋白質(zhì)。

1.2.10 熱分解特性的測定 稱取少量冷凍干燥后的粉末于鋁盤中，放入熱重分析儀中進行測定。測定條件為：以10 ℃/min的速率從室溫開始加熱到600 ℃，在此過程中，N2以50 mL/min的流速做為保護氣。

1.2.11 傅里葉紅外光譜測定 樣品經(jīng)過冷凍干燥處理后，粉粹過篩，取1 mg樣品與200 mg KBr粉末混合，充分研磨，在15 kg壓力下壓制成薄片。在波數(shù)范圍為4000～400 cm-1內(nèi)進行掃描。

掃描圖譜的處理：測定樣品前先測定空白背景，然后把酰胺I帶分離出來，利用Excel 2016和Origin 2018對其進行去卷積、二階導(dǎo)數(shù)和譜帶擬合處理，不同子峰的面積代表不同的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.12 微觀結(jié)構(gòu)的測定 參照Dekkers等[21]方法將樣品切成5 mm×5 mm×5 mm的塊狀，用4%的戊二醛浸泡，在4 ℃的環(huán)境中固定樣品24 h，之后使用0.1 mol/L，pH為8的磷酸鹽緩沖液沖洗，再分別用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進行脫水處理，脫水后用真空冷凍機干燥，之后進行粘樣，抽真空，最后在掃描電鏡下觀察微觀結(jié)構(gòu)的變化，并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗平行測定3次，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。采用SPSS 25.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，利用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料的基本性質(zhì)

擠壓組織化對蛋白原料要求比較嚴(yán)格，一般要求脂肪含量低于5%，粗纖維含量小于7%。亞臨界芝麻蛋白粉和谷朊粉的脂肪含量為2.26%和2.11%，粗纖維含量為3.90%和0.62%，均符合要求。主要理化指標(biāo)含量見表1。

表1 蛋白粉的基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physicochemical indexes of protein powder

2.2 擠壓組織化對蛋白原料理化特性的影響

從表2可以看出擠壓組織化對原料的持水性、吸油性、蛋白質(zhì)消化率和游離巰基含量都有一定程度的影響。擠壓后的蛋白原料持水性增加了14.16%，吸油性減少了14.52%，原因可能是擠壓組織化后，原料蛋白質(zhì)發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)改變，更多親水氨基酸暴露出來，同時結(jié)構(gòu)重排形成纖維結(jié)構(gòu)，變得相對稀松，導(dǎo)致持水性增大、吸油性下降。蛋白質(zhì)消化率相對于擠壓前增加了11.18%，原因可能是原料中蛋白質(zhì)在擠壓組織化過程中發(fā)生變性，空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子內(nèi)部的氨基酸殘基暴露出來和組織化蛋白獨特的稀松的結(jié)構(gòu)，增大了與蛋白酶的接觸面積，導(dǎo)致蛋白消化率增大。擠壓后的游離巰基含量相對于擠壓前的減少了11.55%，原因可能是在擠壓組織化過程中，蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸和游離巰基在高溫、高剪切力、高壓條件下發(fā)生熱分解生成噻唑類、噻吩類、乙醛等含硫化合物，損失了一部分[22]，或者是氧化生成二硫鍵造成的。

表2 蛋白原料擠壓前后持水性、吸油性、消化率和游離巰基含量的變化Table 2 Changes of water holding capacity, oil absorption,digestibility and free sulfhydryl content of protein materials before and after extrusion

2.3 擠壓組織化對蛋白原料氮溶解指數(shù)的影響

2.3.1 水分含量對蛋白原料的氮溶解指數(shù)的影響從圖1可以看出隨著水分含量的增加，氮溶解指數(shù)先減少再增加然后又降低。在水分含量為50%時最大為14.4%，在水分含量為60%時最小為10.63%。在水分含量為65%時略有上升。原因可能是在擠壓過程中水分參與蛋白組織化過程中的化學(xué)反應(yīng)并影響擠壓機內(nèi)的壓力和溫度，從而影響蛋白的組織化程度，隨著水分含量的增加，一方面蛋白伸展變性程度增加，天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)明顯減少，另一方面組織化程度逐漸升高[23-24]，水分含量為60%時蛋白伸展變性程度最大，氮溶解指數(shù)最低；水分含量為65%時，組織化程度達到最大，纖維結(jié)構(gòu)最多，原有結(jié)構(gòu)變化最大，氨基酸殘基解離出來較多，造成了氮溶解指數(shù)有所升高。繼續(xù)增加水分則稀釋弱化了組織化結(jié)構(gòu)的形成，使得氮溶解指數(shù)降低。

圖1 不同水分含量對蛋白原料的氮溶解指數(shù)的影響Fig.1 Effect of different moisture content on the nitrogen solubility index of protein raw materials

2.3.2 擠壓溫度對蛋白原料的氮溶解指數(shù)的影響溫度是影響組織化蛋白產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵因素，組織化的形成是以蛋白質(zhì)變性為前提的。從圖2可以看出氮溶解指數(shù)隨著擠壓溫度的升高，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。在130 ℃時氮溶解指數(shù)降到最低，說明此時蛋白質(zhì)變性程度最大，但由于需要更高的溫度來斷裂蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵并進行定向排列形成蛋白組織化，然后隨著擠壓溫度的升高，擠壓產(chǎn)品組織化程度逐漸加強，解離出來一些小分子物質(zhì)或氨基酸殘基增多，造成了氮溶解指數(shù)逐漸增大。

圖2 不同擠壓溫度對蛋白原料的氮溶解指數(shù)的影響Fig.2 Effect of different extrusion temperatures on the nitrogen solubility index of protein materials

2.3.3 螺桿轉(zhuǎn)速對蛋白原料的氮溶解指數(shù)的影響螺桿轉(zhuǎn)速對擠壓組織化有兩方面的影響，一是隨著螺桿轉(zhuǎn)速的升高，剪切強度逐漸增大，蛋白質(zhì)變性程度會升高；二是螺桿轉(zhuǎn)速的升高縮短了物料滯留時間，蛋白質(zhì)變性的時間也相應(yīng)地縮短，從而導(dǎo)致變性程度降低。從圖3可以看出氮溶解指數(shù)隨著螺桿轉(zhuǎn)速的增大，先降低后增大。在190 r/min時降到最低，然后再增加其螺桿轉(zhuǎn)速，氮溶解指數(shù)隨之上升。說明螺桿轉(zhuǎn)速在180～190 r/min階段剪切強度對蛋白質(zhì)變性程度的影響占主導(dǎo)地位，繼續(xù)增大螺桿轉(zhuǎn)速物料滯留時間對蛋白質(zhì)變性程度的影響逐漸占主導(dǎo)地位，物料在機筒中受到溫度、壓力和剪切力的作用時間變短，從而使變性程度減輕，氮溶解指數(shù)有所回升。

圖3 不同螺桿轉(zhuǎn)速對蛋白原料的氮溶解指數(shù)的影響Fig.3 Effect of different screw speeds on the nitrogen solubility index of protein materials

2.4 擠壓組織化對蛋白原料的氨基酸含量的影響

從表3可以看出人體必需的8種氨基酸，谷朊粉大部分都比芝麻蛋白中的含量高，所以在芝麻蛋白粉擠壓組織化研究中加入一定量的谷朊粉，可以提高組織化蛋白產(chǎn)品的氨基酸含量和營養(yǎng)價值，同時還可以改善產(chǎn)品的品質(zhì)。

表3 擠壓前后各氨基酸的組分含量Table 3 Content of each amino acid before and after extrusion

本實驗得到的是樣品中氨基酸總含量。從表3中可以看出擠壓組織化后氨基酸各組分含量與擠壓組織化前相比都有不同程度的減少，除了賴氨酸和丙氨酸損失率在1%以下，其他氨基酸組分含量損失率均超過1%。其中損失較多的氨基酸為脯氨酸、酪氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等。雖然在擠壓組織化過程，氨基酸各組分因高溫、高剪切力、高壓作用，參與美拉德、氧化、熱分解等反應(yīng)生成各類揮發(fā)性物質(zhì)，導(dǎo)致含量有所減少，但是與其他加工方式相比，由于它加工時間短，水分含量高，氨基酸含量損失會相對較低。

2.5 擠壓組織化對化學(xué)交聯(lián)鍵變化的影響

共價鍵和非共價鍵是構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要作用力。常見的共價鍵有二硫鍵，非共價鍵有氫鍵、離子鍵、靜電作用等。二硫鍵和非共價鍵極易被2-巰基乙醇溶液和十二烷基硫酸鈉溶液破壞。因此可以根據(jù)蛋白質(zhì)在不同溶劑中的溶解度的變化，來分析擠壓組織化前后蛋白質(zhì)中化學(xué)鍵的變化情況[25]。

從表4可以看出擠壓前蛋白在B（SDS）溶液、C（2-ME）溶液和D（SDS+2-ME）溶液中的溶解度都比在A（磷酸鹽緩沖液）液中大，表明在磷酸鹽緩沖液中加入SDS和2-ME后蛋白質(zhì)溶解度會增大，并在D（SDS+2-ME）溶液中溶解度達到最大。說明二硫鍵和非共價鍵之間的交互作用對復(fù)配蛋白的結(jié)構(gòu)影響很明顯。擠壓后相對于擠壓前在不同溶劑中的溶解度都有所下降，且在B（SDS）溶液中變化最大，溶解度由擠壓前的31.42%下降到擠壓后的14.59%，降低了53.56%，說明在擠壓組織化過程中蛋白的非共價鍵遭到的破壞最大。

表4 蛋白擠壓組織化前后溶解度的變化Table 4 Changes in solubility of protein before and after extrusion

如表5所示，為了更加清楚的了解化學(xué)鍵對蛋白質(zhì)溶解度的影響，根據(jù)Kitabake等[20]的方法將樣品在不同浸提液中的溶解度轉(zhuǎn)換為化學(xué)鍵的形式。

從表5可以看出擠壓前后的蛋白都是主要通過二硫鍵和非共價鍵兩者相互作用共同維持其結(jié)構(gòu)，除此之外還有其他方式參與維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。擠壓前蛋白以非共價鍵單獨作用的力占到21%，是除了二硫鍵與非共價鍵互相作用外最多，以二硫鍵單獨作用的最少，而擠壓后蛋白是天然狀態(tài)下最大，占到8.03%，最小的與擠壓前蛋白一樣，占到3.86%。將擠壓前后進行對比發(fā)現(xiàn)，以二硫鍵作用的，減少了27.03%，非共價鍵作用的減少了68.76%，而以二硫鍵和非共價鍵交互作用的增加了32.6%，說明在擠壓組織化對非共價鍵的破壞比較大，二硫鍵雖然單獨看時有所減少，但結(jié)合二硫鍵和非共價鍵交互作用增加的量來看，還是有生成的。綜上所述非共價鍵與二硫鍵的交互作用是維持組織化蛋白的結(jié)構(gòu)的主要作用力。

表5 不同結(jié)合狀態(tài)蛋白擠壓組織化前后溶解性變化Table 5 Solubility changes of proteins in different binding states before and after extrusion

2.6 熱分解特性的研究

從圖4可看出擠壓組織化前后蛋白原料在室溫～600 ℃之間都發(fā)生了3次熱分解反應(yīng)，第一次熱分解反應(yīng)的峰值出現(xiàn)在50～100 ℃之間，第二次熱分解反應(yīng)的峰值出現(xiàn)在250～350 ℃之間，第三次熱分解反應(yīng)峰值出現(xiàn)在450～500 ℃之間。熱分解速率曲線中一般應(yīng)該有四個主要的熱分解反應(yīng)峰，原料中的水分蒸發(fā)會造成第一次熱分解峰的出現(xiàn)，一般不做研究，增塑劑的分解會造成第二次熱分解峰的出現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子的化學(xué)鍵如S-S發(fā)生斷裂會導(dǎo)致第三次熱分解峰的出現(xiàn)，蛋白質(zhì)完全分解會造成第四次熱分解峰的出現(xiàn)[26]。本實驗中少了位于110～250 ℃的熱反應(yīng)峰，可能是原料中油脂含量過少，變化不明顯。

圖4 蛋白擠壓組織化前后的失重曲線和失重速率曲線Fig.4 Weight loss curve and weight loss rate curve before and after protein extrusion and organization

從圖4還可看出在250～350 ℃之間出現(xiàn)的峰值中擠壓前后蛋白原料的分解溫度相差不大，但失重速率擠壓后蛋白原料明顯比擠壓前的快，從450～500 ℃之間出現(xiàn)的峰值可以看出兩者的失重速率大小相差不大，但擠壓后蛋白的分解溫度明顯低于擠壓前蛋白的分解溫度。所以可以得到擠壓組織化處理會降低蛋白原料的熱穩(wěn)定性。

2.7 傅里葉紅外光譜分析

2.7.1 擠壓組織化對原料蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

2.7.1.1 峰的指認(rèn) 酰胺Ⅰ帶各峰的指認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)如表6所示。

表6 酰胺Ⅰ帶各峰的指認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)[27]Table 6 Designation standard of each peak of amide I[27]

2.7.1.2 原料中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的含量變化 從表7可以看出亞臨界芝麻蛋白粉中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量最高，為44.51%，谷朊粉中β-折疊含量最高，為32.90%，兩者以7:3的比例混合后，α-螺旋和β-折疊的含量減少，無規(guī)則卷曲含量增加，說明兩者混合之后二級結(jié)構(gòu)與之前相比變得比較無序?？赡苁怯捎趦煞N蛋白混合后，會出現(xiàn)交聯(lián)現(xiàn)象，導(dǎo)致無規(guī)則卷曲含量增加，故變得無序。

表7 不同蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量Table 7 Secondary structure content of different proteins

2.7.1.3 不同擠壓溫度對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響在擠壓組織化過程中，保持水分含量和螺桿轉(zhuǎn)速不變，改變擠壓溫度，來研究不同擠壓溫度對原料中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響，具體含量變化如表8所示。

從表8可以看出與原料二級結(jié)構(gòu)相比，120 ℃以上高溫下的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角增加，無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-逆折疊減小，說明復(fù)配蛋白原料中相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。

表8 擠壓溫度對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量的影響Table 8 Influence of extrusion temperature on the content of protein secondary structure

在120～130 ℃時，無規(guī)則卷曲變化不大，α-螺旋含量大幅度減小，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角增加，130～140 ℃時，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量減小，無規(guī)則卷曲和α-螺旋含量增加，在140～160 ℃時，β-折疊含量減小，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加。β-折疊含量減小應(yīng)該是由于β-折疊在此溫度區(qū)內(nèi)不穩(wěn)定，主要結(jié)構(gòu)為β-折疊的蛋白在此溫度區(qū)間發(fā)生了降解導(dǎo)致β-折疊含量減小[28]，無規(guī)則卷曲含量增加，主要是溫度會加劇蛋白質(zhì)變性的程度，使其原有的結(jié)構(gòu)被破壞，β-轉(zhuǎn)角的含量增加，說明在蛋白質(zhì)重新排列時，氫鍵減少，促進了β-折疊向β-轉(zhuǎn)角的轉(zhuǎn)變[29]。

2.7.1.4 不同水分含量對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響在擠壓組織化過程中，保持?jǐn)D壓溫度和螺桿轉(zhuǎn)速不變，改變水分含量，來研究不同水分含量對原料中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響，具體含量變化如表9所示。

從表9可以看出與原料相比，總體上水分含量促進了α-螺旋和無規(guī)則卷曲向β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的轉(zhuǎn)變。在水分含量為50%～60%時，α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變，無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角基本保持不變，在水分含量為60%～65%時，β-折疊和無規(guī)則卷曲減少，β-轉(zhuǎn)角增加，在65%～70%時二級結(jié)構(gòu)的含量變化主要為無規(guī)則卷曲和β-逆折疊減少，β-折疊增加，β-轉(zhuǎn)角基本保持不變。說明了水分含量的增加促進了蛋白分子鏈在高溫、高壓和高剪切力的綜合作用下的展開，從而變得更加有序[30]。

表9 水分含量對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量的影響Table 9 Influence of moisture content on protein secondary structure content

2.7.1.5 不同螺桿轉(zhuǎn)速對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響在擠壓組織化過程中，保持水分含量和擠壓溫度不變，改變螺桿轉(zhuǎn)速，來研究不同擠壓溫度對原料中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響，具體含量變化如表10所示。

從表10可以看出與原料相比，總體上螺桿轉(zhuǎn)速對原料中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響與水分含量對其的影響類似，都是α-螺旋和無規(guī)則卷曲的含量減小，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量增大。在螺桿轉(zhuǎn)速為180 r/min時，相比其他螺桿轉(zhuǎn)速，原料在機筒內(nèi)停留時間長蛋白質(zhì)變性程度相對來說大，導(dǎo)致無規(guī)則卷曲含量相對較高。螺桿轉(zhuǎn)速為200 r/min之后，受熱時間變短，但剪切力變大，在綜合作用下促進了α-螺旋和無規(guī)則卷曲向β-折疊和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變。

表10 螺桿轉(zhuǎn)速對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量的影響Table 10 Effect of screw speed on protein secondary structure content

2.7.2 傅里葉紅外光譜法測定擠壓前后結(jié)構(gòu)的變化傅里葉紅外吸收光譜是一種分子振動-轉(zhuǎn)動光譜，是由分子的振動-轉(zhuǎn)動能級間的躍遷而產(chǎn)生的[31]。某種特定的官能團和相關(guān)的化學(xué)鍵，不管其結(jié)構(gòu)如何變化，它在光譜圖中都會顯示出幾乎相同的頻率或波數(shù)。所以，可以根據(jù)光譜圖中顯示的特征吸收譜帶的位置，鑒別分子中所含有的特征官能團和化學(xué)鍵的類型[32]。為了研究原料在擠壓過程中是否生成的新的肽鍵，故將擠壓組織化前后的光譜圖放在一起對比。從圖5中可以看出擠壓組織化前后的蛋白原料的特征吸收峰并無差別，說明擠壓組織化過程中沒有新的肽鍵生成。

圖5 擠壓前后蛋白原料的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of protein materials before and after extrusion

2.8 擠壓組織化前后微觀結(jié)構(gòu)的變化

從圖6可以看出芝麻蛋白與谷朊粉在混合后在天然狀態(tài)下以不規(guī)則球狀顆粒形態(tài)存在，沒有特定的排列規(guī)律，經(jīng)過擠壓組織化處理后，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)改變，呈熔融狀態(tài)，從模頭中擠出時由于壓力和剪切力的作用下，結(jié)構(gòu)重新排列，呈線性排列形成了纖維結(jié)構(gòu)[33]，吸水性有所增加，吸油性有所降低。但可能是原料含有芝麻皮等雜質(zhì)，導(dǎo)致組織化蛋白電鏡圖中出現(xiàn)裂縫等形狀。

圖6 原料和組織化蛋白的掃描電鏡圖（縱截面）Fig.6 SEM of raw materials and texturized protein(longitudinal section)

3 結(jié)論

擠壓組織化過程比較復(fù)雜，很難通過某些指標(biāo)來徹底解釋，本實驗通過對擠壓組織化后的蛋白原料的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的初步探究，得到擠后的蛋白原料持水性增加了14.16%，吸油性減少了14.52%，蛋白消化率增加了11.18%，游離巰基含量減少了11.55%，氨基酸各組分均有一定損失，其中損失較多的氨基酸為脯氨酸、酪氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等。擠壓組織化過程中沒有新的肽鍵生成，有大量的二硫鍵生成，擠壓后得到的組織化蛋白的結(jié)構(gòu)主要是由二硫鍵和非共價鍵共同作用維持，同時擠壓組織化并未完全破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，只有部分不穩(wěn)定的α-螺旋和無規(guī)則卷曲向相對穩(wěn)定的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變；蛋白排列由無序變?yōu)橛行?，并產(chǎn)生了大量的纖維結(jié)構(gòu)，為后續(xù)深入開展組織化蛋白形成機理研究、開發(fā)組織化芝麻蛋白產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。