電針足三里對脾氣虛模型大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈復合物活性和ATP含量的影響

勇入琳,劉路,董佳梓,張立德

(1.浙江中醫(yī)藥大學,杭州 310005;2.遼寧中醫(yī)藥大學,沈陽 110847)

《素問·痿論》中“脾主身之肌肉”概括地提出脾臟與人體肌肉充實程度及功能活動的正常與否密切相關。至北宋《太平圣惠方》則將上述“脾主肌肉”具體如何發(fā)揮作用詳加描述,“脾胃者……榮于肌肉也”認為脾胃通過將水谷中的精微物質化生為氣血,從而濡養(yǎng)肌肉?？梢姍C體肌肉之強健有力與脾胃功能正常與否密切相關,脾的運化正常,則谷氣自旺,化源不乏,四肢肌肉乃得溫養(yǎng)。在病理狀態(tài)下,若脾臟功能失調,則會出現運動功能障礙等一系列臨床表現。肢體的各項活動依賴于骨骼肌的舒縮,而其是一種主動的耗能過程,由線粒體所產生的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)為全身各細胞提供充足的能量[1]。其中分布于線粒體內膜上的 4種復合物(復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)被認為對完成線粒體的氧化磷酸化及ATP合成具有重要作用[2-3]。足三里是健脾益氣的要穴,課題組前期研究證實電針足三里能夠增加脾氣虛模型大鼠的進食量與活動性,同時改善其大便溏泄等癥狀,發(fā)揮健脾益氣的作用,而其機制可能與上調能量代謝相關指標表達有關[4-6]。本次研究采用飲食不節(jié)與勞倦過度的復合因素制備脾氣虛大鼠模型,并給予電針足三里穴治療,觀察其對骨骼肌 ATP含量及線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性的影響,擬從骨骼肌線粒體呼吸鏈與能量代謝的角度揭示足三里健脾益氣的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠32只,體質量(200±10)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號為SCXK(京)2016-0011。實驗動物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心,室溫 18～23 ℃,相對濕度45%～55%,大鼠自由進食飲水,適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。實驗過程嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》[7]對動物進行處置。采用隨機數字表法將32只大鼠平均分配為4組,分別為正常組、模型組、足三里組和非穴組,每組8只。

1.2 主要儀器與試劑

華佗牌針灸針(0.19 mm×10 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),華佗牌電子針療儀(SDZ-Ⅱ型,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),多功能酶標儀(SpectraMax I3,奧地利 MD公司),微量冷凍離心機(Sorvall ST 16R,美國Thermo Scientific公司),大小鼠抓力測定儀(YLS-13A,濟南益延科技發(fā)展有限公司)。ATP含量檢測試劑盒(BC0300,北京索萊寶科技有限公司),線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ測試盒(蘇州科銘生物技術有限公司)。

1.3 造模方法

參照課題組前期研究[8]方法,采用勞倦過度及飲食不節(jié)的復合因素復制大鼠脾氣虛證候模型。大鼠先禁食 2 d,再飽食 1 d,自由飲水,每日于 35～37 ℃水溫下負重(質量為 5%體質量的保險絲綁于大鼠尾部)游泳20 min,3 d為1個造模周期,共5個周期。大鼠出現食少、神疲、乏力、皮毛無光澤或枯槁及體質量下降,符合《中醫(yī)實驗動物模型方法學》[9]中記載脾氣虛模型的評定標準,提示造模成功。

1.4 各組干預方法

造模成功后各組大鼠恢復正常飲食并分別予相應的干預措施。足三里組中,將大鼠固定于鼠架上,暴露后肢,用 75%乙醇溶液消毒局部皮膚,選擇0.19 mm×10 mm一次性無菌針灸針針刺雙側足三里穴,穴位定位參照《實驗針灸學》[10]中相關標準,直刺深度5 mm,用SDZ-Ⅱ型電針儀連接雙側兩針柄上(左下肢接正極,右下肢接負極),采用疏密波,強度 0.5 mA,頻率2/15 Hz,每日1次,每次20 min,連續(xù)7 d。非穴組中以髂嵴連線上方15 mm,后正中線左右旁開20 mm處為非經非穴點[11],平刺5～8 mm,用SDZ-Ⅱ型電針儀連接雙側非經非穴點的兩針柄上(左下肢接正極,右下肢接負極),余操作同足三里組。正常組和模型組予相同時間的固定,但不做其他處理。

1.5 取材方法

各組干預7 d后,大鼠禁食不禁水12 h以上,予腹腔注射麻醉。暴露股四頭肌,快速切取股四頭肌組織,置于液氮罐中,稍后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠體質量測定

從實驗第1天開始,每3天在當日造模之前測量1次大鼠體質量,最后1次于實驗第22天20:00點測量,記錄并統(tǒng)計其變化。

1.6.2 大鼠抓力測定

YLS-13A大小鼠抓力測定儀是目前使用廣泛的測定大、小鼠抓力的儀器,可以直觀評價動物衰老、神經肌肉損傷所引起的力量降低及藥物等干預的效果。各組大鼠分別于造模前(第0天)、造模后(第15天)和治療后(第22天)測量3次抓力。測量時一手固定抓力板,另一手將大鼠放于抓力板上,待大鼠前肢自然抓握住抓力板后右手順勢牽拉大鼠尾部。此時松開抓力板,右手勻速牽拉,待大鼠前肢從抓力板滑脫瞬間,記錄抓力板數值即為前肢抓力。各組大鼠分別于造模前、造模后及治療后進行抓力測定,每次測量5遍,由同一實驗人員完成。所得數值取中間3位數計算平均值,即為該大鼠的抓力。

1.6.3 比色法檢測大鼠骨骼肌組織ATP含量

稱取100 mg骨骼肌組織,加入1 mL酸性提取液,在冰上進行勻漿,4 ℃下8 000×g離心10 min,取上清至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,4 ℃ 8 000×g離心10 min,取上清,置于冰上待測。嚴格按照說明書操作依次加入樣本和試劑,充分混勻后 37 ℃準確水浴 30 min,再按比例加入顯色劑,37 ℃水浴20 min。預熱分光光度計30 min,用蒸餾水調零,在 700 nm波長下測定各管吸光值,按公式計算ATP含量。

1.6.4 酶標法檢測大鼠骨骼肌組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性

線粒體蛋白提取。準確稱取100 mg骨骼肌組織,按說明書加入1 mL試劑一和10 μL試劑三,用冰浴勻漿器勻漿,離心棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,離心棄上清,得到的沉淀即為線粒體。加入200 μL試劑二和2 μL試劑三,用超聲波破碎(冰浴,功率200 W,超聲3 s,間隔10 s,重復30次),即可用于復合體Ⅱ/Ⅳ酶活性測定。

測定步驟。酶標儀預熱,調節(jié)波長至 340/605/550/550 nm,用蒸餾水調零,測定并記錄各樣本在340/605/550/550 nm處初始吸光值A1和2 min后的吸光值 A2,分別按公式計算復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數據資料進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差表示,組間比較采用重復測量方差分析;進一步兩兩比較,方差齊性選用LSD或Tamhane’sT2(M)檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量比較

造模前,各組大鼠體質量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。從第2個造模周期開始,模型組、足三里組和非穴組大鼠體質量均較正常組明顯下降(P＜0.05);造模結束后,模型組、足三里組和非穴組大鼠體質量逐漸有升高的趨勢;干預結束后,足三里組大鼠體質量較模型組和非穴組顯著升高(P＜0.05),而非穴組大鼠體質量與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠體質量比較 (±s, g)

表1 各組大鼠體質量比較 (±s, g)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與足三里組比較2)P＜0.05。

時間 正常組(8只) 模型組(8只) 足三里組(8只) 非穴組(8只)造模前(Day1) 208.43±4.41 208.94±3.98 206.48±2.46 208.21±2.94第1個造模周期后(Day4) 246.08±4.43 213.19±4.641) 211.43±3.161) 208.90±12.501)第2個造模周期后(Day7) 257.99±7.40 211.49±5.031) 208.64±5.641) 213.09±6.971)第3個造模周期后(Day10) 266.55±6.64 203.50±6.121) 205.81±7.481) 207.43±11.211)第4個造模周期后(Day13) 282.75±10.06 197.80±7.461) 201.55±7.121) 197.01±14.941)第5個造模周期后(Day16) 300.89±7.72 199.79±8.931) 201.95±9.441) 194.96±18.021)干預3 d后(Day19) 316.91±11.01 208.44±10.001) 212.79±7.091) 211.88±11.461)干預結束后(Day22) 336.31±16.13 236.68±10.261)2) 256.14±11.661) 238.71±8.981)2)

2.2 各組大鼠抓力比較

造模前,大鼠抓力維持在較低水平,且各組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);隨著動物年齡增加抓力有所增強。造模后,模型組、足三里組和非穴組大鼠抓力都有明顯減弱,與正常組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。干預后,模型組、足三里組和非穴組大鼠抓力仍較正常組弱,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但足三里組大鼠抓力增強較為明顯,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而非穴組大鼠抓力與模 型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠抓力比較 (±s, g)

表2 各組大鼠抓力比較 (±s, g)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05。

時間 正常組(8只) 模型組(8只) 足三里組(8只) 非穴組(8只)造模前(Day1) 913.75±98.78 907.83±142.21 908.63±129.41 927.56±248.51造模后(Day16) 1271.16±110.93 975.69±80.951) 972.55±194.171) 985.46±110.931)干預結束后(Day22) 1668.91±184.05 1188.99±61.811) 1385.19±128.741)2) 1149.36±81.581)

2.3 各組大鼠骨骼肌組織ATP含量比較

與正常組比較,模型組、足三里組和非穴組大鼠骨骼肌組織ATP含量顯著下降(P＜0.05);與模型組比較,足三里組大鼠骨骼肌組織 ATP含量明顯上升(P＜0.05);而非穴組與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);足三里組大鼠骨骼肌組織ATP含量高于非穴組(P＜0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠骨骼肌組織ATP含量比較 (x ±s, μmoI/g)

2.4 各組大鼠骨骼肌組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性比較

與正常組比較,模型組、足三里組和非穴組大鼠骨骼肌組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性均降低(P＜0.05);與模型組比較,足三里組大鼠骨骼肌組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性升高(P＜0.05),而非穴組升高不明顯(P＞0.05);足三里組與非穴組比較,大鼠骨骼肌組織中線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠骨骼肌組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性比較 [x ±s, nmoI·(min·g)-1]

3 討論

脾氣虛證的主要臨床表現有倦怠乏力、少氣懶言、腹脹納呆、面色萎黃、大便溏薄等,它可見于臨床多系統(tǒng)、多疾病之中,如冠心病、高血壓、重癥肌無力、肥胖癥等[12-13]?，F代研究表明,脾氣虛證表現出的一系列虛象常與線粒體能量代謝不足密切相關,如脾虛模型大鼠的心、小腸和胃等組織中ATP含量及線粒體形態(tài)結構均較正常大鼠有所改變[6,14-16]。足三里穴歸屬多氣多血的足陽明胃經,具有補中氣、健脾胃、調和氣血之功。若脾胃虧虛,氣血不足,則宗筋失養(yǎng),縱緩不收,而見肌肉、關節(jié)痿弱不用,因此可選用足三里穴來達到治療脾虛證的作用。在臨床中足三里穴被廣泛應用于增強免疫力[17-18],調節(jié)消化系統(tǒng)[19-20],調節(jié)血液系統(tǒng)[21],調控物質、能量代謝[22-23]等。合理運用電針能夠增強足三里穴的治療效果,而其參數是影響電針效應的重要因素。目前臨床常用的電針波型多以連續(xù)波、疏密波為主。而其中疏密波特點是一種時疏時密、不斷變換頻率的調制脈沖波,因此可產生多種物質的共同釋放,且不易為機體所適應。有研究發(fā)現,以2/15 Hz頻率的疏密波刺激大鼠足三里穴能夠明顯促進其胃腸運動[24]。

線粒體是細胞能量代謝的關鍵場所,因此被稱為“細胞動力工廠”,機體生命活動的動力主要來源于線粒體氧化磷酸化所合成的ATP。而在上述過程中,位于線粒體內膜上的線粒體呼吸鏈酶復合物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)與線粒體呼吸功能密切相關[25]。既往研究發(fā)現,脾虛證與線粒體能量代謝障礙密切相關[26-27]。本次實驗結果顯示,脾氣虛大鼠的骨骼肌組織中線粒體呼吸鏈酶復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性及ATP含量均明顯下降,電針足三里治療能夠顯著提高脾氣虛模型大鼠骨骼肌線粒體上述復合物的活性以及ATP含量。前期研究[8]已經證實,電針足三里穴可通過糾正脾氣虛模型大鼠骨骼肌線粒體分裂融合的失衡狀態(tài),提高能量代謝水平。結合上述研究結果可知,脾氣虛時,骨骼肌線粒體結構和功能失衡,其內膜上的線粒體呼吸酶鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性減弱,影響了線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化,導致線粒體產生的ATP顯著降低。而電針足三里穴可能是通過恢復線粒體分裂,融合動態(tài)平衡,從而提高線粒體呼吸鏈復合物的活性,增加ATP含量,提高線粒體能量代謝水平來發(fā)揮“健脾益氣”之功效,進而改善脾氣虛模型大鼠的形體瘦削、食少乏力等脾虛癥狀。而非經非穴點對脾氣虛證大鼠的改善作用不明顯,進一步印證了足三里經穴效應的特異性,與前期研究結果一致[28]。