石斛添加量對(duì)小曲微生物及風(fēng)味的影響

陳小琴，母應(yīng)春，蘇偉，姜麗，趙馳

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院 貴陽 550025）

酒曲是中國白酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑，含多種微生物和風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)酒的產(chǎn)率和品質(zhì)有重要影響，有“曲是酒之骨”之稱[1]。鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）具有獨(dú)特藥用價(jià)值，含石斛多糖、生物堿等多種活性成分，具有抗癌、降血糖、增強(qiáng)免疫力等功效[2]。制作酒曲時(shí)添加藥食同源物質(zhì)能抑制雜菌生長，促進(jìn)有益微生物繁殖，還能豐富產(chǎn)品風(fēng)味[3]。吳志等[4]在制曲時(shí)添加3%的石菖蒲、生地黃和白術(shù)等醇提液，提高了曲發(fā)酵力和糖化力。禹曉婷等[5]添加12 味藥食同源物質(zhì)入曲，發(fā)現(xiàn)新基質(zhì)曲糖化力和液化力是傳統(tǒng)曲的1.3 倍和2.8 倍。目前，還未見將石斛莖作為小曲發(fā)酵基質(zhì)的研究報(bào)道。

近年來，高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）在酒曲中廣泛應(yīng)用，增強(qiáng)了人們對(duì)酒曲微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的了解[6]。同時(shí)，常結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)研究食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（volatile flavor components，VFCs）。如Zhao 等[7]采用宏基因組學(xué)和GC-TOF-MS 研究了貴州3 種小曲微生物群落和風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果顯示乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、曲霉屬（Aspergillus）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）等為小曲中優(yōu)勢菌屬，并篩選出39 種顯著差異代謝物。Tang 等[8]利用Illumina MiSeq 平臺(tái)和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS），檢測4 種小曲微生物群落和VCFs，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏氏細(xì)菌屬（Weissella）、根霉菌屬（Rhizopus）和念珠菌屬（Candida）為優(yōu)勢菌屬，同時(shí)鑒定出68 種顯著差異的VCFs。目前還沒有關(guān)于石斛小曲品質(zhì)的研究報(bào)道。

本研究以傳統(tǒng)小曲和石斛小曲為研究對(duì)象，采用HTS 和頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace Solid Phase Microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）分析石斛添加量對(duì)小曲微生物群落、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及理化特性的影響，為石斛小曲工藝優(yōu)化和生產(chǎn)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

石斛小曲原料為市售鐵皮石斛莖，產(chǎn)自貴州；種曲為根霉菌Q303，貴州輕工研究所；傳統(tǒng)小曲未添加石斛，編號(hào)為DZ；石斛小曲按石斛添加量30%，40%和50%分別編號(hào)為A，B 和C。

Power Soil DNA 提取試劑盒，美國MP Bio公司；2%瓊脂糖凝膠，西班牙Biowest 公司；DNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司；正、反引物，深圳市英俊生物技術(shù)有限公司；MinElute PCR 純化試劑盒，德國Qiagen 公司；正構(gòu)烷烴（色譜純），美國Sigma 公司；環(huán)己酮（>99.5%，GC），上海阿拉丁生物科技股份有限公司。

1.2 儀器

ABI VeritiTM99012PCR 儀，美國ABI 公司；Gel Doc 2000 型凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；Illumina Hiseq 測序儀，美國Illumina 公司；GCMS TSQ8000 與TRACE1300 氣-質(zhì)譜聯(lián)用，美國賽默飛世爾科技公司；50/30 μm/CAR/PDMS/DVB萃取頭，美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與采集 參照禹曉婷等[5]的方法并稍作修改制備小曲。所有樣品裝入無菌袋中，密封，置于-80 ℃超低溫冰箱，用于理化特性、VFCs和微生物檢測。

工藝流程：

1.3.2 理化指標(biāo)檢測 小曲水分、酸度、液化力、糖化力、發(fā)酵力和酯化力等檢測參考文獻(xiàn)[9]。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味檢測

1.3.3.1 GC-MS 條件 進(jìn)樣口溫度：240°C；升溫程序：40 °C（5 min），5 °C/min 上升到150 °C（3 min），最后以5°C/min 上升到240°C（5 min）。以高純氦氣（99.999%）為載氣，載氣流速1.00 mL/min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：EI 離子源，離子源溫度250°C，電離電壓70 eV，傳輸線溫度240°C，色譜掃描范圍35～550 amu。

1.3.3.2 定性及定量方法 與質(zhì)譜NIST 光譜數(shù)據(jù)庫比對(duì)并鑒定，僅保留正、反匹配度大于700 的化合物。通過內(nèi)標(biāo)法計(jì)算得到各揮發(fā)性組分的質(zhì)量濃度。計(jì)算公式如下：

式中：Ci——待測揮發(fā)性組分質(zhì)量濃度，μg/kg；Cis——內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，μg/mL；Ai——待測揮發(fā)性組分的色譜峰面積，mAU·min；Ais——內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積，mAU·min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS Statistics 26.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)；SIMCA14.1 軟件繪制用于正交偏最小二乘判別得分圖，Origin 2018 軟件用于繪制微生物群落組成圖和主成分分析圖、層級(jí)聚類圖，R 語言軟件用于繪制VFCs 熱圖、微生物與VFCs 相關(guān)性熱圖，Canoco 5 軟件繪制冗余分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小曲理化性質(zhì)

由表1 可知，4 種小曲水分含量在11.42%～12.52%之間，差異不顯著（P>0.05），均小于國家標(biāo)準(zhǔn)的13%，利于長期儲(chǔ)存[10]。添加30%石斛莖時(shí)，糖化力、液化力和發(fā)酵力最大值分別為（122.40±0.61），（51.87±8.67）U/g 和（13.97±2.00）g/100 g；然而，酯化力在40%添加量時(shí)最大值（169.38 ±6.71）mg/g。糖化力和發(fā)酵力分別反映微生物將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖的能力及將其轉(zhuǎn)化成乙醇的能力[11-12]；酯化力與白酒發(fā)酵過程中酯類物質(zhì)的形成密切相關(guān)[13]。此外，酸度是評(píng)價(jià)酒曲成熟度的一個(gè)重要指標(biāo)[14]，且隨石斛添加量的增加而增大，在添加量為50%時(shí)最大值（0.82±0.03）mmol/10 g。綜上所述，較DZ 而言，添加30%石斛莖時(shí)小曲的理化品質(zhì)最佳。

表1 小曲樣品理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of physicochemical propertie in Xiaoqu sanples

2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

從4 種小曲中共鑒定出41 種可靠揮發(fā)性組分，主要為醇類12 種、酚類7 種、烴類6 種、醛酮類6 種、酸類3 種、酯類3 種和其它類4 種（表2）。其中，從A、B、C 和DZ 分別檢測出24，29，21種和7 種。醇類和酚類是構(gòu)成A、B、C 和DZ 中風(fēng)味特征的重要物質(zhì)，其在A、B 和C 中的組成和含量明顯高于DZ。此外，烴類和其它類僅存在于A、B 和C 中，并隨石斛莖添加量的增加而增加，這可能來自石斛原料[15]。由此可見，在小曲制備中添加石后，提高了VFCs 組成及含量。當(dāng)添加量為40%時(shí)，小曲VFCs 種類及含量均為最大值。

表2 小曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析Table 2 Analysis of volatile flavor compounds in Xiaoqu samples

（續(xù)表2）

為更好地說明樣品小曲間VFCs 含量的差異，利用正交偏最小二乘判別法（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA）進(jìn)行分析。如圖1a 所示，R2X 為0.675，Q2Y 為0.93，說明該模型在分析樣品時(shí)不存在異常值[16]。4種小曲分別位于不同象限，表明各樣品間VFCs 存在差異。此外，基于VIP ＞1.0 和P ＜0.05，共篩選出16 種顯著差異代謝物（Important Significantly Different Metabolites，ISDMs），對(duì)其熱圖統(tǒng)計(jì)分析。如圖1b 所示，A、B 和C 的風(fēng)味特征仍明顯優(yōu)于DZ。A、B 和C 中的ISDMs 以醇類、醛酮類和酚類為主，如芳樟醇、正己醇、苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、壬醛、愈創(chuàng)木酚等，而DZ 中主要為苯乙醇。這是因?yàn)殍F皮石斛莖中多糖、苯丙氨酸等可在微生物作用下產(chǎn)生醇類和醛酮類物質(zhì)[17]。芳樟醇呈現(xiàn)鈴蘭香氣和木香，有鎮(zhèn)痛、抗炎癥的功效[18]；苯乙醇呈現(xiàn)玫瑰花香味和桃子果香味，是大曲VFCs 中優(yōu)勢醇類[19]；苯甲醛具有杏仁和焦糖氣味[20]；壬醛稀釋時(shí)散發(fā)玫瑰和橘子的香氣[21]；正己醇有青草香氣和樹葉氣味，能影響白酒香氣[22]；松油烯呈現(xiàn)柑橘香和木香，可用于調(diào)配檸檬和薄荷香精[23]；愈創(chuàng)木酚有木香及香莢蘭的隱香，被證實(shí)為白酒中重要揮發(fā)性組分[24]。同時(shí)，4 個(gè)小曲聚類為兩大支，A和B 聚為一類，C 和DZ 聚為另一類。這與OPLS-DA 得分圖在t1 上的結(jié)果一致。

圖1 小曲樣品揮發(fā)性物質(zhì)的OPLS-DA 得分圖（a）和重要顯著差異物質(zhì)的聚類熱圖（b）分析Fig.1 Opls-da score chart of VFCs（a）and hierarchical clustering heat map of ISDMs（b）in Xiaoqu samples

2.3 樣品中細(xì)菌的分析

2.3.1 細(xì)菌α-多樣性 分析 A、B、C 和DZ 在97%相似度水平下進(jìn)行聚類，共獲得OTUs 平均數(shù)分別為214，393，582 和339（表3）。由表3 可知，覆蓋率在98.44%～99.81%間，表明未被檢出序列的概率較小[25]。本研究測序結(jié)果能真實(shí)反映小曲樣品中細(xì)菌微生物真實(shí)情況。此外，Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)被用來描述物種豐度和多樣性。C 的Chao1 和Shannon 指數(shù)最大（619.12 和7.87），而A的Chao1 和Shannon 指數(shù)最?。?41.88 和0.40）。添加50%石斛莖時(shí)，小曲細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)最復(fù)雜。

表3 小曲細(xì)菌微生物α-多樣性分析Table 3 α-Diversity index of bacterial microorganism in Xiaoqu

2.3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 在門水平上，從4 個(gè)小曲中共檢測到22 個(gè)細(xì)菌門，圖2a 顯示豐度前10 的物種，其余物種合并為其它。A 和B 以厚壁菌門（Firmicutes）為絕對(duì)優(yōu)勢細(xì)菌門，分別占比96.96%和75.40%。此外，B 中變形菌門（Proteobacteria，13.59%）同樣占優(yōu)勢。C 以厚壁菌門（32.36%）、變形菌門（26.13%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，23.98%）為優(yōu)勢細(xì)菌門。同時(shí)，B 和C 中還含有少量酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。DZ 以厚壁菌門（12.91%）、變形菌門（29.99%）、酸桿菌門（16.47%）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria，12.63%）為優(yōu)勢細(xì)菌門。據(jù)報(bào)道，厚壁菌門、變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門是小曲中主要優(yōu)勢細(xì)菌門[26-28]。A、B 和C 中厚壁菌門與擬桿菌門含量比DZ 中高，可能是石斛多糖促進(jìn)其生長，這與張俊楠等[29]研究結(jié)果相似。

圖2 小曲在細(xì)菌門水平（a）和屬水平（b）的群落組成Fig.2 Community composition of Xiaoqu at phylum level（a）and genus level（b）

在屬水平上，共檢測到342 個(gè)細(xì)菌屬。圖2b顯示豐度前10 的物種，其余物種歸類為其它。如圖2b 所示，A、B 和C 與DZ 細(xì)菌群落存在較大差異，且無規(guī)律可言。芽孢桿菌屬（Bacillus）是A（96.13%）和B（71.89%）中的優(yōu)勢細(xì)菌屬。C 以2.75%的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、5.26%的uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、5.15%的葡萄球菌屬（Staphylococcus）和4.05%的uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae 為優(yōu)勢細(xì)菌屬。DZ 以u(píng)ncultured_bacterium_o_Chloroplast、uncultured_ bacterium_f_Mitochondria、乳酸桿菌和uncultured_bacterium_k_Bacteria 為優(yōu)勢細(xì)菌屬，分別占比12.63%，12.04%，5.51%和7.83%。

uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae 屬于擬桿菌門細(xì)菌，于2002 年首次被發(fā)現(xiàn)，可產(chǎn)生維生素B12，能治療惡性貧血癥[31]。uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae 和uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae 分別屬于擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門，其為水稻秸稈和糖漿廢水共發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸優(yōu)勢菌門[32]。芽孢桿菌屬在A 和B 中占優(yōu)勢，是因?yàn)槭艽龠M(jìn)其繁殖[33]。芽孢桿菌屬通過分泌蛋白酶和淀粉酶賦予小曲糖化力、液化力和發(fā)酵力[34]，并與吡嗪類、酯類、醇類和有機(jī)酸類物質(zhì)密切相關(guān)[35]。乳酸桿菌屬能產(chǎn)生豐富有機(jī)酸，還能產(chǎn)生細(xì)菌素抑制致病菌[36]。由此可見，當(dāng)添加30%石斛時(shí)，小曲有益細(xì)菌比例最高，添加量為50%時(shí)不利于有益細(xì)菌繁殖。

2.4 樣品中真菌的分析

2.4.1 真菌α-多樣性分析 由表4 可知，基于97%相似度，分別獲得OTUs 數(shù)為80（A）、444（B）、510（C）、121（DZ）。覆蓋率均大于99.0%，表明測序結(jié)果基本反映樣品小曲中真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。C 的Chao1 和Shannon 指數(shù)最大（577.80 和5.83），而DZ 的Chao1 和Shannon 指數(shù)最?。?40.88 和1.24）。這表明C 的真菌群落豐富度和多樣性最高，DZ 最低，即添加50%石斛莖時(shí)，小曲真菌群落組成及結(jié)構(gòu)最復(fù)雜。

表4 小曲真菌微生物α-多樣性分析Table 4 α-Diversity index of fungus microorganism in Xiaoqu

2.4.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析 在門水平上，共檢出7 個(gè)真菌物種。如圖3a 所示，A、B、C、DZ 優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門（Acomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota），分別占比54.53%、46.56%、50.27%、82.42%和42.92%、47.25%、33.38%、17.45%。據(jù)報(bào)道，子囊菌門和毛霉菌門在不同酒曲中占主導(dǎo)[37-38]。值得注意的是擔(dān)子菌門（Basidiomycota）僅存在于A、B 和C 中，且與石斛莖添加量呈正比關(guān)系。毛霉菌門和擔(dān)子菌門在A、B 和C 中明顯增加，說明石斛莖中某些活性成分能促進(jìn)毛霉菌門與擔(dān)子菌門生長。

圖3 小曲在門水平（a）和屬水平（b）真菌群落組成Fig.3 The fungus composition of Xiaoqu at phylum level（a）and genus level（b）

在屬水平上，共檢測到226 個(gè)真菌屬。圖3b顯示相對(duì)豐度前10 的物種，其余物種分別歸類為其它和未分類。DZ 與A、B 和C 間真菌群落存在差異，同時(shí)，A、B 和C 間也存在差異。A 中優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬（Rhizopus，42.89%）、曲霉菌屬（Aspergillus，26.97%）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces，22.59%）。B 中優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬（47.25%）和威克漢姆酵母屬（24.06%）；C 中優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬（33.37%）。同時(shí)，A、B 和C 中還有少量釀酒酵母屬（Saccharomyces）、棒孢酵母屬（Clavispora）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）和鐮刀菌屬（Fusarium）。DZ 中真菌物種組成較為簡單，優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬（17.42%）和曲霉菌屬（81.60%）。

研究表明，石斛能促進(jìn)根霉菌屬和釀酒酵母屬繁殖，相反抑制曲霉菌屬生長[38-39]，這解釋了為何石斛小曲中根霉菌屬和釀酒酵母屬增多，而曲霉菌屬明顯減少的變化趨勢。根霉菌屬和曲霉菌屬作為小曲中核心真菌屬，能產(chǎn)生多種水解酶，用于淀粉糖化和蛋白質(zhì)水解生成還原糖及氨基酸[40-41]，且曲霉屬與吡嗪類、酯類和芳香族化合物的形成有密切聯(lián)系[33]。威克漢姆酵母屬是常見的非釀酒酵母，能促進(jìn)酚類及芳香類物質(zhì)形成[42]。釀酒酵母屬是乙醇的主要生產(chǎn)者，同時(shí)也能產(chǎn)生酯類和高級(jí)醇[43]。古根菌屬、鐮刀菌屬、芽枝霉屬和被孢霉屬主要存在于A、B 和C 中，且與石斛莖添加量存在正比關(guān)系，因此推測其來自石斛原料。鐮刀菌屬與芽孢桿菌屬存在拮抗作用[44]，因此C 中芽孢菌屬含量較少。綜上，當(dāng)添加30%石斛莖時(shí)，小曲中有益真菌種類及含量最大，利于發(fā)酵；相反，添加50%石斛莖時(shí)不利于有益真菌生長，這與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析一致。

2.5 小曲群落相似性聚類分析

為更好地說明樣品小曲中微生物群落的差異，分別對(duì)細(xì)菌和真菌組成進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）及層級(jí)聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）。如圖4a 所示，PC1 和PC2 對(duì)細(xì)菌群落差異的貢獻(xiàn)率之和高達(dá)94.2%，能較好地反映樣品小曲間細(xì)菌群落差異。A 和B 與C 和DZ 分別位于主坐標(biāo)軸左、右兩側(cè)，說明A 和B 與C 和DZ 之間差異較大。圖4b顯示，4 個(gè)小曲聚兩大支，A 和B 聚為一類，C 和DZ 聚為另一類，這與PCA 結(jié)果一致。如圖4c 所示，PC1 和PC2 對(duì)真菌群落差異貢獻(xiàn)率之和高達(dá)97.4%。A、B 和C 與DZ 分別位于主坐標(biāo)軸左、右兩側(cè)，表明A、B 和C 與DZ 間差異較大。圖4d 顯示，A、B 和C 聚為一類，DZ 聚為另一類，這與PCA結(jié)果一致。

圖4 小曲細(xì)菌群落主成分（a）和層級(jí)聚類（b），真菌群落主成分（c）和層級(jí)聚類（d）分析圖Fig.4 PCA（a）and HCA（b）of bacterial community，PCA（c）and HCA（d）of fungal community in Xiaoqu samples

2.6 關(guān)聯(lián)性分析

2.6.1 小曲微生物與理化性質(zhì)的冗余分析 冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）分析了小曲微生物與理化性質(zhì)間的相關(guān)性。如圖5a 所示，芽孢桿菌屬與發(fā)酵力、糖化力、液化力及酯化力呈正相關(guān)，A 和B 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，因此與這4 個(gè)理化指標(biāo)相關(guān)性高。葡萄球菌屬和乳酸桿菌屬與酸度呈正相關(guān)，酸度主要與小曲C 有較高相關(guān)性；葡萄球菌屬在白酒生產(chǎn)中起何作用至今未見報(bào)道，但葡萄球菌屬中的腐生葡萄球菌屬可通過產(chǎn)生酸性蛋白酶降低環(huán)境酸度[45-46]。如圖5b 所示，根霉菌屬、威克漢姆酵母和曲霉菌與液化力、發(fā)酵力、糖化力和酯化力呈正相關(guān)，其中A 和B 與液化酶活力、糖化酶活力、發(fā)酵力和酯化力相關(guān)性較高。鐮刀菌屬、紅菇屬、古根菌屬、芽枝霉屬、被孢霉屬和棒孢酵母屬則與酸度呈較強(qiáng)正相關(guān)，C 與酸度相關(guān)性最高。綜上所述，真菌對(duì)小曲理化特性形成的影響較大。

2.6.2 小曲微生物與揮發(fā)性組分相關(guān)性分析 基于Spearman 算法分別剖析細(xì)菌和真菌在屬水平前10 的物種與16 種ISDMs 間的相關(guān)性，借助R語言軟件進(jìn)行熱圖可視化分析。如圖6a 所示，芽孢桿菌屬與環(huán)己醇、苯甲醇、正己醇、4-叔丁基苯酚和正己醛呈顯著正相關(guān)，這與Azokpota 等[47]研究一致。葡萄球菌屬與松油烯和芳樟醇呈顯著正相關(guān)。如圖6b 所示，根霉菌屬和威克漢姆酵母屬與醛酮類、醇類和酚類物質(zhì)呈正相關(guān)，如環(huán)己醇、苯甲醇、正己醇、1-十一醇和愈創(chuàng)木酚等，這與Chen 等[48]和劉曉柱等[49]的研究結(jié)果一致。釀酒酵母菌屬與1-十一醇、壬醛、芳樟醇、松油烯、苯甲醛和苯并噻唑呈正相關(guān)；釀酒酵母屬在白酒釀造過程中的主要作用是產(chǎn)生醇類物質(zhì)，同時(shí)也與醛類物質(zhì)的形成有關(guān)[50]。苯并噻唑、1-十一醇、壬醛、芳樟醇、松油烯、3-甲基-2-庚醇和苯甲醛與紅菇菌屬、棒孢酵母菌、古根菌屬、鐮刀菌屬、芽枝霉屬和被孢霉屬呈正相關(guān)。根據(jù)重要顯著差異揮發(fā)性風(fēng)味熱圖（圖2b）和真菌群落組成圖（圖5b）可知，芳樟醇、松油烯等7 種風(fēng)味組分和古根菌屬、鐮刀菌屬等6 個(gè)真菌屬在A、B 和C 中含量較高，推測其與石斛原料存在密切關(guān)聯(lián)，而彼此間具體聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。

圖5 細(xì)菌（a）和真菌（b）群落與環(huán)境因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of bacterial（a）and fungal（b）community and environmental factors

圖6 細(xì)菌（a）和真菌（b）群落與重要顯著差異風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between bacterial（a）and fungal（b）communities and important significantly different metabolites

3 結(jié)論

采用高通量測序技術(shù)結(jié)合HS-SPME/GC-MS分析石斛添加量對(duì)小曲微生物群落、理化特性和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DZ 優(yōu)勢細(xì)菌屬 為 uncultured_bacterium_o_Chloroplast、uncultured_bacterium_f_Mitochondria 和乳酸桿菌屬，優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬和曲霉菌屬。A、B 和C 中優(yōu)勢細(xì)菌屬為芽孢桿菌，優(yōu)勢真菌屬存在差異，主要為根霉菌屬、曲霉菌屬和威克漢姆酵母屬。添加石斛莖增大了小曲中芽孢桿菌和根霉菌等有益微生物含量。當(dāng)添加量為30%時(shí)，小曲有益細(xì)菌和真菌物種占比最大。與DZ 相比，石斛莖明顯增加了烴類、醇類、酚類和醛酮類化合物的種類和含量。小曲樣品不同理化特性間存在差異，添加30%石斛莖時(shí)提高了小曲糖化力、液化力、發(fā)酵力和酯化力等。相關(guān)性分析顯示，芽孢桿菌屬、根霉菌屬和威克漢姆酵母屬與糖化力、液化力、發(fā)酵力和酯化力，醇類、酚類和醛酮類物質(zhì)呈正相關(guān)。綜上，最終確定添加30%石斛莖時(shí)小曲品質(zhì)最好。同時(shí)要注意制曲過程的衛(wèi)生狀況，降低不可培養(yǎng)的細(xì)菌含量。