升陽益胃湯對慢性胃炎小鼠胃組織Wnt2、β-catenin蛋白表達的影響

迪麗娜爾·牙生，符雪月，曾曉鈴，郭春榮，王慧雯，董 璐，鄭小宇，陳 丹，孫勇新，孫祝美

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)·上海 201203；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院·上海 200032)

慢性胃炎是發(fā)病率較高的慢性病,且伴隨著萎縮與腸化生的出現(xiàn)，檢出率與胃癌的發(fā)生呈正相關(guān)[1]。中國是胃癌高發(fā)國家，慢性胃炎作為胃癌最常見的癌前疾病，其患病率一直處于較高水平[2]。慢性胃炎是一種多步驟、進行性和終身的炎癥，目前已被學(xué)界廣泛接受的慢性胃炎演變模型為：正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→腸型胃癌[3-4]。因此，慢性胃炎的預(yù)防和診治越來越受到人們的關(guān)注。Wnt信號通路與“炎癌轉(zhuǎn)化”密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號通路最常見功能主要是胚胎發(fā)育和癌癥，但也參與成年動物的正常生理過程。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路中存在多個與胃癌及癌前病變發(fā)生、發(fā)展機制相關(guān)的作用靶點[5]。

升陽益胃湯來源于李東垣《脾胃論》的《內(nèi)外傷辨惑論》，為“肺之脾胃虛”代表方[6]。據(jù)相關(guān)研究顯示，升陽益胃湯治療慢性胃炎臨床療效理想，能保護慢性胃炎大鼠胃黏膜，提高機體免疫力，使黏膜得以修復(fù)，還可以調(diào)控信號通路改善胃黏膜萎縮狀態(tài)[7-8]。

本實驗在以往研究的基礎(chǔ)上，觀察升陽益胃湯對慢性胃炎小鼠胃組織Wnt信號通路中的β-catenin和Wnt2蛋白表達的影響，為進一步研究提供前期實驗室基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物 健康雄性昆明種小鼠40只，9周齡，體質(zhì)量(25±0.9)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：PZSHUTCM201030015,飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中，溫度控制在20 ℃～26 ℃，相對濕度控制在40%～70%。

1.2 藥物與試劑 升陽益胃湯方的組成：黃芪30 g，半夏9 g，黨參10g，炙甘草10 g，獨活10 g，防風(fēng)10 g，白芍30 g，羌活10 g，橘皮12 g，茯苓30 g，柴胡10 g，澤瀉10 g，炒白術(shù)1 0g，黃連6 g，加水浸泡1 h，頭煎加水為總藥量的10倍，二煎加水為總藥量的4倍，取汁去渣，合并兩次藥汁，蒸發(fā)濃縮至含生藥1 g/mL，密封在無菌量瓶中備用。氫氧化鋁：拜耳醫(yī)藥保健有限公司。2%水楊酸鈉溶液：國藥集團有限公司，貨號20200429；WNT2 抗體：Proteintech公司，貨號66656-1-lg；β-Catenin抗體：Proteintech公司，貨號17565-1-AP。

1.3 主要儀器 生物顯微鏡：萊卡儀器有限公司；RM2135 石蠟切片機：萊卡儀器有限公司；IX71熒光顯微鏡：Olympus。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模與給藥 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機分為正常組、模型組、升陽益胃湯組、西藥組，每組各10只。 以2%水楊酸鈉2 mL每天灌胃，前3 周正常飲食，后3 周單日禁食，雙日足量進食，結(jié)合饑餓飽餐因素，共6 周成模[9]。中藥組灌胃給予升陽益胃湯劑(10 g/kg)；正常組、模型組分別灌胃等量的生理鹽水，西藥組灌胃氫氧化鋁混懸液(0.33 mg/kg)[10]，每天1 次。連續(xù)給藥30 d。

2.2 觀察指標

2.2.1 胃組織病理形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥后，禁食24 h，打開腹腔，取出全胃，沿胃大彎剪開，取胃組織，放入4%多聚甲醛，脫水、透明石蠟包埋，切片(5 μm)，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察胃組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.2.2 免疫熒光法檢測胃組織Wnt2、β-catenin表達 處死小鼠后快速取胃組織，投入液氮快速冷凍，冰凍切片，片厚15 μm，Wnt2一抗：1∶200(兔抗大鼠)4 ℃冰箱過夜，二抗，1∶400，熒光標記的抗兔的抗體，室溫，孵育1 h；β-catenin一抗：1∶1 000(兔抗大鼠)，37 ℃，孵育2 h，二抗，1∶500，熒光標記的抗兔的抗體，37 ℃，孵育1 h。貼片封片，熒光顯微鏡觀察并進行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠胃組織病理學(xué)變化 胃組織HE染色結(jié)果顯示：正常組胃黏膜完整，無炎性細胞浸潤；模型組胃黏膜變薄，腺體萎縮、減少，排列紊亂，有炎性細胞浸潤；升陽益胃湯組胃黏膜腺體病變減輕，排列較整齊，腺體數(shù)目增多；西藥組胃黏膜腺體萎縮較明顯，排列較為松散，腺體數(shù)目較少，有少量炎性細胞，與正常組胃黏膜差別明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠胃組織病理變化(HE，×100)

3.2 各組小鼠胃組織Wnt2和β-catenin蛋白表達檢測結(jié)果 模型組小鼠胃組織Wnt2、β-catenin熒光強度較正常組顯著增強；升陽益胃湯組小鼠胃組織Wnt2、β-catenin熒光表達強度低于模型組但高于正常組；西藥組小鼠胃組織Wnt2、β-catenin熒光表達強度接近于模型組。見圖2～圖3，表1。

圖2 各組小鼠胃組織Wnt2蛋白表達檢測結(jié)果(免疫熒光，×200)

圖3 各組小鼠胃組織β-catenin蛋白表達檢測結(jié)果(免疫熒光，×200)

表1 各組小鼠胃組織Wnt2和β-catenin蛋白表達的平均光密度比較

4 討論

中醫(yī)學(xué)中將慢性胃炎的病機分為肝胃氣滯證、肝胃郁熱證、脾胃虛弱證、脾胃濕熱證、胃陰不足證、胃絡(luò)瘀血證六型[11]；但均以脾胃虛弱為慢性胃炎的病理基礎(chǔ)，貫穿整個疾病的始終[12]。升陽益胃湯有升清降濁之效，補中有散，發(fā)中有收，對慢性胃炎證屬脾胃虛弱患者療效顯著[13]。

Wnt信號途徑參與細胞信號啟動、分子傳遞、靶基因轉(zhuǎn)錄、表達等多個重要環(huán)節(jié)。Wnt信號通路對于腫瘤干細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移起到調(diào)節(jié)作用，已在多種腫瘤干細胞中得到證實[14]。目前針對胃癌的Wnt信號通路的研究主要集中在β-catenin、Wnt2和c-myc基因表達等幾個環(huán)節(jié)[15]。β-catenin和c-myc基因蛋白的過表達與胃癌和胃的癌前病變密切相關(guān)。Wnt信號通路在慢性胃炎患者及胃癌患者發(fā)病中具有重要意義[14]。慢性胃炎作為胃癌的發(fā)展過程中的重要一環(huán)，在疾病處于慢性胃炎階段對Wnt信號通路傳導(dǎo)進行研究，可提早干預(yù)，預(yù)防炎癌轉(zhuǎn)化。

本實驗通過胃組織病理學(xué)觀察表明升陽益胃湯能有效治療胃腺體萎縮，減輕胃組織炎癥細胞浸潤情況，效果比西藥組明顯。免疫熒光測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組胃組織β-catenin和Wnt2表達明顯增強；與模型組比較，升陽益胃湯組胃組織β-catenin和Wnt2表達明顯減弱(P<0.05)。表明β-catenin和Wnt2表達增加影響慢性胃炎的進展，加重其炎癥反應(yīng)及腺體的萎縮；升陽益胃湯有良好的調(diào)節(jié)β-catenin和Wnt2失調(diào)的作用，可以使其調(diào)節(jié)至正常水平，從而有效地治療慢性胃炎，并及時阻斷其“炎癌轉(zhuǎn)化”。

綜上，升陽益胃湯能有效改善慢性胃炎小鼠胃組織病理變化，減輕胃組織炎癥反應(yīng)，并可以調(diào)節(jié)胃組織β-catenin和Wnt2表達。初步推斷升陽益胃湯對慢性胃炎小鼠Wnt信號通路的有一定影響，為進一步研究“炎癌轉(zhuǎn)化”的阻斷提供基礎(chǔ)。