UPLC-Q/Orbitrap HRMS 快速測定清咽類保健食品中12 種非法添加藥物

郭立凈，袁利杰，袁陽蕾

（河南省食品檢驗研究院，國家市場監(jiān)管重點實驗室(食品安全快速檢測與智慧監(jiān)管技術(shù))，特殊食品工程技術(shù)中心，河南鄭州 450003）

隨著我國工業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，環(huán)境污染問題使得空氣質(zhì)量不斷惡化，以及人們工作壓力增大，嗜好煙酒、熬夜、飲食油膩辛辣等生活習(xí)慣，咽喉疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]，加上人們保健意識的提升，清咽類保健食品深受廣大消費者的追捧。從申報注冊的資料發(fā)現(xiàn)，清咽類保健食品的原料主要是金銀花、胖大海、羅漢果等藥食同源類中草藥，但是一些不法分子為牟取利潤和快速緩解咽喉不適，在清咽類保健食品中添加療效更為顯著的化學(xué)藥物，添加的藥物種類和添加劑量均處于一個不可控制的狀態(tài)，消費者在不知情的情況下超劑量或長期服用，會對身體造成較大的傷害[2-4]。有文獻報道，在中成藥復(fù)方咳喘王膠囊中檢出鹽酸二氧丙嗪[5]，鹽酸二氧丙嗪屬于抗組胺類藥物，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、消炎和黏膜表面局部麻醉等作用；另外近期出現(xiàn)保健食品中檢出麻黃堿的報道[6]，麻黃堿屬于腎上腺素受體激動劑，主要用來治療支氣管哮喘、過敏反應(yīng)、鼻粘膜充血等疾病。從抗組胺類藥物和麻黃堿類藥物的治療功能上分析，很容易被添加到清咽類保健食品中用來快速緩解咽喉疾病[7]，而且這些藥物存在一定的副作用，譬如抗組胺類藥物存在中樞神經(jīng)抑制作用、抗膽堿作用、心臟毒性及體質(zhì)量增加的不良反應(yīng)[8]，均不得在保健食品中添加。

目前已報道的中成藥或保健食品中非法添加藥物的檢測技術(shù)主要有薄層色譜法[9]、高效液相色譜法[7,10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]、高分辨質(zhì)譜法[16-18]、紅外光譜法[19-21]、核磁共振法[22,23]等，其中文獻報道關(guān)于清咽類保健食品中非法添加藥物主要是沙丁胺醇、鹽酸二氧丙嗪等。UPLC-Q/Orbitrap HRMS 是一種高通量的篩查技術(shù)，具有高靈敏度和高選擇性，在缺少標(biāo)準(zhǔn)品的情況下根據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)可靠性的快速定性篩查，目前已在食品安全領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但尚沒有使用UPLC-Q/Orbitrap HRMS 對清咽類保健食品中麻黃堿、甲基麻黃堿以及10 種抗組胺類藥物的快速篩查分析的文獻報道。本研究以市面上常見的六類清咽類保健食品為研究對象，建立UPLC-Q/Orbi-trap HRMS 同時快速篩查麻黃堿、抗組胺類等12 種藥物的分析方法，實現(xiàn)清咽類保健食品中12 種非法添加藥物快速定性篩查和定量分析，為監(jiān)管部門做到早預(yù)警、早發(fā)現(xiàn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Vanquish 超高效液相色譜系統(tǒng)、Q Exactive PlusTM四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，美國Thermo；Mettler XS205 電子天平，瑞士梅特勒；3-30K 高速冷凍離心機，德國Sigma；Milli-Q 超純水器，美國密理搏公司；KQ-500 TDB 溫控超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司。

12 種藥物標(biāo)準(zhǔn)品：苯海拉明（批號21060496，純度99.80%）、鹽酸異丙嗪（批號21070641，純度99.50%）、馬來酸氯苯那敏（批號21070312，純度99.90%）、西替利嗪（批號21040011，純度99.80%）、氯雷他定（批號21081374，純度99.80%）、地氯雷他定（批號11692103，純度99.90%）、鹽酸二氧丙嗪（批號9062103，純度99.50%），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；麻黃堿（批號S036177，100.00 μg/mL），阿爾塔科技有限公司；甲基麻黃堿（批號11279，1.00 mg/mL），LGC Mikromol；伊巴斯?。ㄅ?106580，純度99.9%），上海安普璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；氮卓斯?。ㄅ?2Z042-B4，純度98.00%）、非索非那定（批號22Z042-B2，純度99.60%），上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），德國Merck 公司；甲酸（質(zhì)譜純）、乙酸銨（質(zhì)譜純），美國Sigma公司；超純水（電阻率為18.20 MΩ·cm，25 ℃），美國Millipore 公司。105 批次的草珊瑚、羅漢果、川貝枇杷、金銀花、西瓜霜、胖大海等為原料的含片清咽類保健食品，購買于本地市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃保存。分別精密量取上述12種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用初始流動相逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用新制。

1.2.2 樣品前處理

取草珊瑚、羅漢果、川貝枇杷、金銀花、西瓜霜、胖大海六類藥食同源中草藥為原料的含片清咽類保健食品，經(jīng)制樣機打碎，研磨成粉狀，精密稱取制備樣品1.00 g 于50 mL 容量瓶中，加30 mL 乙腈，振蕩混勻，超聲10 min，放冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后，上機測試。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZOBAX XDB C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量5 μL；流速：0.30 mL/min；流動相A：0.1%甲酸（含5 mmol/L 乙酸銨）溶液，B：甲醇；梯度洗脫程序：0～4.0 min，95% A～10% A；4.0～7.5 min，10% A；7.5～7.6 min，10% A～95% A；7.6～10.0 min，95% A。

1.2.4 質(zhì)譜條件

Q Exactive TM 質(zhì)譜系統(tǒng)配有加熱電噴霧離子源（HESI），采用正離子掃描模式（ESI+）；噴霧電壓為3.00 kV，毛細管溫度和噴霧溫度分別為350 ℃和250 ℃；鞘氣和輔助氣流速分別設(shè)為35 arb 和5 arb，霧化氣為氮氣，S-lens RF 電壓為50 V。質(zhì)譜掃描方式為Full MS/dd-MS2模式。Full MS（一級母離子全掃描）分辨率設(shè)為70 000 FWHM，質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～550，自動增益控制（AGC）、最大注入時間（IT）分別設(shè)為1.00×106和50 ms；dd-MS2（數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描）分辨率設(shè)為17 500 FWHM，AGC 設(shè)為5.00×105，IT 設(shè)為50 ms，分離窗品設(shè)為m/z2.00，強度閾值（Intensity Threshold）設(shè)為2.00×105，同位素排除設(shè)為“on”，動態(tài)排除值設(shè)為10.00 s。各化合物的步進歸一化碰撞能量（NCE）值統(tǒng)一設(shè)為30、50、70 eV。12 種藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 12 種藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of the 12 drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

實驗采用常見的C18色譜柱，分別選取φ=0.1%甲酸溶液和φ=0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L 乙酸銨）作為水相，甲醇和乙腈作為有機相進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相為φ=0.1%甲酸（含5 mmol/L 乙酸銨）溶液和甲醇時，各物質(zhì)響應(yīng)強度明顯高于流動相為φ=0.1%甲酸水溶液和甲醇的強度，且峰型拖尾現(xiàn)象得到明顯改善；與乙腈作為有機相相比，甲醇能在更短時間內(nèi)使待測組分得到有效分離。因此，實驗選擇φ=0.1%甲酸（含5 mmol/L 乙酸銨）溶液和甲醇為流動相進行梯度洗脫；同時實驗考察了Agilent ZOBAX XDB C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）兩個品牌的C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)二者沒有顯著性差異。

取六類清咽類保健食品作為空白基質(zhì)樣品，按照1.2.2 操作，從提取的離子色譜圖（Extracted Ion Chromatograms，XICs）中顯示，12 種藥物的保留時間處均沒有干擾峰，表明方法專屬性較強。在陰性樣品中添加12 種藥物，濃度均為100.00 μg/L，按照1.2.2操作，12 種藥物提取的離子色譜圖分離良好，單次測定12 種藥物在7.63 min 之內(nèi)完成分離，見圖1。

圖1 12 種藥物提取的離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 12 drugs

2.2 提取溶劑的選擇

按照1.2.2，實驗考察了甲醇、乙腈、乙醇3 種常見提取溶劑對12 種藥物加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果表明，草珊瑚與羅漢果清咽類保健食品在提取溶劑為乙腈、甲醇時，12 種藥物的回收率明顯高于乙醇；胖大海、西瓜霜、金銀花清咽類保健食品中12 種藥物的回收率在三種提取溶劑中無明顯差異；川貝枇杷清咽類保健食品在提取溶劑為乙腈時，12 種藥物回收率明顯高于甲醇、乙醇。結(jié)合實驗分析測定采用的為軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，乙腈抗干擾能力較強，實驗選取乙腈作為提取溶劑。

2.3 提取溶劑體積和基質(zhì)效應(yīng)的考察

按照1.2.2，實驗考察了提取溶劑體積為10、25、50 mL 對12 種藥物加標(biāo)回收率的影響。從圖2 金銀花清咽類保健食品中12 種藥物在不同提取體積的回收率變化可以看出，地氯雷他定在提取溶液為10 mL 時的回收率明顯低于25 mL 和50 mL，其他11 種藥物在三種提取體積時的回收率均在80.00%以上，這種回收率變化趨勢同樣出現(xiàn)在胖大海和西瓜霜清咽類保健食品中。

圖2 金銀花清咽類保健食品中12 種藥物在不同提取體積的回收率變化Fig.2 The recoveries of 12 drugs added to honeysuckle throat-clearing health food at different extraction volume

從圖3草珊瑚清咽類保健食品中12種藥物在不同提取體積的回收率變化可以看出，12 種藥物的回收率均隨提取溶液體積的增大而增加，在提取溶液體積為10 mL 和25 mL 時，8 種藥物的回收率未達到60.00%，而提取溶液體積為50 mL 時，除地氯雷他定回收率為76.13%外，其余11 種藥物的回收率均在80.00%以上，這種回收率變化趨勢同樣出現(xiàn)在羅漢果清咽類保健食品中。

圖3 草珊瑚清咽類保健食品中12 種藥物在不同提取體積的回收率變化Fig.3 The recoveries of 12 drugs added to Sarcandra glabra throat-clearing health food at different extraction volume

從圖4川貝枇杷清咽類保健食品中12種藥物在不同提取體積的回收率變化可以看出，地氯雷他定、西替利嗦、非索非那定的回收率隨著提取體積的增大而明顯增加，尤其在提取液體積為10 mL 時，回收率均低于50.00%。

圖4 川貝枇杷清咽類保健食品中12 種藥物在不同提取體積的回收率變化Fig.4 The recoveries of 12 drugs added to chuanbei pipa throat-clearing health food at different extraction volume

這些數(shù)據(jù)表明以藥食同源類中草藥為原料的清咽類保健食品，在用乙腈溶劑提取時，由于提取的基質(zhì)溶液比較復(fù)雜，不同藥物在不同的中草藥基質(zhì)提取液中呈現(xiàn)了不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，尤其地氯雷他定在六種清咽類保健食品中均呈現(xiàn)較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)，但隨著提取溶液稀釋倍數(shù)的增加，基質(zhì)效應(yīng)逐漸消除，考慮到保健食品中非法添加藥物的量比較大，實驗選擇提取溶液體積為50 mL，12 種藥物在六種清咽類保健食品中提取回收率均在75.15%～117.65%之間。

2.4 提取時間的選擇

按照1.2.2，實驗考察了超聲提取時間為10、20、30 min 對樣品加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果表明，草珊瑚與羅漢果糖清咽類保健食品中西替利嗪與氯雷他定在超聲時間為20 min 時，回收率達到最高，30 min 基本保持不變，其他四種清咽類保健食品中12 藥物的回收率隨超聲時間的改變無顯著性變化，所以實驗選擇超聲提取時間為20 min。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

12 種藥物均采用ESI+，使用一級質(zhì)譜全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜子離子掃描模式（Full MS/dd-MS2）對選定的質(zhì)量數(shù)（m/z100～550）進行掃描，該模式能夠同時得到一級質(zhì)譜母離子精確質(zhì)量數(shù)和二級質(zhì)譜的子離子全掃描信息，盡管Q/Orbitrap 能提供不同的分辨率，考慮到定性和定量的準(zhǔn)確性，高分辨率可帶來更好的質(zhì)量精度，但同時也會降低相應(yīng)的靈敏度并減少采集的掃描點數(shù)，最終一級質(zhì)譜掃描采用分辨率R=70 000，保證得到準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)并作為定量分析；而二級質(zhì)譜掃描采用相對較低的分辨率R=17 500，保證高分辨掃描的同時加快掃描速度，利用碎片離子的質(zhì)譜圖和離子信息進行定性。在此分辨率下，各化合物的靈敏度較好，且質(zhì)量偏差均小于1.45×10-6（見表1），理論質(zhì)量數(shù)與實測質(zhì)量數(shù)相對偏差越小，結(jié)果準(zhǔn)確度越高。12 種藥物二級質(zhì)譜掃描的碰撞能量設(shè)為30、50、70 eV，得到的二級質(zhì)譜圖是在3 種碰撞能量下的疊加，有效避免了采用單一碰撞能量導(dǎo)致的不同儀器間重現(xiàn)性差的情況。

2.6 線性方程與測定下限

Q/Orbitrap 可以通過全掃描并提取精確質(zhì)量數(shù)色譜圖完成定性定量測定，利用自動觸發(fā)的二級質(zhì)譜采集完成準(zhǔn)確定性。實驗按照1.2.2，配制12 種藥物濃度為1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00、200.00 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以藥物的一級高分辨準(zhǔn)分子離子峰的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，結(jié)果表明，12 種藥物在線性范圍1.00 μg/L～200.00 μg/L 內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999（見表2），可滿足檢測要求。

高分辨質(zhì)譜使用目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù)提取，色譜圖基線噪音很低，信噪比往往無窮大，因此不采用以3倍信噪比（S/N）確定目標(biāo)物檢出限，10 倍信噪比確定目標(biāo)物定量限的方法。實驗按照1.2.2，在六類清咽類保健食品空白基質(zhì)中逐級降低加標(biāo)濃度，以各目標(biāo)物在線性范圍中滿足回收率值在60%～120%區(qū)間內(nèi)的最低濃度為方法的測定下限，結(jié)果表明12 種藥物在六種清咽類保健食品中的測定下限為50.00 μg/kg～150.00 μg/kg（見表2）。

表2 12 種藥物的線性方程和在六種清咽類保健食品中的測定下限Table 2 Linear equation and lower limits of determination of 12 drugs in six throat-clearing health food

2.7 回收率與精密度

實驗按照1.2.2，取六類清咽類保健食品的空白基質(zhì)樣品，分別添加250、2 500、5 000 μg/kg 三個濃度水平，每個樣品重復(fù)測定6 次，計算回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviations，RSDs），結(jié)果見表3，12 種藥物回收率在75.15%～117.65%之間，精密度為0.89%～4.84%，符合檢驗檢測要求。

表3 12 種藥物在六種清咽類保健食品中的加標(biāo)回收率和精確度（n=6）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 12 kinds of drugs in sixthroat-clearing health food (n=6)

續(xù)表3

2.8 數(shù)據(jù)庫的建立

實驗按照1.2.2，分別對12 種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，得到保留時間、一級質(zhì)譜的母離子精確質(zhì)量數(shù)、二級質(zhì)譜的子離子信息，導(dǎo)入Trace Finder軟件，建立12 種藥物的定性快速篩查數(shù)據(jù)庫。在不使用標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，如果樣品中的藥物一級母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和二級碎片離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)及同位素分布與數(shù)據(jù)庫里的藥物離子質(zhì)量數(shù)信息能夠匹配，則初步判定樣品為陽性，可以進一步用該藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一色譜條件下考察保留時間和峰面積進行確證和定量分析，從而實現(xiàn)清咽類保健食品中12 種藥物的快速篩查定量檢測。

2.9 樣品測定

實驗按照1.2.2，應(yīng)用所建立的快速篩查方法對市場購買的105 批清咽類保健食品進行監(jiān)測，每個樣品做2 個平行測定。經(jīng)與建立的數(shù)據(jù)庫比對，篩查出一批次樣品中含麻黃堿和甲基麻黃堿成分；經(jīng)麻黃堿和甲基麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品進一步定量計算，檢出值分別為30.79×103μg/kg 和0.31×103μg/kg。

3 結(jié)論

本實驗利用超高效液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)建立了清咽類保健食品中12 種藥物的快速篩查和定量分析方法。依靠一級母離子精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)進行數(shù)據(jù)庫的快速匹配，利用一級高分辨母離子峰進行定量，該方法前處理過程簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于清咽類保健食品中添加藥物的快速篩查及定量檢測，為保健食品安全監(jiān)管工作提供了必要的技術(shù)支持。