灘羊肉嫩度形成中Ca2+的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

姬琛，尤麗琴，劉吉娟，羅瑞明*

（1 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川750021 2 寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院 銀川 750021）

嫩度是衡量肉品品質(zhì)的重要指標(biāo)，貯藏過程中肉品嫩度的變化主要是由于內(nèi)源酶引起的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的水解[1]。鈣蛋白酶（Calpains）是公認(rèn)的結(jié)構(gòu)蛋白水解酶，鈣蛋白酶-1 參與大多數(shù)肌原纖維蛋白的降解過程，引起肌肉嫩度約70%的差異。細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶-1 的激活依賴于Ca2+濃度[2]，其被激活后可降解多種細(xì)胞骨架蛋白，如伴肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白T 和肌間線蛋白等。細(xì)胞凋亡酶（Caspases）被認(rèn)為在細(xì)胞骨架蛋白的降解中發(fā)揮重要作用[3-4]。Huang 等[3]和Ouali 等[4]研究表明細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 有助于弱化Z 盤和I 盤之間的連接，從而影響肉的嫩度。細(xì)胞凋亡酶的激活依賴于內(nèi)源性細(xì)胞凋亡引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，線粒體Ca2+超載是引起內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的重要原因。因此，宰后貯藏期間Ca2+的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用對肉品嫩度形成具有重要意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)分析為揭示肌肉轉(zhuǎn)化為肉所經(jīng)歷的分子修飾提供了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)[6]。Zuo 等[7]采用蛋白質(zhì)組學(xué)對不同保水性的牦牛肉進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肌球蛋白輕鏈、熱休克蛋白27 和磷酸丙糖異構(gòu)酶可作為牦牛肉持水能力的生物標(biāo)志物。Della等[8]采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究宰后成熟過程中馬不同部位肌肉蛋白質(zhì)的降解情況，發(fā)現(xiàn)半腱肌的水解程度更劇烈。LóPEZ-PEDROUSO 等[9]基于SWATH-MS 研究發(fā)現(xiàn)糖異生、糖酵解及三羧酸循環(huán)是影響牛肉嫩度的重要途徑。羅輝等[10]發(fā)現(xiàn)秦川牛肉貯藏過程中蛋白質(zhì)變化引起的能量代謝物變化，對肉品質(zhì)形成具有一定貢獻(xiàn)。李升升[11]研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制蛋白、SLC25A4、ZYX、LMOD1等可作為牦牛平滑肌嫩度的指示蛋白。然而，現(xiàn)有研究多為肉品嫩度生物標(biāo)志物鑒定，蛋白質(zhì)水平變化與肉品嫩度的關(guān)系，影響肉品嫩度形成的主要途徑等，缺乏關(guān)鍵信號(hào)因子Ca2+在嫩度形成中發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的研究。

本試驗(yàn)以6 月齡灘羊背最長肌為研究對象，測定其4 ℃貯藏0，96，192 h 時(shí)剪切力、線粒體Ca2+水平、鈣蛋白酶-1 活性及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3活性的變化情況，基于同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ）結(jié)合多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)研究貯藏過程中Ca2+信號(hào)通路及凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白質(zhì)表達(dá)量變化，確定Ca2+在灘羊肉嫩度形成方面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，為進(jìn)一步完善宰后肉品嫩度形成理論，改善灘羊肉嫩度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊背最長肌，寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司提供。

尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、IPG buffer、甲酸，美國GE Healthcare 公司；十二烷基磺酸鈉、三羧基氨基甲烷、三氯乙酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺，美國Amresco 公司；三乙二胺碳酸鹽和考馬斯亮藍(lán)G-250，美國Sigma 公司；胰蛋白酶，美國Promega 公司；乙腈、水，美國賽默飛世爾公司；甘露醇、EDTA、硝酸、濃鹽酸、濃硫酸（分析純），國藥集團(tuán)；Elisa 試劑盒，上?？婆d生物科技有限公司。未注明試劑均為色譜純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Sciex Triple TOF 5600 質(zhì)譜儀、Eksigent nano LC-1D 液相系統(tǒng)，美國SCIEX 公司；Image Scanner III 掃描儀，美國GE Healthcare 公司；iCE 3400 AAS 原子吸收光譜儀，美國賽默飛世爾公司；VCX130 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，美國Sonics 公司；C-LM40 嫩度儀，北京布拉德科技發(fā)展有限公司5910R 冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；真空冷凍干燥機(jī)，小垂直板電泳槽，美國伯樂公司。。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 采集宰后4 ℃，風(fēng)速3 m/s，相對濕度80%，成熟0，96，192 h 的灘羊背最長肌200 g，用于測定剪切力。采集不同成熟時(shí)間樣本各5 g，封裝于滅菌冷凍管中，置于-80 ℃冰箱備用，用于測定鈣蛋白酶-1 及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性。采集不同成熟時(shí)間樣本200 mg，封裝于滅菌冷凍管中，置于-80 ℃冰箱備用，用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析 參照李子欣等[12]的方法提取純化灘羊肉中蛋白質(zhì)，置于-80 ℃冰箱備用。參照尤麗琴等[13]的方法檢索并篩選差異蛋白質(zhì)。差異蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路注釋完成。

1.3.3 線粒體Ca2+含量的測定 參照王琳琳[14]的方法分離線粒體，測定其Ca2+含量。

1.3.4 鈣蛋白酶-1 及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性測定 采用Elisa 試劑盒，根據(jù)操作說明書分別測定鈣蛋白酶-1 活性及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性。

1.3.5 剪切力的測定 剪切力的測定采用Di Luca 等[15]的方法并稍作修改。剔除可見脂肪與結(jié)締組織，將樣品修整為5 cm×5 cm×5 cm 的塊狀，置于自封袋中，于80 ℃水浴鍋中煮制。待中心溫度到達(dá)70 ℃后取出樣品，室溫放置12 h 后用取樣器平行于肌纖維方向取直徑為1.27 cm 的肉柱，以1 mm/s 垂直于樣品剪切肉柱，測定其剪切力。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard Deviation，S.D.）表示。采用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、鄧肯多元方差檢驗(yàn)以及Pearson 相關(guān)性分析。P ＜0.05 的變量被認(rèn)為不同成熟時(shí)間之間存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 剪切力、線粒體Ca2+含量、鈣蛋白酶-1 活性及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性變化

表1 所示不同貯藏時(shí)間灘羊背最長肌剪切力、線粒體Ca2+含量、鈣蛋白酶-1 活性及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性變化情況。貯藏0 h 時(shí)，灘羊背最長肌剪切力為4.79 kgf；貯藏96 h 時(shí)，灘羊背最長肌剪切力顯著降低至3.17 kgf（P＜0.05）；貯藏192 h時(shí)，灘羊背最長肌剪切力顯著升至3.74 kgf（P＜0.05），說明適度的貯藏有助于改善灘羊肉嫩度，這與李文博等[16]的結(jié)論一致。0～96 h 內(nèi)剪切力降低，可能是由于構(gòu)成肌肉結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)在貯藏期間發(fā)生降解[17]。

表1 不同貯藏時(shí)間灘羊肉剪切力、線粒體鈣離子水平、鈣蛋白酶-1 活性及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性變化Table 1 Changes in shear force，content of mitochondria Ca2+，and activities of calpain-1 and caspase-3

線粒體Ca2+含量貯藏0 h 為2.23 mg/L，96 h顯著上升至2.52 mg/L（P＜0.05），192 h 時(shí)又降至2.20 mg/L（P＜0.05），表明0～96 h 內(nèi)灘羊肌細(xì)胞線粒體發(fā)生Ca2+超載，與王琳琳[14]的研究結(jié)果一致。Ca2+主要儲(chǔ)存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，正常的離子穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞生命活動(dòng)的基本條件，線粒體攝取生理性Ca2+信號(hào)調(diào)節(jié)有氧代謝，而宰后Ca2+超載會(huì)引起細(xì)胞程序性死亡，即細(xì)胞凋亡過程[4]。同時(shí)，Ca2+濃度可調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白水解酶鈣蛋白酶活性。

鈣蛋白酶-1 活性在整個(gè)貯藏期呈顯著降低趨勢（P＜0.05），96 h 時(shí)顯著降至初始值的14%，192 h 時(shí)顯著降至初始值的6%。大量研究表明，Ca2+濃度升高促使鈣蛋白酶活性增強(qiáng)，Ca2+濃度進(jìn)一步提高導(dǎo)致構(gòu)象變化而表現(xiàn)蛋白水解酶活性，是宰后貯藏初期細(xì)胞質(zhì)中主要的蛋白水解酶，在肌原纖維蛋白降解及肉品嫩度形成中發(fā)揮重要作用[4]。鈣蛋白酶-1 最適pH7.0 左右[22]，因此，除Ca2+外宰后肌肉pH 值的變化也影響鈣蛋白酶-1 活性，其活性下降可能與宰后初期細(xì)胞環(huán)境酸化有關(guān)。

細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性于貯藏期內(nèi)呈先升高后降低的趨勢，96 h 時(shí)顯著上升至初始值的130%（P＜0.05），192 h 時(shí)活性為初始值的116%（P＜0.05），表明線粒體Ca2+超載可能引起細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 被激活，且直至宰后192 h 其活性仍顯著高于初始活性。黃明等[23]證實(shí)細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 可體外降解結(jié)構(gòu)蛋白，參與肉品宰后的嫩化。

2.2 剪切力與線粒體Ca2+水平、鈣蛋白酶-1 活性及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性的相關(guān)性分析

表2 所示為剪切力與線粒體Ca2+水平、鈣蛋白酶-1 活性及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性的相關(guān)性分析。灘羊背最長肌剪切力與Ca2+水平呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與鈣蛋白酶-1 活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；鈣蛋白酶-1 活性與細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與Ca2+水平與無明顯相關(guān)性；細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性與Ca2+水平呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。鈣蛋白酶-1 活性不受Ca2+水平影響，可能是因?yàn)殁}蛋白酶-1 活性受細(xì)胞環(huán)境影響因素如pH 值、ATP 含量等較大。細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性受細(xì)胞凋亡因子的調(diào)控，線粒體Ca2+超載是促使CYTC 釋放至胞漿中的重要原因，在細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 激活過程中具有正向調(diào)控作用。鈣蛋白酶-1 與細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 均為水解肌原纖維的蛋白質(zhì)，肌原纖維蛋白質(zhì)降解由肌原纖維解裝配成肌絲啟始，大量研究表明鈣蛋白酶參與這一解裝配過程，因此，鈣蛋白酶-1 可能參與成熟初期肌原纖維蛋白的降解，而細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 在整個(gè)貯藏過程中均可水解肌原纖維。

表2 不同貯藏時(shí)間灘羊肉剪切力與線粒體鈣離子水平、鈣蛋白酶-1 及細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性相關(guān)性分析Table 2 Correlations between shear force and content of mitochondria Ca2+ and activities of calpain-1 and caspase-3

2.3 Ca2+信號(hào)通路及凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)的變化

為明確Ca2+在宰后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定Ca2+信號(hào)通路及凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白質(zhì)表達(dá)的變化情況，結(jié)果顯示：貯藏96 h 與0 h 對比，鑒定出7 個(gè)顯著差異蛋白質(zhì)富集于Ca2+信號(hào)通路，其中，5 個(gè)上調(diào)表達(dá)差異蛋白質(zhì)，2 個(gè)下調(diào)表達(dá)差異蛋白；192 h 與96 h 對比，鑒定出3 個(gè)顯著差異蛋白質(zhì)富集于Ca2+信號(hào)通路，均為下調(diào)表達(dá)差異蛋白質(zhì)（表3）。其中，ATP2A1即Ca2+-ATPase，主要催化ATP 的水解，并將Ca2+由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫，參與調(diào)節(jié)收縮/舒張周期[24]，其上調(diào)表達(dá)可能是因?yàn)閯?dòng)物屠宰后細(xì)胞環(huán)境及能量水平的改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子平衡被打破，引起大量離子交換，ATP2A1 試圖將Ca2+逆濃度梯度泵入鈣庫。VDAC1 與VDAC2 為電壓依賴性陰離子通道蛋白1 與2，是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的構(gòu)成部分[25]，調(diào)控mPTP 的開放，其表達(dá)量上調(diào)可能導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜不完整并引起mPTP 不可逆開放，線粒體Ca2+超載可能由此引起。SLC25A4 參與線粒體ADP/ATP 的轉(zhuǎn)移，PPP3CA 為鈣依賴性酶，在細(xì)胞內(nèi)Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。MYLK2 是一種鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的酶，與肌肉收縮相關(guān)[26]。不同貯藏期Ca2+信號(hào)通路的變化表明，屠宰后初期灘羊肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，Ca2+刺激下游一系列蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，引起不同時(shí)期肌細(xì)胞收縮、肌纖維降解等現(xiàn)象，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物屠宰后肌肉的嫩度。

表3 不同貯藏期Ca2+信號(hào)通路中富集的差異表達(dá)蛋白質(zhì)Table 3 The differentially abundant proteins enriched in Ca2+ signaling pathway at different storage periods

表4 所示凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白質(zhì)的變化。0～96 h 內(nèi)30 個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集于凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中，23 個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)，7 個(gè)下調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)。96～192 h 內(nèi)15 個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集于凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中6 個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)，9 個(gè)下調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)。凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集的差異蛋白質(zhì)表明，灘羊屠宰后受缺氧缺血信號(hào)的刺激，線粒體發(fā)生不可逆的損傷，線粒體復(fù)合體Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ表達(dá)量上調(diào)，試圖通過將NADH 轉(zhuǎn)換為NAD+與H+調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，降低合成反應(yīng)所引起的ATP 消耗，由此引起H+積累[27]，這可能是導(dǎo)致96 h 內(nèi)鈣蛋白酶-1 活性降低的重要原因之一。王霖[28]研究表明胞質(zhì)或線粒體Ca2+升高可能會(huì)破壞線粒體電子傳遞體，這與本研究結(jié)論一致。CYTC 在線粒體嵴突上與其它氧化酶排列成呼吸鏈，作為電子傳遞體之一參與有氧呼吸，在能量代謝調(diào)節(jié)中扮演重要角色，也是線粒體凋亡途徑的重要調(diào)控因子。CYTC 從線粒體釋放到胞漿中，會(huì)導(dǎo)致電子呼吸鏈的電子傳遞受阻，引發(fā)細(xì)胞能量供應(yīng)減少。VDAC1 與VDAC2 作為mPTP 蛋白，其上調(diào)表達(dá)可能為CYTC 釋放至胞漿中提供了渠道，由此啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[29]，激活細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3。Wang 等[30]研究表明，CYTC宰后初期從牦牛肌細(xì)胞線粒體釋放至胞漿中，最終激活細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3，并影響肌肉嫩度，而線粒體Ca2+超載是觸發(fā)CYTC 釋放的重要原因。CYTC 釋放及細(xì)胞色素C 氧化酶亞基II（COX2）下調(diào)表達(dá)，可能是引起宰后電子傳遞鏈解偶聯(lián)的主要原因。胞漿中CYTC 表達(dá)量上調(diào)引起的電子傳遞受阻，可能與宰后能量供給方式轉(zhuǎn)變有關(guān)。

表4 不同貯藏期凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中富集的顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)Table 4 The differentially abundant proteins enriched in apoptosis signal transduction pathways at different storage periods

不同貯藏時(shí)間顯著差異蛋白質(zhì)KEGG 數(shù)據(jù)庫映射的細(xì)胞凋亡通路（KEGG#04210）見圖1。貯藏初期，CYTC 由線粒體釋放至胞漿，引起胞漿中CYTC 表達(dá)量升高，由此可能導(dǎo)致凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性于96 h 時(shí)升高，與胞漿中CYTC 表達(dá)量升高有關(guān)。Ca2+由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放引起鈣蛋白酶表達(dá)量下調(diào)，而Ca2+濃度持續(xù)上升會(huì)引發(fā)鈣蛋白酶-1 自溶[31]，這可能是導(dǎo)致其表達(dá)量下調(diào)的主要原因。肌動(dòng)蛋白于貯藏初期表達(dá)量下調(diào)可能與肌動(dòng)球蛋白復(fù)合體形成有關(guān)[32]。真核翻譯起始因子2 亞基1 負(fù)責(zé)真核生物翻譯起始，其下調(diào)表達(dá)可能是因?yàn)樵缀蠹?xì)胞生命活動(dòng)與活體有區(qū)別所致，也可能是因?yàn)閯?dòng)物屠宰后蛋白質(zhì)的持續(xù)降解。大量研究表明，動(dòng)物屠宰后初期胞漿中CYTC表達(dá)量上升，本研究結(jié)果符合這一規(guī)律。貯藏96 h后，釋放至胞漿的CYTC 減少。王琳琳[14]研究表明牦牛宰后72 h 胞漿中CYTC 表達(dá)量顯著下降約60%。本研究中CYTC 變化趨勢與其一致。肌動(dòng)蛋白表達(dá)量上調(diào)可能與熱休克蛋白引起應(yīng)激防護(hù)作用有關(guān)。

圖1 不同貯藏時(shí)間灘羊肉中差異蛋白質(zhì)映射的細(xì)胞凋亡通路（KEGG#04210）Fig.1 Apoptosis of differential abundant proteins mapping in Tan Sheep meat at different storage period（KEGG#04210）

2.4 Ca2+的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用及其在嫩度形成中的貢獻(xiàn)

為進(jìn)一步闡明Ca2+的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，基于以上關(guān)鍵通路中富集到的差異蛋白質(zhì)，以KEGG pathway 為載體，繪制Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)核心網(wǎng)絡(luò)于圖2。由圖2 可知，SERCA 利用ATP 水解的能量驅(qū)動(dòng)Ca2+跨膜運(yùn)輸，mPTP 由多個(gè)電壓依賴性陰離子通道蛋白構(gòu)成，貯藏初期上調(diào)表達(dá)為Ca2+流入線粒體提供渠道，導(dǎo)致線粒體Ca2+超載、功能紊亂，使線粒體復(fù)合體表達(dá)量上升，NADH 轉(zhuǎn)化為NAD++H+，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)H+積累，而COX2 表達(dá)量下調(diào)促使電子傳遞鏈解偶聯(lián)，導(dǎo)致宰后細(xì)胞能量供給方式轉(zhuǎn)變；同時(shí)，mPTP 蛋白質(zhì)異常表達(dá)促使CYTC 釋放至胞漿中，可能引起細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因此激活細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3，水解結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，影響肉的嫩度。Ca2+可間接導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白表達(dá)量下調(diào)引起細(xì)胞收縮，從而影響肉的嫩度。另外，由Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)核心網(wǎng)絡(luò)圖可知，鈣蛋白酶與細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 可能在水解蛋白質(zhì)方面具有協(xié)同作用[33]。Huang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)牛骨骼肌中注射Ca2+時(shí)，細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性呈下降趨勢，可能是由于calpain的直接切割導(dǎo)致細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 失活。這一結(jié)果充分證明Ca2+在嫩度形成過程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，SERCA、CYTC、VDAC、COX2 等多個(gè)蛋白質(zhì)在其信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮重要作用。

圖2 灘羊肉宰后嫩度形成中Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)核心網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Core network of calcium signal transduction in postmortem tenderization of Tan sheep meat

3 結(jié)論

灘羊肉4℃貯藏期間剪切力先降低后升高，96 h 時(shí)降至最低。線粒體Ca2+含量于宰后96 h 內(nèi)顯著升高，隨后降低，鈣蛋白酶-1 活性在貯藏期內(nèi)持續(xù)降低，細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性于0～96 h 顯著上升，96～192 h 有所下降。Pearson 相關(guān)性分析表明灘羊背最長肌剪切力與Ca2+水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與鈣蛋白酶-1 活性呈極顯著正相關(guān)，與細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，0～96 h 內(nèi)5 個(gè)顯著上調(diào)差異蛋白質(zhì)與2 個(gè)顯著下調(diào)差異蛋白質(zhì)富集于Ca2+信號(hào)通路，96～192 h 內(nèi)3 個(gè)顯著下調(diào)的差異蛋白質(zhì)富集于Ca2+信號(hào)通路；0～96 h 內(nèi)30 個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集于凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，96～192 h 內(nèi)15個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集于凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。SERCA 利用ATP 水解的能量驅(qū)動(dòng)Ca2+跨膜運(yùn)輸，mPTP 蛋白質(zhì)VDAC 貯藏初期上調(diào)表達(dá)為Ca2+流入線粒體提供渠道，導(dǎo)致線粒體Ca2+超載、線粒體功能紊亂，致線粒體復(fù)合體表達(dá)量上升；同時(shí)，mPTP 蛋白質(zhì)異常表達(dá)促使CYTC 釋放至胞漿中，最終激活細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶-3，水解結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)影響肉的嫩度。另外，Ca2+可間接促使肌動(dòng)蛋白表達(dá)量下調(diào)引起細(xì)胞收縮，從而影響肉的嫩度。本研究結(jié)論證實(shí)了Ca2+在肉品嫩度形成過程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。